Name: 干血斑点. 免疫和分子技术中使用的制备和加工 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习干血斑点标准化制备与处理技术，用于免疫分析和分子检测。本方法通过毛细血管采血、干燥、打孔和洗脱步骤，实现乙型肝炎、丙型肝炎及HIV病毒的血清学和分子标志物检测。

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本通讯基于先前在《病毒学杂志》（Virology Journal）17 上以开放获取方式发表的研究成果，遵循知识共享署名许可协议（Creative Commons Attribution License）（<a href="http://creativecommons.org/licenses/by/2.0">http://creativecommons.org/licenses/by/2.0</a>），许可方为 BioMed Central。作者衷心感谢在“药物与慢性传染病”（“DRUCK 研究”）研究试点工作中与德国罗伯特·科赫研究所（Robert Koch-Institute，柏林，德国）的 U. Marcus、W. Cai、W. Zhang 和 R. Zimmermann 所开展的富有成效的合作，并感谢 S. Moyrer 提供了 图 1 中所汇集的照片，同时感谢 D. F. Whybrew 博士（德国哥廷根）对稿件的校对。作者还对以下人员提供的娴熟技术协助表示诚挚谢意：J. Ackermann、E. Bayrambasi、U. Büttner、S. Dziubek、I. Jakobsche、B. Krellenberg、H. Krohn、P. Kusimski、A. Metcalf、J. Piejek、S. Saar、M. Schröter 和 K. Seidel。本研究部分得到了德国卫生部向丙型肝炎国家参比中心提供的资助支持。

由于该方案旨在用于医学诊断，其应用必须遵循《赫尔辛基宣言》的原则19。对于本文所呈现结果的第一部分，出于以下两个原因，似乎无需患者单独签署同意书，也无需伦理委员会批准：（1）“患者在入住埃森大学医院时，已书面同意接受所有必要的生物化学、细菌学和病毒学检查。”17 （2）“在DBS检测评估过程中使用的所有样本均是在常规临床诊断流程中送至病毒学研究所的。因此，这些样本无一是专门为本研究而采集，未进行任何额外的静脉穿刺，也未对任何样本检测医生在常规诊断过程中所要求以外的其他指标。”17 最终在德国柏林和埃森市应用DBS检测以评估主动注射毒品人群的“药物与慢性传染病研究”（DRUCK研究）18，已获得德国联邦数据保护与信息自由专员（柏林，德国）以及柏林夏里特医学院伦理委员会（柏林，德国）的批准。
1. 血液采集
<ol>
	<li>静脉穿刺14, 15, 20, 21
	<ol>
		<li>戴上一次性乳胶手套，使用适当的消毒剂清洁预定穿刺部位（ preferably 为肘前窝的肘正中静脉）。 例如70% 异丙醇</li>
		<li>在疑似穿刺部位上方4–6英寸处绑扎止血带以扩张静脉。将针头引导进入患者的静脉，针头就位后，缓慢填充与之连接的含EDTA抗凝剂的采血管。</li>
		<li>静脉穿刺完成后，立即松开止血带并拔出针头。随后用一块干燥纱布按压穿刺部位，并可用绷带固定纱布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤穿刺（图1A)13 - 15, 20, 22, 23
	<ol>
		<li>戴上一副一次性乳胶手套。</li>
		<li>在皮肤穿刺前，患者应 warming 双手。沿手指远端向近端方向按摩，以增加穿刺部位的血流量。</li>
		<li>用合适的消毒剂清洁非书写手第三或第四手指远节指骨 fingertip 掌侧的皮肤， 例如70% 异丙醇。使用一次性安全采血针刺破皮肤。手指应保持在利于血液在指尖处因重力作用而聚集的位置。</li>
		<li>皮肤穿刺采集毛细血管血完成后，应在指尖处贴上创可贴。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 血斑的制备
<ol>
	<li>静脉穿刺采血样本的制备15
	<ol>
		<li>尽快将采集的抗凝（EDTA）全静脉血滴加到滤纸片上。静脉穿刺后超过24小时不得再制备干血斑。</li>
		<li>在滤纸片上填写患者识别所需的全部信息。每张滤纸片仅可滴加单一个体的血液。</li>
		<li>戴上一次性乳胶手套。</li>
		<li>轻轻倒置采血管2–4次，随后小心打开塞子。</li>
		<li>使用带一次性吸头的移液器吸取50 µl全静脉血。将血液转移至圆形区域中心，注意移液器吸头勿直接接触滤纸表面。尽量使圆形区域完全浸透。</li>
		<li>重复此操作，直至填满滤纸片上所有所需圆形区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮肤穿刺采血样本的制备（图1B 和 图1C）13–16, 23
	<ol>
		<li>用纱布擦去第一滴血液，因其可能含有过多组织液。再次按摩手指以增加穿刺部位的血流量。将下一滴血液转移至滤纸片的一个圆形区域，注意指尖勿直接接触滤纸表面。仅依靠毛细作用力使血液自然渗入滤纸纤维。</li>
		<li>待指尖形成下一滴较大的毛细血管血，将其收集至下一个圆形区域。重复此操作，直至填满所有必要圆形区域或血液停止流出。</li>
		<li>若血流量不足以填满所有所需圆形区域，切勿过度挤压或“挤奶”手指。若血液停止流出，应在指尖贴上绷带。如检测需要更多血液，可在另一手指进行第二次皮肤穿刺。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血斑的干燥
<ol>
	<li>为干燥血斑，将滤纸置于生物安全柜内的洁净纸巾上，在室温下避光干燥，最好过夜（但至少4小时），避免任何外部热源。干燥完成后，血斑呈均匀的深褐色，不再有红色区域可见（图1D）13, 15, 16。</li>
</ol>
4. 干血斑（DBS）的储存与运输
注意：血斑干燥后，可中断后续处理步骤。滤纸片现在可以储存13 - 16, 23。
<ol>
	<li>储存时，将滤纸片放入一个单独的、不透气的自封袋中，并放入1至2包干燥剂，以保护样本免受潮气影响（图1E）。可选地，可加入湿度指示卡。</li>
	<li>应尽快将该自封袋转移至温度为-20 °C或更低的冷冻环境中。若在野外条件下无法提供冷冻设备，则可在-4 °C甚至室温下短期储存，最长不超过14天。</li>
	<li>运输冷冻的干血斑（DBS）样本时应使用干冰。对于最初在室温下保存的滤纸卡，应采用三层包装系统，即以自封袋作为内层容器，再加内层和外层包装袋。通过普通邮件寄送时，外层包装无需标注内容物，但必须在最内层主容器上贴附国际生物危害标志16。</li>
	<li>若发现干燥剂包和/或附加的湿度指示卡变为粉红色，则应排除该滤纸卡，不再用于后续处理。</li>
</ol>
5. 干血斑的洗脱13, 15, 16, 23
<ol>
	<li>使用一次性 6 mm 打孔器，从每张 Grade 903 滤纸的血渍圆圈中打下一个血斑（图 1F）。将同一患者的所有打下的干血斑转移至 12 孔板中的一个孔内。</li>
	<li>向孔中加入含有 0.05% Tween 20 和 0.08% 叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）。根据后续用于干血斑洗脱液分析的检测方法所需的最小体积，调整所加缓冲液的体积（图 1G）。</li>
	<li>重复上述步骤，以获得第二组干血斑洗脱液，用于进行分子分析。</li>
	<li>将细胞培养板置于实验室摇床上，使打下的干血斑在室温下轻柔洗脱至少 4 小时，或更优选择为过夜（O/N）（图 1H）。</li>
	<li>次日，血斑几乎无血残留，已形成溶血性上清液（图 1I）。将这些洗脱液转移至微量离心管中，随后在 10,500 × g 条件下离心 2 分钟（图 1J），以去除洗脱过程中产生的任何残渣（图 1K）。</li>
</ol>
6. 洗脱液分析
<ol>
	<li>离心后的洗脱液现已可用于后续分析。使用市售试剂盒检测洗脱液中乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV感染的标志物，并仔细遵循各制造商提供的使用说明（图1L）。</li>
</ol>
<img alt="为期3天的细胞培养流程图，包含多孔板、孵育和扫描设备。" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 本通讯中提出的用于制备和处理干血斑以进行免疫分析和分子检测的实验方案图示概要。 通过静脉穿刺或采血针穿刺皮肤获取的全静脉血和毛细血管血（A）均可作为干血斑分析的样本。将血液转移至Grade 903滤纸卡的圆形区域（B、C）后，样本应在生物安全柜中于室温下过夜（O/N）干燥，以形成颜色均匀的棕褐色斑点，且不应出现红色区域（D）。当干血斑完全干燥并需要储存时，可将滤纸卡装入含有1–2包干燥剂的密闭自封袋中（E）。对干血斑的进一步实验室处理包括：使用6 mm一次性打孔器从圆形区域中心打取穿孔样本（F、G），在基于PBS的缓冲液中振荡洗脱穿孔样本至少4小时，或更优选择为过夜（O/N）（H），回收洗脱液（I），最后对实验杯进行离心（J），以去除洗脱过程中可能产生的任何残留碎片（K）。随后，干血斑洗脱液即可用于分析，本研究中采用全自动平台分别检测乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的血清学标志物（L）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

过去，RSR 曾因举办讲座收到来自雅培诊断公司的酬金，并为其科学研究工作获得过财务支持。NG 和 OM 宣布他们不存在利益冲突。

干血斑（DBS）已应用了100年2，但令人惊讶的是，目前在DBS的制备与处理方面仍缺乏普遍共识。迄今为止，仅在新生儿筛查领域实现了这一重要分析前阶段的充分标准化14，而其他所有DBS检测应用则存在多种不同的操作方案5,&#160;16,&#160;23。为克服这种显著的异质性，本文提出了一套全面的、逐步操作的DBS制备与处理流程，可用于免疫测定及分子检测技术，并&#160;针对其在检测乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染标志物方面的有效性进行了评估。下文讨论的重点主要集中于该建议方案的各个操作步骤。
在DBS检测历史上，曾使用过多种不同的滤纸片2 但如今仅有两家商业供应商被美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为II类医疗器械用于血液采集5,&#160;16这些滤纸卡系统的均匀性很高，且具有非常相似的吸收特性，因此在任一种滤纸卡上制备的毛细血管血样的分析结果差异不超过4%&#160;&#8211;&#160;5%28毫不奇怪，Masciotra 及其同事29 因此检测到 HIV-1&#160;RNA在从不同来源的血液采集卡洗脱后，通过定性检测可获得几乎相同的效果。基于这些数据，当检测配对的血清/干血斑样本中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染标志物时所观察到的任何差异，均可基本排除。17 仅由滤纸卡的选择引起。然而，当待测分析物需要精确量化时，不同来源之间的差异可能不再可忽略，此时需要采用更复杂的技术， 例如穿孔干血斑法（PDBS）作为一种微采样方法30 或干血清斑点（DSS）的制备31 可能需要采用非常规的DBS检测方法10.
由于干血斑（DBS）检测仅使用少量血液（一滴毛细血管血液约为 50 µl）5,&#160;16，样本体积的差异至关重要；可以承认的是，在“DRUCK 研究”试点过程中记录的部分血清学检测结果与参与者自我报告的乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染状态之间的差异，可归因于这一变量。最大限度减少样本体积“波动”的最重要因素无疑是正确的毛细血管采血技术，而这只能通过技术人员持续且细致的培训来实现22。此外，作为质量控制措施，所有使用干血斑的实验室应已建立识别并随后排除被视为不合格或无效的干血斑样本的程序16。
主要在艾滋病病毒（HIV）背景下开展的研究32 和新生儿筛查33 已有研究表明，高湿度可能导致分析物降解，但关于干血斑（DBS）应空气干燥多长时间的问题，迄今尚未达成共识。本文建议至少干燥4小时，或更优地过夜（O/N）干燥，因此采用了在绝大多数相关文献中所使用的实验条件32,&#160;34 关于用于后续HBV和HCV检测的干血斑（DBS）储存数据存在分歧。1981年，Villa及其同事35，采用现代分析技术，报道在长达180天的观察期内，若抗体滴度保持稳定，则室温储存不会影响乙型肝炎病毒（HBV）检测结果 &#62;&#160;1/1,000，但在血清滴度仅为1/100的情况下，DBS在15天后变为临界阳性甚至阴性。储存于-20&#160;&#176;C 或 4&#160;&#176;C并未带来显著改善。相比之下，一项三十年后开展的研究36 检测了HBV阳性样本的重复样本，作者发现，在室温下，抗-HBc和抗-HBs抗体在长达183天内保持稳定，而HBsAg在相同条件下仅63天后即出现假阴性结果。关于HBV&#160;从干血斑洗脱液中检测DNA，病毒核酸浓度在37℃下至少七天内保持稳定&#160;&#176;C37 或证明在室温下储存长达三周具有“抗性”38使用两种市售的第三代免疫检测试剂检测抗HCV抗体39 使用储存在 -20 的干血斑样本，在 117 天内提供了准确的结果&#160;&#176;C，2&#160;&#8211;&#160;8&#160;&#176;摄氏度，以及20&#160;&#8211;&#160;25&#160;&#176;C，分别。在 -20&#160;&#176;然而，C组的光密度变异最小。采用第四代抗-HCV ELISA， 即， Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA 在干血斑检测中的应用，Larrat 等40 在室温下储存DBS样本超过三天后，观察到分析特异性显著下降。另一方面，使用相同试剂盒对在不同条件下储存60天的样本进行检测，仍获得了精确的检测结果（-20&#160;&#176;C，2&#160;&#8211;&#160;8&#160;&#176;摄氏度，以及22&#160;&#8211;&#160;26&#160;&#176;C）由 Brandao 及其同事完成41HCV下降的观察&#160;不同储存条件下DBS中的RNA浓度在室温下最长一年内无明显变化42 在室温下四周后发生十倍变化43考虑到HBV和HCV抗原、核酸及抗体稳定性方面存在相互矛盾的数据，将本方案中关于样本储存的建议回退至此前为用于HIV检测的干血斑（DBS）样本储存所确定的共识，似乎是合理的15,&#160;30对于短期保存（长达两周），抗原、病毒核酸和抗体在室温下是稳定的，而长期保存的最佳条件为冷冻。
设计洗脱方案时，通常应考虑三个参数：（1）洗脱缓冲液；（2）洗脱时间和温度；（3）洗脱体积23在几乎所有相关出版物中，均使用磷酸盐缓冲液（PBS）来洗脱干血斑（DBS），且大多数作者添加了一种蛋白质， 例如，牛血清白蛋白（BSA）或表面活性剂Tween 20，以稳定进入溶液的蛋白质并同时阻断非特异性结合位点，从而增强检测信号23目前仅有少数研究报告在干血斑（DBS）检测背景下直接比较了不同的洗脱缓冲液。Villar 等36, 例如，所有缓冲液的洗脱能力几乎相当，但含0.5% BSA的PBS产生的非特异性反应水平最低。Croom及其同事也观察到了非常相似的结果。44 在使用Genetics Systems rLAV EIA的样本稀释液对DBS中的抗-HCV抗体进行洗脱时，由于DBS制备后最初几小时内样本降解的风险极低（见上文），因此决定在室温下将血斑孵育过夜（O/N），并通过轻柔的颠倒混匀方式促进洗脱过程。该方法的优势在于，前一日打孔制备的样本可在次日清晨直接转入常规诊断流程。23. 洗脱缓冲液的体积应根据后续分析所用检测方法的最低要求进行调整，以尽可能降低稀释倍数。然而，在先前的评估中，由于“DRUCK研究”期间需要在相对较短的时间内保证较高的样本通量，因此无法对每种分析物的洗脱条件进行细致优化。17因此，相对不利的体积为1,000&#160;&#181;使用基于 PBS 的缓冲液，分两次操作完成所有参数的整个洗脱过程。
一方面，这种方法在HIV感染个体中针对抗-HBc/抗-HBs系统的检测因抗体浓度较低而“完全失败；……并且需要采用分子生物学方法，以确保HBV&#160;DNA和HCV&#160;RNA检测具有最佳的分析灵敏度。”17 另一方面，高洗脱体积在使用评估过程中所采用的试剂盒检测HBsAg、抗-HCV和抗-HIV时，被证明完全不会带来不利影响。“从全血洗脱液中检测HBsAg阳性样本的灵敏度达到98.6%，与以往研究结果同样处于较高水平，而这些先前的研究部分采用的洗脱体积明显更小，分别为100 µl、250 µl、600 µl或500 µl”17, 36,&#160;45,&#160;46。在179对血清/干血斑样本中对抗-HCV抗体的检测灵敏度为97.8%，与已有研究报告的结果相当24,&#160;44,&#160;47,&#160;48,&#160;49，而这些研究使用的洗脱体积低了5至10倍。“此外，抗-HCV检测方案已通过设定特定的临界值而得到适当优化”17,&#160;24,&#160;48,&#160;49，“或通过将样本体积从20 µl增加至100 µl”17,&#160;49。最后，抗-HIV检测所建立的分析特异性和灵敏度（均为100%）等于或优于其他专门针对干血斑检测优化的免疫分析方法50,&#160;51，“或采用多种抗-HIV检测联合使用的分步流程”17,&#160;52。“事实上，本方法的性能甚至超过了专门为干血斑洗脱液中抗-HIV抗体检测而开发和优化的检测试剂盒（Q-Prevent HIV 1&#160;+&#160;2 DBS试剂盒）的表现。”17,&#160;53
综上所述，本文所介绍的全面、逐步的操作方案已被证实是一种可行且易于使用的工具，可用于干血斑（DBS）的制备与处理，因此可在诊断病毒学中可靠应用。该方案支持自动化操作&#160;54，并且由于其优异的性能特征，有望成为未来实验室医学领域全球干血斑检测普遍认可的共识性操作方案的基础。

使用纤维素纸卡采集血液的概念归功于现代临床微量分析之父——Ivar Christian Bang（1869–1918）1,&#160;21913年，Bang从干血斑（DBS）洗脱液中测定了葡萄糖。3 并且，后续还利用该滤纸技术结合凯氏定氮法进行了氮含量测定2随后，多位研究人员报道了使用干血斑（DBS）进行血清学检测以诊断梅毒。2早在1924年，Chapman就总结了干血斑（DBS）检测的优点，其中特别强调了至今仍然有效的四项内容：（1）与常规静脉穿刺相比，所需血量更少，这一特点在儿科诊断中尤为重要；（2）采血操作简便、无创且成本低廉；（3）细菌污染或溶血的风险极低；（4）干血斑可在几乎不引起待测分析物降解的情况下长期保存2,&#160;4除了用于梅毒检测外，干血斑技术的其他早期应用还包括， 例如，1953年对麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）抗体的检测2，从印度尼西亚采集后干燥于滤纸上的粪便样本经普通邮件寄送至荷兰莱顿后，成功鉴定出志贺菌；以及在流行区采集的干血斑样本中，于三个多月后检测到针对血吸虫的抗体51963年，即Bang首次发表相关通讯的五十年后2,&#160;6，Guthrie 最终发表了他著名的通过新生儿足跟采血获得的干血斑（DBS）诊断苯丙酮尿症的方法7,&#160;8.
尽管从那时起，干血斑（DBS）被认为是一种适用于采集、储存、运输和分析多种人体体液的常用方法5，但在数十年间，其在诊断领域的应用仍主要局限于资源有限环境下的感染性疾病诊断以及新生儿遗传性代谢疾病的系统性筛查9,&#160;10。然而自2005年以来，一系列新颖且创新的DBS应用开始涌现，导致相关科学文献数量几乎呈指数增长，从每年约50篇增至目前近450篇。新兴应用领域包括毒物动力学与药物动力学研究、代谢谱分析、治疗药物监测、法医毒理学以及环境污染控制等多样化方向10,&#160;11。
因此，干血斑（DBS）检测在过去100年中已成功广泛应用于临床实验室诊断领域2。然而，与临床化学12类似，在此发展过程中，许多年来分析前变量未得到充分重视。事实上，即使在今天，尽管已开展了诸如美国疾病控制与预防中心（CDC）的滤纸评估项目13，或在新生儿筛查框架下制定血液滤纸采集的国家标准14等重要工作，但在应用干血斑检测的大多数其他领域中，分析前阶段仍然普遍被低估5,&#160;10。
基于上述背景，本文提出了一套全面的分步操作方案14&#160;-&#160;16，适用于免疫测定和分子生物学技术，涵盖干血斑（DBS）制备与处理的全部关键步骤：（1）血液采集；（2）血斑制备；（3）血斑干燥；（4）储存与运输；（5）干血斑洗脱；以及最后的（6）干血斑洗脱液分析。该方案的有效性首先通过1,762对配对的血清与干血斑样本进行评估，用于检测乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗原抗体（anti-HBc）、乙型肝炎病毒表面抗原抗体（anti-HBs）、HBV&#160;DNA、丙型肝炎病毒（HCV）抗体（anti-HCV）、HCV&#160;RNA，以及人类免疫缺陷病毒（HIV）&#160;1-p24抗原/抗HIV 1/2，检测平台为全自动系统或高灵敏度的定性核酸检测方法17。在第二阶段，该方案被应用于由罗伯特·科赫研究所与德国丙型肝炎国家参比中心合作开展的“药物使用与慢性传染病”（“DRUCK研究”）试点研究中，研究对象为德国柏林市和埃森市的活跃吸毒者18。

<table><tbody><tr><td>乳胶橡胶手套</td><td>Hartmann</td><td>#4049500041515</td><td></td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Bode Chemie</td><td>#9768050</td><td></td></tr><tr><td>Mulifly 安全套管针</td><td>Sarstedt</td><td>#85.1638</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 血液采集管</td><td>Sarstedt</td><td>#02.1066.001</td><td></td></tr><tr><td>粘性绷带</td><td>Hartmann</td><td>#2994163</td><td></td></tr><tr><td>干纱布垫</td><td>Hartmann</td><td>#143213</td><td></td></tr><tr><td>一次性安全采血针</td><td>Owen Mumford</td><td>#3802421</td><td></td></tr><tr><td>滤纸卡</td><td>Whatman/sigmaaldrich</td><td>#10534612</td><td>Grade 903 滤纸卡</td></tr><tr><td>一次性移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>#S1126-7810, #S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>拉链袋</td><td>Flexico</td><td>#20219</td><td></td></tr><tr><td>小型干燥剂袋</td><td>Tropack</td><td>#-</td><td></td></tr><tr><td>一次性活检穿孔器</td><td>pfmmedical</td><td>#48601</td><td>6.0 mm 一次性活检穿孔器</td></tr><tr><td>一次性镊子</td><td>Servoprax</td><td>#H7301</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>Greiner</td><td>#665180</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>#14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Applichem</td><td>#A1389.0500</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Merck</td><td>#66880250</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管，1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>#30120086</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HBsAg（定量）</td><td>Abbott</td><td>#6C3642</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HBc II</td><td>Abbott</td><td>#8L4425</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HBs</td><td>Abbott</td><td>#7C1825</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT anti-HCV</td><td>Abbott</td><td>#6C3725</td><td></td></tr><tr><td>ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo</td><td>Abbott</td><td>#4J2727</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure 96 DNA 和病毒核酸大体积提取试剂盒</td><td>Roche</td><td>#6374891001</td><td></td></tr><tr><td>artus HBV LC PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>#4506063 (24 次检测), #4506065 (96 次检测)</td><td></td></tr><tr><td>VERSANT HCV TMA 检测试剂盒 IVD</td><td>Siemens Healthcare</td><td>#2554311</td><td></td></tr></tbody></table>

干血斑的制备与处理：在免疫测定和分子技术中的应用

Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques

一个世纪前，人们开始提出将血液采集于纸卡上，随后利用干燥血斑（DBS）进行诊断的构想。自此以来，DBS检测数十年来主要局限于资源有限环境下的传染病诊断，或用于新生儿遗传性代谢疾病的大规模筛查；直到最近，一系列新颖且创新的DBS应用才逐渐涌现。多年来，DBS检测领域对分析前变量的关注严重不足；即使在今日，除新生儿筛查外，整个分析前阶段——包括DBS的制备及其最终分析前的处理流程——仍未实现标准化。鉴于上述背景，本文提出了一套涵盖所有关键环节的全面、逐步操作方案。 即， 血液采集；血斑制备；血斑干燥；干血斑的储存与运输；干血斑的洗脱，以及最终对洗脱液的分析。该方案的有效性首先通过1,762份配对的血清与干血斑样本进行评估，用于在自动化分析平台上检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染标志物。随后，该方案被应用于一项针对德国柏林市和埃森市吸毒人员的试点研究中。

为制备和处理干血斑（DBS）所建议的方案的有效性，最初通过分析1,762份配对的血清/DBS样本中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染标志物得以评估17。为此，DBS由100 µl全静脉血制备而成（参见前述方案的2.1.1–2.1.6步骤），每份DBS使用1,000 µl基于磷酸盐缓冲液（PBS）的缓冲液进行洗脱（参见上述方案的5.1–5.5步骤），以在两次独立操作中完成全部七个参数的检测。由于即将开展的“药物与慢性传染病”（“DRUCK研究”）现场研究预计在相对较短时间内需要较高的样本通量，因此在未针对每种分析物仔细优化洗脱条件的情况下采用该方法似乎是不可避免的。
所有检测均遵循制造商在DBS分析过程中的建议，但在HBsAg和抗-HBs检测中需进行调整，以补偿溶血影响或稀释效应。当临界值设为0.05 IU/ml时，与血清样本相比，DBS洗脱液的HBsAg检测假阳性率为14.7%（354份样本中52份，图2A）。数据的受试者工作特征（ROC）分析25, 26表明，将阈值提高至0.15 IU/ml可实现HBsAg阳性与阴性样本的理想区分（敏感性0.986，1-特异性0.000，图2B）。另一方面，当抗-HBs抗体定量的临界值设为10 IU/l时，假阴性检测率为14.2%（331份样本中47份，图2C）。因此，再次通过ROC分析，将该临界值下调至1.5 IU/l，以实现最佳的数值区分（敏感性0.917，1-特异性0.007，图2D）。
<img alt="HBsAg 和 Anti-HBs 分布图；血清学结果；临界值分析；IU/ml；频数 N。" src="/files/ftp_upload/52619/52619fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 干血斑洗脱液中 HBsAg 和抗-HBs 的检测（修改自17）。 根据 ROC 分析，将 HBsAg 定量检测的临界值从 0.05 IU/ml（A）提高至 0.15 IU/ml（B），使假阳性结果的比例从 14.7 % 降至 0 %。类似地，对抗-HBs 浓度进行 ROC 分析表明，将其相应阈值从 10 IU/l（C）降低至 1.5 IU/l（D），可完全消除假阴性结果，后者最初占所有检测结果的 14.2 %。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52619/52619fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
血清/干血斑联合检测的结果总结于表117。在对七种分析物进行干血斑检测的过程中，未观察到任何非特异性反应。
在检测干血斑（DBS）洗脱液中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）——即乙型肝炎病毒（HBV）急性和慢性感染的关键血清学指标——时，其分析灵敏度为98.6%。两种假阴性血清中的HBsAg浓度分别为749 IU/ml和6 IU/ml。在204份DBS洗脱液中，成功检出176份（即86.3%）含有抗-HBc抗体。未检出的28份样本中，有22份来自HIV合并感染者。因此，若在计算中排除HIV阳性个体，则从干燥的全静脉血洗脱液中检测抗-HBc抗体的灵敏度可达97.1%。抗-HBs抗体的检测结果也呈现类似情况。即使将检测方法的临界值调整至1.5 IU/l，仍出现9例血清与DBS结果不一致的情况。在未合并HIV感染的患者中，血清抗-HBs浓度为11–26 IU/l，该浓度过低，导致干燥血液洗脱后无法被检测到。
抗-HCV 抗体提示可能为急性、慢性或已恢复的感染。通过干血斑洗脱液检测出的抗-HCV 假阴性结果仅有四例（即 2.2 %），进一步的血清学和分子生物学分析明确表明，这些血清样本极有可能来自感染早已恢复的患者。
使用全自动系统检测干血斑洗脱液中的抗HIV抗体是一个完全顺利的过程，其分析灵敏度达到100%。
全血洗脱液中HBV DNA平均浓度在100份标本中进行检测（平均DNA浓度：1,573,898 IU/ml，范围： &lt; 357 - &gt; 17,860,000 IU/ml）时，检出率为93.0%。因此，在7份血清HBV DNA浓度介于409至3,643 IU/ml之间的低浓度样本中，干血斑检测未能检出。在100份经证实HCV RNA阳性的血清样本中（平均HCV RNA浓度：1,415,944 IU/ml，范围：2,479 - &gt;7,692,000 IU/ml），且相应的全血分样可用。 comparative 研究结果显示，从DBS洗脱液中检测HCV RNA的分析灵敏度为100%。17
为了验证在野外条件下制备和处理干血斑（DBS）的所述方案，本研究在“药物与慢性传染性疾病”项目的试点阶段与罗伯特·科赫研究所（德国柏林）密切合作进行了实施，该研究在德国柏林和埃森市的活跃吸毒者中开展18。所有纳入的534名受试者（433名男性和101名女性）均按照前述方案第2.2.1–2.2.3节中详细描述的方法进行了毛细血管采血，随后再次通过加入1,000 µl基于磷酸盐缓冲液（PBS）的缓冲液对干血斑进行洗脱。
两名个体被诊断为慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染，39名表现出乙型肝炎病毒感染已恢复的血清学模式。此外，15名参与者乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）阳性（提示既往接种疫苗），8名仅乙型肝炎核心抗体（anti-HBc）阳性。在柏林，参与者中丙型肝炎病毒抗体（anti-HCV）的流行率为57.3 %（N = 193），在埃森为73.0 %（N = 144）。在抗体阳性样本中，分别有65 %（N = 125）和62 %（N = 89）同时检测到病毒血症。在534名受试者中，25人人类免疫缺陷病毒抗体（anti-HIV）阳性。其中19例感染此前已被确诊，24名感染者合并丙型肝炎病毒（HCV）感染。
通过DBS检测获得的结果与研究参与者关于自身报告的HBV和HCV状况的回顾性资料进行了仔细比较。结合配对血清/DBS样本的检测结果，对“DRUCK研究”主阶段的检测算法进行了小幅调整，该主阶段将在德国另外六个大城市中招募活跃的吸毒者：“感染HIV的个体将始终接受HBV DNA检测；DBS洗脱液中抗-HBc或抗-HBs呈阳性的参与者，应在第二次咨询时接受静脉穿刺，以最终明确其抗-HBc/抗-HBs状态；此外，无论抗-HCV检测结果如何，所有DBS洗脱液均将接受HCV RNA筛查。”17
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>配对血清/干血斑洗脱液 (N)</td>
			<td>不一致结果 (N)</td>
			<td>血清与干血斑洗脱液检测结果不一致的原因</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBsAg</td>
			<td>299</td>
			<td>2</td>
			<td>两名慢性 HBV 感染患者，均接受抗病毒治疗，其中一名合并 HIV 感染。血清中 HBsAg 浓度分别为 749 IU/ml 和 6 IU/ml。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBc</td>
			<td>305</td>
			<td>28</td>
			<td>在血清中，22 名患者为既往 HBV 感染已恢复，6 名个体表现为“仅 anti-HBc 阳性”的血清学模式。这 28 名患者中有 22 名合并 HIV 感染。在“HBV 感染恢复者”中，有 20 名通过干血斑检测被判定为“仅 anti-HBs 阳性”，因此被错误分类为“疫苗接种后状态”。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HBs</td>
			<td>310</td>
			<td>9</td>
			<td>其中四名未合并 HIV 感染的患者，其血清 anti-HBs 浓度为 11 ‑ 26 IU/l，该浓度过低，导致干血斑洗脱后无法检测到抗体。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBV DNA</td>
			<td>150</td>
			<td>7</td>
			<td>相应的血清来自 7 名血清 HBV DNA 浓度较低的患者，浓度范围为 409 IU/ml 至 3,643 IU/ml。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV</td>
			<td>339</td>
			<td>4</td>
			<td>这四份血清来自既往 HCV 感染早已恢复的患者。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV RNA</td>
			<td>150</td>
			<td>0</td>
			<td> –</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV 1-p24/anti-HIV 1/2</td>
			<td>209</td>
			<td>0</td>
			<td> –</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 根据本通讯中提出的方案，由全静脉血制备并处理的1,762份干血斑样本所得结果，与配对血清样本的检测结果作为参考进行比较。

干燥血斑（DBS）的制备与处理流程在大多数诊断应用中仍缺乏标准化。为克服这一不足，本文提出了一种全面的逐步操作方案，并进一步评估了该方案在检测病毒感染标志物方面的有效性。

一个世纪前，人们首次提出将血液采集于纸卡上，随后利用干燥血斑（DBS）进行诊断的构想。自那时起……

本实验的总体目标是提供一种标准化的方案，用于制备和处理干血斑，以便后续应用于免疫测定和分子检测技术。该流程首先采集毛细血管血液并将其转移至滤纸片上；第二步是将血斑在室温下过夜干燥，然后从滤纸片的圆圈区域打取直径六毫米的血斑小圆片。接下来，通过将干血斑打孔样本浸入缓冲液并在摇床上振荡至少四小时，以实现血液的洗脱。然后通过离心去除溶血性EITs中的碎片。最后一步是利用 commercially available 免疫测定法和分子技术，对澄清的EITs进行血清学和分子标志物分析，以检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及人类免疫缺陷病毒感染的相关指标。使用滤纸片采集血液样本的想法起源于一个世纪前。然而，即使在今天，初次使用该方法的人仍常常面临困难，因为几乎所有干血斑检测应用中的整个分析前阶段——包括干血斑的制备及其后续处理过程——尚未实现标准化。鉴于这一背景，我们提出了一套全面且标准化的分步操作流程，用于干血斑的制备与处理，以便后续应用于免疫测定和分子检测技术。该方法的可视化演示似乎至关重要，例如采集毛细血管血等步骤。确实如此。将血液转移至滤纸片或从血斑中制备合适的穿孔样本等操作不易掌握，因此，初次使用该技术的人员无疑将从可视化展示中获益。将由本实验室的一名技术人员通过皮肤穿刺法采集 Nico 手指的毛细血管血，以演示样本处理流程。所获得的血样将由本实验室从事分子生物学诊断工作多年的技师 Ko 进行处理。进行皮肤穿刺前，首先戴上一副一次性乳胶手套。皮肤穿刺前，患者应先温暖双手。按摩手指，特别是远端指骨的第三或第四指腹侧，以促进穿刺部位的血液流动。然后用合适的消毒剂清洁非执笔手的第三或第四手指远端指骨腹侧的皮肤，再使用一次性安全采血针进行穿刺。应将手指保持在有利于重力促进血液在指尖积聚的位置。用纱布垫擦去第一滴血液，因为它可能含有过多的组织液。再次按摩手指以增加穿刺部位的血流量，然后将下一滴血转移至滤纸片的其中一个圆圈内，注意不要让指尖直接接触滤纸表面。让下一个较大的毛细血管血滴在指尖形成，并将其收集到下一个圆圈中。继续此操作，直至所有必要的圆圈填满，或采集中途血流停止。仅依靠毛细作用力使血液被滤纸纹理充分吸收。如果血流量不足以填满滤纸卡上的所有指定圆圈，请勿过度挤压或按摩手指。若血流停止，应在指尖贴上创可贴，并在另一根手指上进行第二次皮肤穿刺以获取更多血液；为使血斑干燥，将滤纸卡置于生物安全柜内的干净纸巾上，让其自然干燥，最好在室温下过夜。在无任何外部热源的情况下，当干燥过程完成后，血斑呈现均匀的深棕褐色，不再有红色区域，方可用于储存。将滤纸片放入一个单独的、不透气的自封袋中，并在袋内放置一到两包干燥剂，以防止样本受潮。应尽快将此袋子转移至温度为零下20摄氏度或更低的冷冻冰箱中。若在野外条件下无法提供冷冻冰箱，则可在零下4摄氏度或甚至室温条件下保存，最长可保存14天。使用一次性6毫米打孔器，从每张浸有血液的Grade 903滤纸圆圈上打取一个血斑，将同一患者的所有 punched 干血斑转移至12孔板中的一个孔内，并用含有0.05%吐温-20和0.08%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液充满该孔。重复上述步骤，以获得第二组干血斑EITs，用于进行分子分析。然后将细胞培养板置于实验室摇床上，使穿孔的干血斑轻轻溶出，至少四小时，或最好过夜。次日，血斑几乎无血，已形成溶血上清液。将这些EIT转移至微量离心管中，随后以10,500 × g离心两分钟，以充分分离。在Ellucian离心后，含有已形成碎片的上清液现可直接用于后续预定分析。第一组EIT转移至杯中用于血清学检测，第二组则转移至微量管中用于PCR分析。使用市售检测试剂，严格按照各试剂制造商的说明书，检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的血清学标志物。最终，全自动分析仪将血清学检测结果直接显示在系统屏幕上。为评估本研究建议的干血斑样本制备与处理方案的有效性，首先对1,762份配对的血清与干血斑样本进行了乙型肝炎病毒表面抗原检测的对比分析。由于在阈值为每毫升0.05国际单位时，与Sarah获得的结果相比，56.2%的EITs呈反应性，这对应于乙型肝炎病毒表面抗原检测中14.7%的假阳性率，因此对该检测方案进行了修改。数据的受试者工作特征分析表明，在检测血清干血斑配对样本中乙型肝炎病毒表面抗原的存在时，将阈值提高至每毫升0.15国际单位，可实现乙型肝炎病毒表面抗原阳性与阴性样本的理想区分，仅出现两个不一致结果。两个假阴性结果的Sarah来自接受抗病毒治疗的患者。通过实时PCR对全血EITs进行HBV DNA的定性检测，其灵敏度为93%。因此，7份血清HBV DNA浓度较低的样本未被检出。仅从干血斑EITs中检出4个假阴性的抗HCV结果。相应的血清样本极有可能来自感染早已清除的患者。通过干血斑EIT检测HCV RNA的分析灵敏度达到100%，表明所采用的等温转录介导扩增技术在HCV RNA扩增中具有优异的灵敏度。使用全自动系统检测干血斑EIT中的抗HIV抗体，其分析灵敏度同样达到100%。本视频表明，即使使用相对较大的洗脱体积，且未对血清或血浆检测所建立的检测方案进行显著修改，目前仍可可靠地检测乙肝、丙肝和HIV感染的各种干血斑血清学和分子标志物。然而，所报告的结果也证实了干血斑技术的固有局限性。在某些情况下，该方案在研究药物与慢性传染病的试点阶段，于德国柏林和埃森市的534名现役药物使用者中进行了实地条件下的测试。所获得的结果导致了对六座其他德国主要城市的药物研究主阶段测试算法进行了小幅修改。

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