Name: 全身细菌感染与免疫防御的表型果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习使用纳米注射器或无菌针刺法对黑腹果蝇进行细菌感染，并通过测定细菌负荷和抗菌肽基因表达来量化宿主免疫反应。该方法为研究昆虫先天免疫提供了可靠框架。

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我们感谢Lazzaro实验室全体成员，特别是Susan Rottschaefer，在审阅和测试这些实验方案过程中提供的帮助。本成果凝聚了他们的集体专业经验。Lazzaro实验室的工作得到了美国国立卫生研究院资助项目R01 AI083932和R01 AI064950的支持。

1. 收集&#160;并准备&#160;果蝇
<ol>
	<li>在所需的实验条件下饲养D. melanogaster。饲养过程中注意避免果蝇过度拥挤，并确保各处理组间的幼虫密度保持一致，因为幼虫阶段的环境条件会显著影响成虫阶段的免疫防御表型。15</li>
	<li>在羽化后0 -&#160;3天内收集实验用果蝇，并将其转移至新鲜培养基中。</li>
	<li>将收集的果蝇置于适宜温度下（通常22 °C至28 °C之间较为合适），饲养至羽化后5 - 7天龄。 
	注：此阶段足以使果蝇完成变态发育并达到性成熟，但仍处于衰老开始之前。</li>
	<li>在感染前将所需数量的果蝇分选至另一独立小瓶中，同样需注意避免过度拥挤。 
	注：本演示中仅感染雄性果蝇&#160;，但使用所述方法同样可对雌性果蝇进行感染。</li>
</ol>
2. 培养&#160;并准备&#160;细菌
<ol>
	<li>在感染前至少 2 天制备所选细菌的主培养板。从长期保存于 -80 °C 的 15% 甘油菌种中划线接种细菌。主培养板可在 4 °C 保存最多 2 周。始终直接从冷冻甘油菌种划线制备主培养板。避免将细菌在平板之间连续传代，因为反复培养可能导致细菌进化出毒力减弱的表型。 
	注意：本示例使用 Providencia rettgeri 和 Escherichia coli。</li>
	<li>使用以下步骤制备用于注射的细菌悬液。
	<ol>
		<li>从主培养板上挑取单菌落接种至无菌培养基中，培养 2 ml 细菌培养物。将细菌培养至稳定期（例如，在 37 °C 下过夜培养）。 
		注意：P. rettgeri 和 E. coli 均可在 20–37 °C 条件下于 LB 培养基中，在轻度振荡下良好生长。</li>
		<li>当培养物达到稳定期后，在台式离心机中以约 600 µl&#160;培养液轻柔离心收集菌体（5,000 × g，3 分钟），弃去上清液，并将菌体重悬于约 1,000 µl&#160;无菌磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2PO4，1.8 mM KH2PO4，pH = 7.4）中。</li>
		<li>用无菌 PBS 稀释重悬的菌液，调整至所用细菌适宜的光密度（OD），使用分光光度计测定其在 600 nm 处的吸光度。使用该菌悬液感染果蝇。 
		注意：A600 = 0.1 或 1.0 分别对应每毫升约 108 和 109 个 Providencia rettgeri 或 E. coli。由于活菌和死菌均对光密度有贡献，因此应在细菌稳定期早期收获培养物，避免细菌残体积累，从而防止光密度与感染时引入的活菌数量之间的关系发生偏差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 感染果蝇
注意：由于黑腹果蝇（Drosophila）的免疫反应受昼夜节律影响，因此在不同实验重复中应在一天中的相近时间进行感染操作。16
3.1）使用纳升注射仪
<ol>
	<li>准备用于感染的玻璃针。
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管，制备玻璃针。</li>
		<li>用镊子折断针尖，形成直径约 50 µm 的开口，以便液体排出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装注射器。
	<ol>
		<li>将密封O型圈和白色垫片（大凹面朝外）依次套在金属推杆上。</li>
		<li>使用带有30 G针头的注射器将矿物油注入玻璃针中。</li>
		<li>将装有矿物油的玻璃针穿过卡套，并将较大的O型圈套在针基部，距离针的钝端约1 mm处。</li>
		<li>将针滑入金属推杆，并轻轻旋紧卡套直至固定。</li>
		<li>从注射器中排出大部分矿物油，但需确保针内仍保留少量矿物油，作为注射器与细菌悬液之间的屏障。确保矿物油、细菌悬液内部以及两液体之间均无气泡。</li>
		<li>将注射器设定为所需的注射体积（介于9 nl至50 nl之间）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备&#160;损伤对照。
	<ol>
		<li>通过将毛细针尖小心插入含有培养基的离心管中，并按下注射器上的“填充”按钮，将无菌PBS注入注射针内。 
		注：如果实验要求将细菌悬浮于其生长培养基中进行注射，则也可使用无菌细菌生长培养基作为损伤对照。但由于细菌生长培养基含有可刺激免疫系统或对宿主产生其他影响的成分，因此优先选用PBS等惰性载体作为对照。</li>
		<li>在轻柔的CO2气流下麻醉所需数量的果蝇。</li>
		<li>在果蝇腹侧前腹部进行注射，注入无菌PBS。 
		注：也可选择其他注射位点（如胸部的胸侧板），但在同一实验中应保持注射位点一致。17</li>
		<li>将注射后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直至所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在食物上。 
		注：建议先对PBS对照组果蝇进行注射，再对实验组果蝇注射细菌，以便两种处理使用同一根针。但并非总能在整个实验中使用同一根针。若需更换针头，建议记录每根针所使用的果蝇，并在统计分析中将针头编号作为实验因素予以考虑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射&#160;细菌病原体。
	<ol>
		<li>排出注射器中残留的无菌培养基，并用同一根针重新吸入细菌悬液。</li>
		<li>重复上述步骤（3.1.3），此次将步骤2.2中制备的细菌悬液注射入果蝇体内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.2）采用脓毒症针刺法
<ol>
	<li>准备用于刺破的针具。
	<ol>
		<li>将200 µl&#160;微量移液器吸头的末端熔化，并将一根0.15 mm的昆虫细针插入熔融的塑料中。待塑料凝固，使针固定在塑料中，且约有0.5 cm的针尖从塑料中伸出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立&#160;损伤对照组。
	<ol>
		<li>在轻微的CO2气流下麻醉所需数量的果蝇。</li>
		<li>用针具刺破果蝇胸部的胸侧板，避免刺入翅和足的附着部位。如有必要，使用柔软的镊子轻轻将果蝇从细针上取下。 
		注意：也可选择其他部位进行刺破，例如腹前部的腹外侧表面，但在同一实验中必须保持刺破位点的一致性17。穿过腹部体壁的刺破操作通常比胸部刺破更困难，因此较少采用。</li>
		<li>将刺破后的果蝇放入装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直至所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在培养基上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引入&#160;细菌感染。
	<ol>
		<li>在轻微的CO2气流下麻醉所需数量的果蝇。</li>
		<li>在与培养基对照组相同的位置刺破每只果蝇，每次刺破前将针尖浸入步骤2.2中制备的细菌悬液中。</li>
		<li>将刺破后的果蝇放入装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直至所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在培养基上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3.3）评估&#160;的&#160;感染剂量递送
<ol>
	<li>按照上述3.1或3.2步骤感染一组果蝇，但不再将果蝇放回食物小瓶中从麻醉状态恢复，而是将每只果蝇置于预冷的微量离心管中，并放置在冰上。</li>
	<li>加入 250 µl&#160;向每管加入 PBS，使用研杵或珠磨机匀浆果蝇。</li>
	<li>将匀浆液接种到LB琼脂平板上，可使用螺旋接种仪或梯度稀释法。
	<ol>
		<li>采用连续稀释法进行接种时，将每份果蝇匀浆液转移至96孔板的第一排。</li>
		<li>向剩余各列的每个孔中加入 90 µl&#160;PBS溶液。</li>
		<li>使用多通道移液器，吸取 10 µl&#160;从含有果蝇匀浆的第一排移取并分装至第二排。</li>
		<li>上下吹打至少10次以充分混匀，然后取10 µl&#160;转移到第三行。使用剩余的行重复此步骤。</li>
		<li>从最底部一行（细菌悬液稀释度最高）开始，使用多通道移液器吸取10 µl&#160;从每个孔中取出样品并点种到LB平板上，注意将样品点成互不接触的独立斑点。重复此操作，直至每行所有孔的样品均被点种完毕，并按照稀释度从高到低的顺序在LB平板上依次点样。&#160;</li>
		<li>将培养板置于室温下&#160;直到斑点完全渗入LB平板。 
		注意：建议在使用前于室温下将 LB 平板干燥数天，以确保液体能够迅速被吸收，从而最大限度地减少样品点之间意外接触的可能性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将平板在过夜（O/N）条件下孵育，注意避免过度培养，以确保菌落保持细小且分离。 
	注意：根据所使用的细菌培养基和培养温度，源自果蝇内源性肠道微生物群的菌落最终可能会在平板上出现。然而，在37 °C的LB琼脂培养基上，用于致病感染的大多数细菌比肠道微生物群生长更快。</li>
	<li>从培养箱中取出平板，当实验用细菌达到指定状态时&#160;可见菌落生长（通常为 8 - 12 小时），但在此之前 果蝇 肠道微生物群落出现（约36小时）。&#160; 对于生长缓慢的实验细菌，可在LB琼脂中添加选择性抗生素，以消除肠道微生物群产生的菌落。</li>
	<li>统计每份匀浆液中的菌落数量。
	<ol>
		<li>对于螺旋平板，使用能够估算每毫升细菌载量的自动菌落计数器对生长的菌落进行计数&#160;根据平板上菌落数量和位置来确定匀浆液中的菌落情况。 
		注意：当细菌浓度在5 x 10^5 范围内时，螺旋计数最为准确。&#160;102 至 5 × 104 每毫升细菌数</li>
		<li>对于点平板，手动计数每只果蝇在菌落数为30–300的稀释度下的菌落，并计算每毫升的细菌数量&#160;原始匀浆的</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 感染后存活率的表征
<ol>
	<li>检测&#160;注射后的死亡率
	<ol>
		<li>将感染的果蝇和受伤的对照组放入新的培养管中，并在所需温度下（推荐25 °C，12:12光:暗循环）置于培养箱中培养。每管果蝇数量不超过15只&#160;因为当活蝇数量超过15只时，计数将变得困难。</li>
		<li>每天统计一次活蝇和死蝇的数量，或根据需要更频繁地进行统计。</li>
		<li>为保持食物质量，需定期将果蝇转移至新鲜培养基。
		<ol>
			<li>若试管中仅含有雄性，每三天将其转移至新的试管；若试管中含有雌性，则每两天转移一次，因为子代幼虫会液化培养基，增加成虫被困的风险，从而导致因感染引起的死亡率被高估。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>统计分析&#160;数据。
	<ol>
		<li>以 Kaplan-Meier 曲线绘制生存率，该曲线表示个体在注射后存活至某一测定时间点的概率。18 对于不相交的生存曲线，使用Log-Rank检验（又称Mantel-Cox检验）进行两两比较，或使用Cox比例风险模型进行更复杂的分析，后者可纳入多个因素及其交互作用。对于相交的生存曲线，应进行分层Cox分析。17</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 检测感染后细菌载量
<ol>
	<li>测量&#160;细菌载量
	<ol>
		<li>在注射后预定时间点，重复用于评估感染剂量的实验步骤，以测定感染过程中细菌载量（参见方案3.3）。 
		注意：若使用螺旋接种仪，需将匀浆液稀释，使细菌悬液浓度处于每毫升1,000 - 100,000个细菌的范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析&#160;数据。
	<ol>
		<li>如果细菌载量不符合正态分布，可对数据进行转换以使其更接近正态分布，或采用非参数统计分析方法对数据进行分析例如 Mann-Whitney U 检验）。使用 Box-Cox 分析确定最优变换方法；自然对数或以 10 为底的对数变换通常有效。19</li>
		<li>如果数据呈足够正态分布，且仅对比两种处理，则进行 t- 检验两种处理是否导致不同的平均细菌载量。若存在多个实验变量或其他潜在的预测因素，应使用方差分析（ANOVA）来确定哪些因素是细菌载量的显著预测因子。19</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 检测&#160;免疫系统基因的转录激活
<ol>
	<li>为粗略观察感染后的免疫激活情况，按照先前所述方法，用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因果蝇进行感染，其中GFP由抗菌肽基因启动子驱动表达。18</li>
	<li>在具备荧光功能的显微镜下观察感染的果蝇；感染后6至10小时内，脂肪体中的GFP诱导应可见。</li>
	<li>为更精确地量化免疫激活水平，可使用cDNA模板进行定量PCR（qRT-PCR），以检测抗菌肽基因转录本的丰度。 
	注意：免疫基因的表达可在感染后（或感染前）的任意时间点进行检测。一般而言，免疫基因表达的诱导约在注射后4小时开始，并在随后的24小时内逐渐增强。
	<ol>
		<li>使用 CO 麻醉果蝇2.</li>
		<li>每次RNA提取取15只果蝇放入微量离心管中。 
		注意：建议每种处理条件下至少收集三个重复样本。</li>
		<li>从果蝇中提取RNA，并使用多种标准方法或商业试剂盒中的任意一种生成第一链cDNA。将RNA在-80 °C下保存，将cDNA在-20 °C下保存数周&#160;-80 °C下长期保存。RNA提取前，将果蝇保存于-80 °C。</li>
		<li>以cDNA为模板，对目标基因进行定量PCR（qPCR）检测。参考 表1 用于扩增抗菌肽基因的引物序列 Diptericin A, Drosomycin, 防御素, Attacin A，以及 Metchnikowin 以及持家基因对照 rp49 （也称为 rpL32). 
		注意：编码抗菌肽的基因 Diptericin A 和 Drosomycin 提供非常良好的读数 D. melanogaster 分别主要通过Imd和Toll通路诱导的免疫活性。为控制样本间RNA产量差异及逆转录效率变化，需将目标基因的记录表达量标准化至一个参考管家基因，该管家基因的表达预期不受感染影响，例如 rp49 （也称为 rpL32).</li>
		<li>分析数据。
		<ol>
			<li>为粗略估算表达差异，计算检测基因获得的起始量（SQ）值与例如, Diptericin A）相对于参考基因所得 SQ 值的比值例如, rp49) 每个样本（计算公式为 SQ-DptA/SQ-rp49）。将这些比例调整至基线对照处理&#160;例如未感染的对照组。将对照组的表达水平任意设定为1.0，并以相对倍数变化的形式展示实验处理组的结果。根据已知浓度cDNA梯度稀释系列生成的标准曲线，估算每个基因的SQ值。 
			注意：对比例进行统计分析可能较为复杂，因此该方法更适合快速估算，而不适用于严格分析。如果PCR效率较低，应尽可能重新设计引物以改善PCR动力学。对于具有接近完美效率（每个循环PCR产物倍增）的qPCR反应，阈值循环（CT）可替代SQ值。</li>
			<li>对于扩增效率理想的简单实验，可使用 ΔΔCT 方法19 对于每个样本，从C值中减去T 参考基因的值（例如, rp49）来自 CT 待测基因的例如., Diptericin A) 以得到 ΔCT. 然后从 ΔCT ΔC 的基线对照T 为每个实验样本提供 ΔΔCT 每个样本的值；该 ΔΔCT 表示不同处理间基因表达水平的相对差异，其中 2(-ΔΔCT) 近似于表达水平的变化倍数。 
			注意：如果目的基因或参照基因的 PCR 扩增效率较低，该分析可能会严重低估或高估目标基因表达的倍数变化。</li>
			<li>为获得最严格的分析结果，使用待测基因的估计表达量进行方差分析（ANOVA）例如&#160;Diptericin A) 作为响应变量，并估计对照基因的表达量（例如&#160;rp49）及其他实验因素作为解释变量。 
			注意：该方法对PCR扩增效率的不足具有相对较强的耐受性，且可适用于更复杂的实验设计分析。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kuo, T. -H., Handa, A., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+the+immune+response+and+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of the immune response and sleep in Drosophila.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (70), e4355(2012).</li>
<li>Vodovar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+host+defense+after+oral+infection+by+an+entomopathogenic+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (32), 11414-11419 (2005).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS pathogens. 3 (11), e173(2007).</li>
<li>Jaenike, J., Polak, M., Fiskin, A., Helou, M., Minhas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+transmission+of+endosymbiotic+Spiroplasma+by+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Interspecific transmission of endosymbiotic Spiroplasma by mites.</a> Biology. 3 (1), 23-25 (2007).</li>
<li>Kanbar, G., Engels, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+bacterial+infection+of+wounds+in+honey+bee+%28+Apis+mellifera%29+pupae+punctured+by+Varroa+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and bacterial infection of wounds in honey bee ( Apis mellifera) pupae punctured by Varroa mites.</a> Parasitology research. 90 (5), 349-354 (2003).</li>
</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

本文所述方法可实现对Drosophila melanogaster的严格且高质量的感染。示例主要聚焦于Providencia rettgeri和E. coli的感染，但该实验方案具有高度可调性，可适用于多种细菌感染，并可在多种宿主饲养与维持条件下应用。
最佳实验方案的具体细节取决于所使用的感染细菌、宿主的基因型以及整体实验条件。在开展更复杂的项目之前，强烈建议对任何新的实验条件进行预实验。一个良好的起点是测试跨越100倍范围的三个感染剂量。对于高毒力病原体，通常最好采用非常低的感染剂量，大约每只果蝇10至100个细菌细胞。中等毒力的病原体可采用较高剂量，约为每只果蝇1,000个细菌；而非病原体则可使用高达每只果蝇10,000个细菌的剂量进行注射。通过在纵向时间序列中追踪病原体载量、宿主死亡率以及免疫系统活性，通常有助于明确新型感染的动力学特征。由于病原体载量和宿主基因表达的测定属于破坏性检测，因此必须在实验开始时即为每个待测时间点分别感染不同的果蝇。
在决定使用针刺法还是微毛细管注射法时，需要注意每种方法都有其优势和局限性。毛细管注射会将一定体积的液体注入果蝇体内，这不仅会适度增加膨压，还会引入悬浮或溶解在载体中的盐类或其他分子。此外，毛细管注射需要具备注射设备或购买相关仪器。而无菌针刺法则无需特殊设备，且注入果蝇体内的介质可忽略不计，通常在感染大量果蝇时效率更高。然而，针刺感染无法像毛细管注射那样精确控制感染剂量。本实验方案主要介绍一种通过机械方式调控注射体积的注射装置，但也存在基于加压空气脉冲的注射系统20,21。这类系统通常比本文所述装置更昂贵，并且需要针对每根针头校准空气脉冲，以确保注射体积的一致性。
关于在自然环境中果蝇如何发生全身性细菌感染，目前存在相当多的争议，但相关数据极为有限。一些研究者认为，大多数自然感染发生在 果蝇 摄入致病菌&#160;随后细菌能够逃逸出肠道&#160;建立全身性感染。然而，已知能够穿过肠道的细菌非常少 D. melanogaster，而具有这种能力的对果蝇具有高度致死性22,23另一种理论认为，果蝇在逃避捕食者未遂或受到外寄生螨攻击时，会经常遭受体壁损伤。该假说得到了野外频繁采集到此类受伤个体的支持 D. melanogaster 带有黑色素沉积斑点，表明曾有愈合的伤口（未发表观察结果）。已有研究表明，螨类可传播细菌感染 果蝇24 蜂螨造成的伤口可能继发细菌感染25然而，螨虫传播或其他机会性感染在自然界中的发生频率 D. melanogaster 通过表皮破损侵入血淋巴的机制尚不明确。本文所述方案通过定量注射将细菌直接引入血淋巴，从而绕过任何上皮屏障或行为免疫机制。用于向昆虫喂食致病菌的方法 D. melanogaster 已在 Vodovar 中描述 等22 和 Nehme 等23.
许多昆虫病原细菌对人类健康几乎不构成或完全不构成风险，使研究人员能够安全地进行操作。此外，极少有细菌能够在未经实验干预的情况下通过接触感染Drosophila，因此通过污染表面或逃逸果蝇在实验室中造成细菌感染“流行”传播的风险通常非常低。尽管如此，仍建议采取充分的 containment 措施，防止感染的果蝇逃逸，并对任何逃逸的果蝇进行重新捕获。实验室的生物安全等级应与所使用的病原体相匹配，并应遵循微生物学中的标准最佳实践操作。
本文所述的实验性感染方法可用于以任意剂量的任意细菌感染黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。一旦建立感染，即可方便地检测细菌增殖或清除的动力学过程、监测宿主死亡率，并检测宿主免疫系统的激活情况。感染后的果蝇还可轻松进行其他表型分析，包括可能受感染影响或影响感染进程的生理功能检测。所描述的操作流程成本低廉，所需专用设备较少，且易于掌握，因此适用于各类科研和教学实验室中的多样化研究项目。

果蝇 黑腹果蝇 是研究免疫防御功能与进化的首选模式生物之一。 果蝇 价格低廉且易于饲养，适合进行实验操作，并有庞大的科学社群支持，已开发出丰富的研究工具。昆虫与哺乳动物在先天免疫的多个方面具有保守性，包括由Toll样受体和NF-kB家族转录因子介导的信号转导、JAK/STAT信号通路以及JNK通路应答。1,2 这些基因和通路的功能可以被查询 D. melanogaster 利用突变或RNAi敲低来增强或抑制通路活性。3–6 此外， 果蝇 可用于研究感染和疾病带来的生理后果，包括在进化生活史理论背景下的相关研究。7–9 然而，所有此类研究都依赖于在明确的处理条件下可靠地感染实验果蝇的能力。本文所述方法提供了一个可实现稳定且可重复的细菌感染的技术框架 黑腹果蝇 随后测量感染严重程度并量化宿主免疫反应。
Drosophila 可被多种寄生虫和病原体自然或实验性感染，包括细菌、真菌、病毒、线虫以及寄生性黄蜂。本实验方案重点在于建立系统性细菌感染。可用于感染果蝇的细菌种类繁多，实验者应根据具体科学问题选择合适的菌种。例如，可选用人类临床分离株来研究细菌毒力机制10，或选用生态相关分离株进行进化研究11。某些细菌是D. melanogaster的有效病原体，感染后可在宿主体内增殖，导致宿主发病或死亡；而另一些细菌则能被宿主免疫系统有效控制，并在数天内被清除。在本实验中，将使用Providencia rettgeri作为可在宿主体内增殖、引起宿主死亡并在存活个体中持续存在的病原菌；同时使用Escherichia coli作为非致病菌，该菌可被宿主免疫系统清除。
通过将细菌直接注入果蝇的体腔来建立感染。该方法绕过了上皮屏障和保护性行为，使得能够独立于自然传播途径来研究全身性感染。实验上建立全身性感染主要有两种方法。第一种方法是使用纳米注射仪和拉制的玻璃毛细管针头，将精确数量的细菌注入果蝇体内。该方法的优点在于可实现较宽的感染剂量动态范围，并且具有高度的定量重复性。第二种方法是通过无菌针刺感染。该方法的优点是操作快速，且无需特殊设备。一旦建立感染，即可检测全身病原菌载量、宿主死亡率以及可诱导的免疫系统活性。当然，在感染的D. melanogaster中，理论上还可测量多种其他表型，包括感染后的繁殖力12、学习能力13、代谢状态14，或几乎任何其他可设想的性状。

<table><tbody><tr><td>培养箱</td><td>Powers Scientific, Inc</td><td>DROS52SD</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 果蝇培养垫</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>CD FG50</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养基混合物&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 oz 方底瓶，聚丙烯材质</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>非无菌超大号棉球</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-882</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管，聚苯乙烯材质</td><td>VWR international</td><td>89092-720</td><td></td></tr><tr><td>非无菌大号棉游戏副本</td><td>Fisher brand</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>2 L 锥形瓶</td><td>VWR international</td><td>89000-370</td><td></td></tr><tr><td>带透明盖的培养皿，带凸起环；100 × 15 mm</td><td>VWR international</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂，Miller 配方</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>VWR international</td><td>80094-488</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Clasic 移液器，多种规格&lt;br/&gt; 0.1 &amp;micro;l 至 2 &amp;micro;l，&lt;br/&gt; 2 &amp;micro;l 至 20 &amp;micro;l，&lt;br/&gt; 20 &amp;micro;l 至 200 &amp;micro;l，&lt;br/&gt; 100 &amp;micro;l 至 1,000 &amp;micro;l</td><td>Rainin</td><td>PR-2&lt;br/&gt; PR-20&lt;br/&gt; PR-200&lt;br/&gt; PR-1000</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（多种规格）</td><td>VWR international</td><td>30128-376&lt;br/&gt; 53503-810&lt;br/&gt; 16466-008</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤基础，Miller 配方</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养管，硼硅酸盐玻璃材质</td><td>VWR international</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>S-500 轨道摇床</td><td>VWR international</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>VWR international</td><td>37001-300</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 10X</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 分光光度计</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>半微量比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>垂直毛细管拉制仪</td><td>Kopf Needle Pipette Puller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanojet II 用 3.5'' 替换玻璃毛细管</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Sientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>矿物油，白色，轻质</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6358-10</td><td></td></tr><tr><td>Minutein 固定针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml&amp;nbsp; 微量离心管；Seal Rite</td><td>USA Scientific Inc.</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>电动研钵；Talboys 实验室搅拌器</td><td>Troemner</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>Talboys 高通量匀浆器</td><td>OPS Diagnostics</td><td>930145</td><td></td></tr><tr><td>5/32'' 研磨球</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 156-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 涡旋振荡器</td><td>Scientific indurstries inc.</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（10 &amp;mu;l - 300 &amp;mu;l）</td><td>Sartorius</td><td>730360</td><td></td></tr><tr><td>WASP2 Whitley 自动螺旋涂布仪</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProtoCOL 自动菌落计数器 / 平板计数器 / 平板读取仪&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 管；低轮廓 0.2 ml 8联管</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 盖；光学平盖 8联盖</td><td>Bio-Rad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 无 RNase DNase</td><td>Promega</td><td>m610a</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 逆转录酶</td><td>Promega</td><td>m170b</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1240</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸-dT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;SsoAdvanced SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5260</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5200</td><td></td></tr><tr><td>RNasin 核糖核酸酶抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2115</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster 中的系统性细菌感染与免疫防御表型

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

果蝇 黑腹果蝇 是研究免疫防御功能与进化的首选模式生物之一。昆虫与哺乳动物在先天免疫的多个方面具有保守性，且由于 果蝇 能够轻松进行遗传和实验操作，果蝇在研究免疫系统功能及疾病生理后果方面具有强大优势。本文演示的方法通过将细菌直接注入果蝇体腔，使其感染，从而绕过上皮屏障及其他较为被动的防御机制，便于专注于系统性感染的研究。该实验流程包含宿主死亡率、系统性病原体载量以及宿主免疫系统诱导程度的测定方案。该感染方法成本低廉、操作稳健且具有定量可重复性，可用于功能遗传学、进化生活史及生理学研究。

本部分展示了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）细菌感染后可获得的实验结果。图1显示，感染剂量随用于注射的细菌悬液的光密度而变化，并且可通过注射后立即研磨并接种果蝇来可靠地估算实际递送的剂量。如图2所示，不同病原体可引起不同程度的宿主死亡率（图2A），且宿主死亡率可能具有剂量依赖性（图2B）。重要的是，本方案可实现不同类型的感染：Providencia rettgeri 可引起持续20天或更长时间的慢性、亚致死性感染（图3A）；而其他细菌如Escherichia coli则大多在感染后六小时内被宿主果蝇清除（图3B）。免疫系统的激活可通过RNA提取及后续针对抗菌肽转录本的qRT-PCR进行评估（图4A和B）。类似地，但定量性较低的方法是，利用在抗菌肽基因启动子控制下表达GFP的果蝇来可视化观察免疫系统的激活情况（图4C）。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig1.jpg" /> 
图1：确定感染剂量。 果蝇被注射了50 nl&#160;不同光密度（0.0001 - 0.05）的细菌悬液。注射后立即对果蝇进行匀浆并涂板，以确定注射引入的细菌数量。初始细菌载量与注射时的初始光密度高度相关（r2 = 0.96）
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig2.jpg" /> 
图2：注射细菌病原体后的存活情况。 对5至7日龄的雄性果蝇注射50 nl&#160;的细菌悬液或无菌培养基，并监测其存活率。(A) 野生型果蝇被注射了来自三种不同物种中每一种的大约5,000个细菌。宿主死亡率高度依赖于用于感染的细菌种类。(B) 野生型果蝇被注射了三种不同剂量的Enterococcous faecalis——每只果蝇50、500和5,000个细菌。当感染剂量更高时，果蝇死亡更快。(C) 一个免疫系统突变体及其野生型同基因型对照品系被注射了大约500个Burkholderia cepacia。成对Log-Rank比较显示，野生型果蝇对感染的存活显著优于突变体（χ2&#160; = 59.02，df = 1，p &#60;0.0001）。
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig3.jpg" /> 
图3：注射后的细菌载量。 果蝇分别被注射约（A）5,000 个 P. rettgeri 和（B）3,400 个 E. coli。在注射后立即及随后多个时间点测定细菌载量。每个数据点代表一只果蝇体内的细菌载量。E. coli 在受感染宿主中被迅速清除，而 P. rettgeri 则在宿主余下的生命周期中持续存在。
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52613/52613fig4.jpg" /> 
图4：注射后免疫基因表达的诱导. (A果蝇被注射了 50 nl&#160;的 P. rettgeri 或在腹部或胸部注入无菌 PBS， 或除CO外未进行任何处理2 麻醉。感染后6小时，收集果蝇用于RNA提取及表达分析 Diptericin A 采用qRT-PCR检测基因表达水平。A表达水平以比值形式绘制成图 Diptericin A 转录为 rp49 转录并缩放，使得 CO2 对照组定义为表达水平为1。各柱状图表示每种条件下比值的均值及标准误（n = 4）。(B) 表达水平以 2&#916;&#916;计算机断层扫描 与平均 CT CO 的数值2 麻醉处理的对照果蝇用作标准的未诱导状态。柱状图表示均值和标准误 &#916;&#916;CT 来自每种条件（n = 4）。尽管由于注射位点不同在转录诱导上无差异，但通过比较图A和图B可看出 &#916;&#916;CT 该方法可能会高估诱导水平。C) 在特定调控元件控制下表达 GFP 的果蝇 Diptericin A 启动子被注射了 50 nl&#160;的 P. rettgeri （OD = 0.1），7天后进行成像。GFP图示显示感染果蝇腹部脂肪体中GFP的表达，表明该通路被激活 Diptericin A 在细菌感染的果蝇中具有启动子活性，但在培养基注射的对照组中无此活性。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因</td>
			<td>正向引物</td>
			<td>反向引物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rp49 (也称为 rpL32)</td>
			<td>5’ AGGCCCAAGATCGTGAAGAA 3’</td>
			<td>5’ GACGCACTCTGTTGTCGATACC 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diptericin A</td>
			<td>5’ GCGGCGATGGTTTTGG 3’</td>
			<td>5’ CGCTGGTCCACACCTTCTG 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosomycin</td>
			<td>5’ CTGCCTGTCCGGAAGATACAA 3’</td>
			<td>5’ TCCCTCCTCCTTGCACACA 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defensin </td>
			<td>5’ GAGGATCATGTCCTGGTGCAT 3’</td>
			<td>5’ TCGCTTCTGGCGGCTATG 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attacin A</td>
			<td>5’ CGTTTGGATCTGACCAAGG 3’</td>
			<td>5’ AAAGTTCCGCCAGGTGTGAC 3’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metchnikowan</td>
			<td>5’ AACTTAATCTTGGAGCGATTTTTCTG 3’</td>
			<td>5’ ACGGCCTCGTATCGAAAATG 3’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： qRT-PCR引物序列。

Drosophila melanogaster 是研究先天免疫系统以及感染与疾病生理后果的优秀模式生物。本方案描述了如何对 D. melanogaster 实施强度可靠且定量可重复的细菌感染，以及如何随后评估感染严重程度并量化宿主免疫反应。

Drosophila Melanogaster 中的系统性细菌感染与免疫防御表型

果蝇黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是研究免疫防御功能与进化的首选模式生物之一。许多方面的……

本实验的总体目标是对黑腹果蝇（drosophila, melanogaster）建立稳定且可重复的细菌感染模型，随后评估感染严重程度并量化宿主免疫反应。首先使用纳米注射器将细菌感染递送至果蝇体内。感染后可随时间推移监测果蝇的死亡率，并可在任意时间点通过匀浆化感染果蝇并测定其中存在的细菌数量，来确定系统性细菌载量。通过检测抗菌肽基因的表达水平，可对宿主免疫防御能力进行定量分析，进而实现对细菌感染的定量与表征。在果蝇（Drosophila melanogaster）中，可利用该方法研究遗传和环境因素如何改变果蝇的免疫能力。该方法可用于解答昆虫免疫学领域的关键科学问题，例如宿主的遗传和环境因素如何影响其免疫能力，或不同细菌在感染动力学上的差异。尽管本研究采用该方法来检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）抵抗细菌感染的免疫防御反应，但该方法同样适用于其他昆虫，并可拓展用于其他类型的病原体，如病毒或真菌。初学者在首次学习该方法时常遇到的一个问题是，可能会对果蝇造成过度损伤，从而导致死亡率过高，甚至在对照组中也是如此。通过视觉演示该方法对于学习如何在尽量减少对果蝇损伤的前提下进行感染至关重要。由于我们的宿主物种黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）体型非常小，感染操作必须在显微镜下进行，这增加了该技术的初始操作难度。然而，我们认为，即使是对果蝇操作经验有限的科研人员，通过该技术的小规模演示也能轻松掌握。开始实验时，从先前准备好的主平板上挑选单个菌落，接种至含有无菌培养基的锥形瓶中。将细菌在37摄氏度下培养过夜，直至进入稳定生长期。当培养物达到稳定期后，在台式离心机中以5,000 ×g离心600微升培养物3分钟，轻轻沉淀细胞，然后弃去上清液。用1000微升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细菌。接下来，将重悬的细胞用无菌 PBS 稀释至所需的 600 纳米吸光度，并用此悬浮液感染果蝇。通过拉制硼硅酸盐玻璃毛细管制备玻璃针，并用镊子折断针尖，形成直径为 50 微米的开口。然后将顶盖 O 型环和白色垫片（大凹面朝外）放置在注射器金属推杆上。使用带有30号针头的注射器将矿物油注入玻璃针中。然后将装有矿物油的玻璃针穿过夹头，并将较大的O形圈套在针的基部，距离针的钝端1毫米处。将针滑入金属推杆上，轻轻旋紧夹头直至固定牢固。排出注射器中的矿物油，仅在针头中保留少量矿物油，以在注射器与细菌悬液之间形成屏障。确保矿物油内部、细菌悬液内部以及两种液体之间均无气泡。然后将注射器调节至所需的注射体积。将毛细玻璃针的尖端小心插入含有无菌 PBS 的离心管中，按下显微注射仪上的填充按钮，使注射针内充满液体，用于制备损伤对照样本。在麻醉果蝇的腹部前段腹侧部位注射无菌 PBS，随后将注射后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新离心管中，并将离心管水平放置，以防止果蝇在从麻醉中恢复前粘附于培养基上。接着，将注射仪中剩余的无菌液体排出，并使用同一根针头重新吸取细菌悬液。重复该操作，将细菌悬液注射到果蝇体内。或者，也可通过无菌针刺法进行感染。制备感染用针时，将200微升微量移液器吸头的末端熔化，并将一根直径0.15毫米的昆虫学用穆钦针插入熔融的塑料中。让塑料凝固，使大头针固定在塑料中，并有0.5厘米的针尖伸出塑料。用二氧化碳麻醉果蝇，然后用针头刺穿果蝇胸部的胸侧板，注意避开翅膀和足的附着部位。使用软镊子将果蝇从微细针上取下。确保在每只果蝇穿刺之间将针头浸入细菌悬浮液中。将刺破的果蝇放入装有新鲜培养基的新试管中，并将试管平放，直到所有果蝇从麻醉状态恢复。取部分感染的果蝇，分别放入预置冰上的微量离心管中。每管加入 250 µL PBS，用研杵充分匀浆果蝇。接下来使用螺旋接种仪将匀浆液接种到LB培养基平板上。或者，可通过连续稀释法将匀浆液进行平板接种。将每份果蝇匀浆液转移至96孔板的第一行。使用多通道移液器将剩余各列的每孔加入90微升PBS。从含有果蝇匀浆液的第一列中吸取10微升，加入第二列孔中。上下吹打至少10次，充分混匀匀浆液。然后取10 µL匀浆液转移至下一行。从最底行开始，对剩余各行重复此操作。使用多通道移液器从每个孔中吸取10 µL液体，并将其接种到LB平板上。确保将样品点样成彼此不接触的独立斑点。重复此步骤，直至从每行的所有孔中取样完毕，并按稀释度从高到低的顺序点样至LB平板上。无论采用何种涂布方法，均需注意避免菌落过度生长，以保证菌落保持较小且分离清晰。从培养箱中取出培养皿。当实验细菌已长出可见菌落，但果蝇肠道微生物的菌落尚未可见时（螺旋平板约在24小时后），使用自动菌落计数器对菌落进行计数，该计数器可根据培养皿上菌落的数量和位置，估算每毫升匀浆液中的细菌载量。对于点种平板，手动计数每只果蝇在菌落数为30至300之间的稀释度下的菌落数，并计算原始匀浆液中每毫升的细菌数量。果蝇被注射了50纳升不同光密度范围的细菌悬液，随后立即进行匀浆并涂板，因此感染剂量随注射所用细菌悬液的光密度而变化。初始细菌载量与注射时的初始光密度呈强相关性。本方案可用于观察不同类型的感染。果蝇被普罗威登斯菌（Providencia rei）感染后，可引起一种持续20天或更长时间的慢性亚致死性感染。而感染大肠杆菌（coli）的果蝇则可在感染后六小时内清除病原体。可通过RNA提取及后续的抗菌肽转录本qRT-PCR分析来评估免疫系统的诱导情况；类似地，也可利用在抗菌肽基因启动子控制下表达GFP的果蝇进行可视化观察，但定量性较差。掌握该技术后，可实现每小时感染数百只果蝇。在果蝇感染后，理论上可以检测多种表型，包括学习能力、代谢状态，或几乎任何其他可设想的性状。观看本视频后，您应能够充分理解如何对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）进行稳定且可重复的细菌感染，以及如何后续评估感染严重程度并量化宿主免疫反应。请务必注意，某些细菌可能对人类健康构成风险。确保遵循适当的生物安全程序，并采取充分的 containment 措施，防止感染的果蝇逃逸。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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免疫学与感染

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使用纳米注射器通过细菌悬液感染果蝇

本视频展示了一种通过将病原细菌直接注入果蝇体腔来感染Drosophila的技术。该方法可绕过上皮屏障及其他被动防御机制，从而诱导系统性感染。感染后，通过监测果蝇死亡率并进行下游检测，评估所引发的免疫反应。...

一种通过脓毒针刺技术在果蝇中诱导全身性细菌感染的方法

在本视频中，我们演示一种用于测量的技巧 E. coli 注射后的细菌载量 E. coli 进入胸腔...

测量 E. coli 细菌载量在 黑腹果蝇 随后 E. coli 感染

一种饲养方法 黑腹果蝇 在无菌和已知菌条件下进行培养的方法被介绍。果蝇胚胎在次氯酸钠中脱去卵壳，无菌转移至无菌培养基中，并在密闭容器中饲养。通过将细菌接种至培养基和胚胎，可建立已知菌关联，细菌的存在通过全虫涂板法确认 果蝇...

在无菌和已知菌群条件下培育果蝇 Drosophila melanogaster

本方法展示了如何利用三维（3D）模型可视化病原体侵入昆虫细胞的过程。从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫中分离的血细胞被病毒或细菌病原体感染，感染方式包括离体（ex vivo）或活体（in...

从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析

本方案描述了通过口服途径使果蝇Drosophila...

Drosophila melanogaster中的口腔细菌感染与排菌

本方案描述了一种在成年黑腹果蝇（Drosophila...

利用体内吞噬作用检测法评估果蝇Drosophila melanogaster的细胞免疫反应

本方案描述了一种用于评估和量化年轻与年老个体吞噬能力的体内吞噬作用检测方法 黑腹果蝇 血细胞吞噬细菌.

评估成人不同年龄段的吞噬能力 黑腹果蝇 使用体内吞噬作用检测法研究血细胞

Drosophila melanogaster 成虫已被广泛用作模式生物，以研究宿主抗微生物先天免疫反应及微生物感染策略背后的分子机制。为了推动D. melanogaster...

Drosophila melanogaster 幼虫注射方案

学习使用纳米注射器或无菌针刺法对黑腹果蝇进行细菌感染，并通过测定细菌负荷和抗菌肽基因表达来量化宿主免疫反应。该方法为研究昆虫先天免疫提供了可靠框架。

Drosophila Melanogaster 中的系统性细菌感染与免疫防御表型

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