干血斑的制备与处理：在免疫测定和分子技术中的应用

本实验的总体目标是提供一种标准化方案，用于制备和处理干血斑，以便后续应用于免疫测定和分子检测技术。该流程首先采集毛细血管血液并将其转移至滤纸卡片上；第二步是将血斑在室温下过夜干燥，然后从滤纸卡片的圆圈区域打取直径六毫米的血斑 punches。

接下来，通过将干血斑打孔样本浸入缓冲液并在摇床上振荡至少四小时，以实现血液中分析物的洗脱。然后通过离心去除溶血性EIT样本中的碎片。最后一步是利用 commercially available 免疫分析方法和分子技术，对澄清的EIT样本进行血清学和分子标志物检测，以分析乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及人类免疫缺陷病毒感染情况。

使用滤纸片采集血液样本的想法起源于一个世纪前。然而，即使在今天，初次使用该方法的人仍常常面临困难，因为几乎所有干血斑检测应用中的整个分析前阶段——包括干血斑的制备和处理——尚未实现标准化。鉴于这一背景，我们提出了一套全面、标准化的分步操作流程，用于干血斑的制备与处理，以便后续应用于免疫分析和分子检测技术。

该方法的可视化演示似乎至关重要，因为一些步骤（如采集毛细血管血、转移到滤纸片或从血斑中制备合适的穿孔样本）较难掌握。因此，首次使用该技术的研究人员无疑将从直观的视频展示中获益。

将由本实验室的一名技术人员通过指尖采血的方式从 Nico 的手指采集毛细血管血，以演示样本处理流程。所获得的血样将由已在本实验室从事分子生物学诊断工作多年的技师 Ko 处理。进行皮肤穿刺前，首先戴上一副一次性乳胶手套。

皮肤穿刺前，患者应先温暖双手。按摩手指，特别是远端指骨的第三或第四指腹侧，以促进穿刺部位的血液流动。然后用合适的消毒剂清洁非书写手的第三或第四手指远端指骨指腹侧的皮肤，再使用一次性安全采血针进行穿刺。

应将手指保持在有利于重力促进血液在指尖积聚的位置。用纱布垫擦去第一滴血液，因为它可能含有过多的组织液。再次按摩手指以增加穿刺部位的血流量，然后将下一滴血转移至滤纸片的其中一个圆圈内，注意不要让指尖直接接触滤纸表面。

让下一个较大的毛细血管血滴在指尖形成，并将其收集到下一个圆圈中。继续此操作，直至所有必要的圆圈填满，或采集中途血流停止。仅依靠毛细作用力使血液渗入滤纸的纹理中。

如果血流量不足以填满滤纸卡上的所有指定圆圈，请勿过度挤压或按摩手指。若血流停止，应在指尖贴上创可贴，如检测需要更多血液以制备干燥血斑，则可在另一根手指上进行第二次皮肤穿刺。将滤纸卡置于生物安全柜内的洁净纸巾上，使其干燥，最好在室温下过夜。在无任何外部热源的情况下，当干燥过程完成后，血斑呈现均匀的深棕褐色，且不再可见任何红色区域，方可用于储存。

将滤纸片放入一个单独的、不透气的自封袋中，并在袋内放置一到两包干燥剂，以防止样本受潮。应尽快将此袋子转移至温度为零下20摄氏度或更低的冷冻柜中。若在野外条件下无法提供冷冻设备，则可在零下4摄氏度或室温下保存，最长可保存14天。

使用一次性6毫米打孔器，从每张浸有血液的Grade 903滤纸圆圈上打取一个血斑，将同一患者的所有 punched 干血斑转移至12孔板中的一个孔内，并用含有0.05%吐温-20和0.08%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）填充该孔。重复上述步骤，以获得第二组干血斑样本，用于后续分子分析。

然后将细胞培养板置于实验室摇床上，使穿孔的干血斑轻轻溶出，至少四小时，或最好过夜。次日，血斑几乎无血，已形成溶血上清液。将这些EIT转移至微量离心管中，随后以10,500 × g离心两分钟，以充分分离。

在Ellucian离心后，EITs中已形成的任何碎片的上清液现可直接用于后续预定分析。第一组EITs被转移至杯中用于血清学检测，第二组则转移至微量管中用于PCR分析。

使用市售检测试剂，严格按照各试剂制造商的说明，检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的血清学标志物。最终，全自动分析仪上的血清学检测结果将显示在系统屏幕上。所建议的干血斑制备与处理方案的有效性，首先通过对1,762份配对的血清与干血斑样本进行乙型肝炎病毒表面抗原检测分析予以评估。

由于在0.05 国际单位/毫升的临界值下，与Sarah获得的结果相比，56.2%的EIT检测结果呈反应性，这对应于乙型肝炎病毒表面抗原检测中14.7%的假阳性率，因此对该检测方案进行了修改。数据的受试者工作特征分析表明，在检测血清干血斑配对样本中乙型肝炎病毒表面抗原的存在时，将阈值提高至0.15 国际单位/毫升，可实现乙型肝炎病毒表面抗原阳性与阴性样本的理想区分，仅出现两个不一致结果。

这两个假阴性结果的Sarah来自接受抗病毒治疗的患者。通过实时PCR对全血EITs进行HBV DNA的定性检测，其灵敏度为93%。因此，7份血清HBV DNA浓度较低的样本未被检出。仅从干血斑EITs中检出4份抗HCV假阴性结果。

相应的样本很可能取自感染早已清除的患者。通过干血斑EIT检测HCV RNA的分析灵敏度达到100%，表明所采用的等温转录介导扩增技术在HCV RNA扩增中具有极佳的灵敏度。使用全自动系统检测干血斑EIT中的抗HIV抗体，其分析灵敏度同样达到100%。本视频表明，如今已能够可靠地检测乙型肝炎、丙型肝炎和HIV感染的血清学及分子标志物，即使使用相对较大的洗脱体积，且未对血清或血浆检测所建立的实验方案进行显著修改，仍可在干血斑样本中实现上述检测。

然而，所报告的结果也证实了干血斑技术的固有局限性。在某些情况下，该方案还在研究药物与慢性传染病的试点阶段，于德国柏林和埃森市的现场条件下对534名活性药物使用者进行了测试。

所获得的结果导致了对六座其他德国主要城市的药物研究主阶段测试算法进行了小幅修改。