Name: 静电纳米纤维支架与渐变的纤维组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学习静电纺丝技术制备具有梯度纤维组织的纳米纤维支架，使用聚己内酯聚合物调控细胞形态与取向。该方法为组织工程和再生医学研究提供了可重复的新方案。

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本工作部分得到了内布拉斯加大学医学中心启动资金和美国国立卫生研究院（资助号 1R15 AR063901-01）的支持。

1. 溶液的配制
<ol>
	<li>配制浓度约为 100 mg/ml 的聚(ε-己内酯) (PCL) (Mw = 80,000 g/mol) 溶液。将 PCL 溶于二氯甲烷 (DCM) 与 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 按 4:1 (v/v) 体积比组成的混合溶剂中，配制成 10% (w/v) 的溶液。</li>
	<li>将溶液置于 20 ml 玻璃试管中进行混合。将玻璃试管放入超声波清洗器中处理 30 分钟，直至溶液呈半透明状。</li>
</ol>
2. 仪器准备
<ol>
	<li>将制备好的PCL溶液加入一个装有21号平头针头的5 ml注射器中。</li>
	<li>根据图1，将注射泵置于垂直静电纺丝位置。</li>
	<li>使用带有2 cm × 5 cm开口区域的不锈钢间隙收集器，用于收集取向纤维基底。将收集器放置在距针尖12 cm处。</li>
	<li>将直流（DC）高压电源连接至针头，并将收集器接地。确保收集器单独接地，且不与其他实验设备接触。</li>
</ol>
3. 电纺丝
<ol>
	<li>将注射泵设定为 1.50 ml/hr，直至针尖形成的液滴在移除后立即被新液滴取代。然后将流速调至 0.50 ml/hr。</li>
	<li>将电压调节至 12 kV。</li>
	<li>继续静电纺丝，直至单向排列的纤维完全覆盖收集器上的间隙区域。</li>
	<li>在小块玻璃片边缘涂上胶水，将间隙收集器上的纤维转移至玻璃片上。将玻璃片放置在一块与玻璃片尺寸相同且已接地的铝箔上方。</li>
	<li>根据图3所示位置放置第二个注射器收集器。</li>
	<li>将塑料掩膜固定在第二个注射器泵上，并将其置于收集器上方 2 mm 处。</li>
	<li>若需实现纳米包封，则向 PCL 溶液中加入 1% (w/w) 的香豆素 6，并搅拌至溶液呈半透明状。</li>
	<li>将 PCL 或 PCL/香豆素 6 溶液装入带有钝头 21 号针头的 5 ml 注射器中。设定垂直泵流速为 0.50 ml/hr，水平方向以 9 ml/hr 或约 1 mm/min 的速度拉动。</li>
	<li>进行静电纺丝，直至掩膜几乎完全移出收集器区域，但边缘部分仍处于掩膜下方。</li>
</ol>
4. 纤维表征
<ol>
	<li>使用磁控溅射仪在40 mA条件下镀铂40秒，将样品用双面导电胶带固定在金属载物钉上。
	<ol>
		<li>根据我们之前的研究17,18，通过扫描电子显微镜（SEM）观察纤维。</li>
		<li>在加速电压为15 kV的条件下采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对单独的纤维样品进行快速傅里叶变换（FFT）分析，以测量纤维的取向性。有关通过FFT测量纤维取向性的详细信息可参考之前的研究19,20。</li>
</ol>
5. 接种干细胞。
<ol>
	<li>将纤维样品浸入70%乙醇溶液中2小时以进行灭菌，然后用蒸馏水清洗纤维以去除任何污染物。</li>
	<li>获取人脂肪来源间充质干细胞（ADSCs），并在37 °C、95%空气/5% CO2的条件下，于25 cm2培养瓶中进行细胞培养。每隔一天更换一次细胞培养基10。</li>
	<li>用胰蛋白酶消化细胞并计数。具体操作为：从细胞培养瓶中移除所有培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞两次。随后加入1 ml预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖细胞单层，并将培养瓶置于细胞培养箱中孵育2-3分钟。加入4 ml培养基，通过移液操作将细胞从表面完全冲洗下来。离心细胞悬液后，将细胞沉淀重新悬浮于培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数。将约1 × 104个细胞接种至置于35 mm培养皿中的纳米纤维支架上，分别培养3天和7天。</li>
	<li>使用荧光素二乙酸酯（5 mg/ml丙酮溶液）（FDA）对细胞进行染色，然后使用荧光显微镜观察样品。具体操作为：向培养皿中加入100 μl FDA溶液，孵育30分钟。在进行荧光成像前，用PBS清洗细胞三次。根据我们之前的研究10，使用定制的Matlab程序分析细胞取向。</li>
</ol>

<ol><li>Xie, J., Li, X., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+electrospun+nanofibers+to+work+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research.</a> Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).</li>
<li>Genin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+grading+of+mineral+and+collagen+in+the+attachment+of+tendon+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone.</a> Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).</li>
<li>Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+orientation+at+the+tendon+to+bone+insertion+and+its+influence+on+stress+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations.</a> J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).</li>
<li>Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+biomechanical%2C+structural%2C+and+compositional+properties+along+the+tendon+to+bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site.</a> J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).</li>
<li>Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+morphogenesis+of+the+tendon-to-bone+insertion+-+What+development+can+teach+us+about+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing.</a> Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).</li>
<li>Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+mineral+content+for+mimicking+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site.</a> Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).</li>
<li>Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+study+of+osteoblast+response+to+nanotopography+by+means+of+nanoparticle-density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients.</a> Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).</li>
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<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Aligned-to-random%27+nanofiber+scaffolds+for+mimicking+the+structure+of+the+tendon-to-bone+insertion+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site.</a> Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).</li>
<li>Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanofiber+scaffolds+with+gradations+in+fiber+organization+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications.</a> Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).</li>
<li>James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tendon+tissue+engineering%3A+adipose-derived+stem+cell+and+GDF-5+mediated+regeneration+using+electrospun+matrix+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems.</a> Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).</li>
<li>Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+in+functional+bone+tissue+engineering%3A+lessons+from+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).</li>
<li>Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+human+adipose+tissue-derived+stromal+cells+%28hASCs%29+in+a+porous+three-dimensional+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).</li>
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<li>Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stem+cells%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+embryonic+stem+cells+seeded+on+electrospun+nanofibers+into+neural+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages.</a> Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).</li>
<li>Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+nanofiber+scaffolds+with+different+orders%2C+structures%2C+and+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties.</a> ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+anisotropy+in+electrospun+tissue+engineering+scaffolds%3A+analysis+of+fiber+alignment+by+the+fast+Fourier+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform.</a> Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).</li>
<li>Ayres, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fiber+alignment+in+electrospun+scaffolds%3A+a+user%E2%80%99s+guide+to+the+2D+fast+Fourier+transform+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Poly.+Ed%22%5BJournal%5D)">Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach.</a> J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验方案中最关键的步骤是梯度支架的制备。覆盖在收集器上的掩膜必须以恒定速度移动，以确保纤维支架内部形成渐变结构。此外，正确配制PCL溶液也至关重要，以保证静电纺丝的成功。建议在静电纺丝前检查纤维的形貌，尤其是在包封香豆素-6之后，可能需要更高的电压才能实现正确的静电纺丝。
此外，该方案可实现纤维排列的离散梯度构建。然而，该方案所获得的支架厚度存在不均匀性，可能限制其在力学性能方面应用。纤维随机沉积增加的区域将比取向排列区域更厚。该方案也无法重现肌腱-骨连接处的化学成分。为成功模拟连接处天然的矿物质含量，需要构建矿物质梯度。具有矿物质成分梯度和结构排列梯度的纤维支架的制备将进一步被探索，以更好地复制肌腱-骨界面组织中的完整天然微环境。
目前，这是首个用于制备具有组织梯度的静电纺纳米纤维支架的实验方案。以往的研究虽已制备出包含随机排列和定向排列纤维的支架，但二者仅为两个独立区域，其间组织结构发生 abrupt 转变9。梯度结构可实现对细胞取向及其细胞外基质沉积的调控，从而有助于在整个组织构建物中形成梯度化的...

纳米纤维因其结构和相对尺寸能够模拟细胞外基质，已成为组织工程中广泛使用的一种工具1。然而，某些天然组织界面（如肌腱-骨连接处）含有胶原纤维，其组织结构具有可变性，在朝向肌腱方向排列逐渐趋于有序，而在骨组织部位则排列逐渐变得松散2-5。因此，为了实现有效的组织再生，有必要构建一种能够有效模拟这种结构梯度的支架。
此前，已有研究关注纤维成分的渐变，特别是矿物质含量的变化6。然而，对于结缔组织中结构成分的重建仍鲜有探索。早期一项研究通过分析表面二氧化硅颗粒密度对大鼠颅骨成骨细胞增殖的影响，探讨了形态梯度效应，发现二氧化硅颗粒密度与细胞增殖呈负相关关系7。但此前研究中影响细胞增殖的形态变化主要与表面粗糙度有关，缺乏模拟纤维排列变化的能力7,8。最近一项研究尝试利用新型静电纺丝集电极制备能够模拟独特胶原纤维取向的支架9。尽管该研究成功制备出同时包含取向排列和随机分布纤维的支架，却未能模拟天然组织中所呈现的渐变结构。此外，由于该支架在取向纤维与随机纤维之间存在 abrupt 转变，导致其生物力学性能显著下降。迄今为止，尚无研究能够成功制备出具有从取向到随机纤维取向连续梯度的可用纳米纤维支架。我们近期的研究已成功重建出具有纤维排列梯度的纳米纤维支架，有望模拟肌腱-骨连接处天然胶原的组织结构10。本研究旨在介绍用于制备此类纳米纤维支架的实验方案，其结构可高度模拟天然肌腱-骨组织界面中的纤维排列特征。
梯度纳米纤维结构在多个领域具有广泛的应用前景。我们重点研究了将此类支架与脂肪源性干细胞（ADSCs）结合，应用于肌腱-骨连接处的组织工程，这些干细胞已被用于多种基质上的组织再生11-14。此外，ADSCs在多向分化潜能方面与骨髓间充质干细胞非常相似，且来源丰富，可通过简单的抽脂手术获取15,16。将这些细胞接种于具有梯度结构的纳米纤维支架上，可通过控制细胞分布，进一步增强其在组织工程中的应用潜力，从而促进细胞向不同类型组织分化。除了接种干细胞外，还可将信号分子包载于纳米纤维中，以调控细胞反应。将纳米包封技术与支架的结构梯度相结合，有助于研究细胞行为，或用于设计新型植入物及其表面涂层。包载具有功能的分子（如骨形态发生蛋白2（BMP2）），已证实可诱导成骨细胞分化15,16，有望进一步提升这些支架在组织工程中的应用效果10。

<table><tbody><tr><td>聚己内酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Fisher Chemical</td><td>D-119-1</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Chemical</td><td>AC61093-1000</td><td></td></tr><tr><td>香豆素6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546283</td><td></td></tr><tr><td>脂肪来源干细胞</td><td>Cellular Engineering Technologies</td><td>HMSC.AD-100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-改良伊格尔培养基</td><td>Invitrogen</td><td>a10490-01</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>s25120a</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR international, LLC</td><td>101412-842</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-831-200</td><td>单通道注射泵</td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Branson</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>高压直流电源</td><td>Gamma High Voltage Research</td><td>ES30</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Nova 2300</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td></td></tr></tbody></table>

具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

本实验方案旨在介绍一种简便的方法，用于制备具有纤维排列梯度的纳米纤维支架，并测试其在调控细胞形态和取向方面的潜在应用。通过一种新型的制备装置，可实现对支架中纤维排列程度的渐进式调控。通过在单轴取向的电纺纤维膜上逐步减少随机电纺纤维的沉积时间，即可实现纤维排列方式的改变。通过在收集器上设置一个与纤维沉积方向同轴移动的屏障/掩模，可便捷地控制纤维的组织结构。在组织工程应用中，可将脂肪来源的干细胞接种于此类支架上。干细胞因其在不同组织结构区域的位置不同而发生形态学变化，并可能根据其所处位置分化为不同类型的细胞。此外，纤维的梯度排列增强了纳米纤维支架的仿生特性，使其更接近肌腱-骨连接处天然胶原纳米纤维的取向结构，优于传统支架。通过纳米包封技术，梯度纤维还为在纤维支架中构建化学梯度提供了可能，从而进一步增强其在细胞-材料相互作用高通量筛选及界面组织再生中的应用潜力。该技术不仅能够制备连续梯度的支架，还可通过控制移动屏障/掩模的离散运动，实现分步式纤维结构的制备。

通过该方案，制备出具有组织梯度的纤维膜。图3展示了在纳米纤维支架不同位置拍摄的扫描电镜（SEM）图像。从定性角度来看，可以观察到纤维排列从0 mm处的单轴取向（图3A）逐渐过渡到6 mm处的随机分布（图3D）。快速傅里叶变换（FFT）可对纤维取向提供定量分析，具体的定量分析方法详见文献19。在0 mm处的纤维其FFT结果表明纤维具有取向性，而在6 mm处的FFT图样则表明纤维呈随机排列。在扫描电镜图像中（图3），纤维结构从有序排列向越来越随机的沉积方式呈现出明显的渐变过程（图3B–C）。
ADSCs 根据其在纳米纤维支架中的位置发生了形态学变化。图 4 显示了使用荧光显微镜（Zeiss）在培养 3 天（图 4A–D）和 7 天（图 4E</st...

本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。

本实验方案旨在介绍一种简便的方法，用于制备具有纤维排列梯度的纳米纤维支架，并检测其潜在的……

这种制备技术可实现纤维排列具有梯度结构的纳米纤维支架的制备。梯度排列结构提升了纳米纤维支架在生物医学领域的应用价值。静电纺丝技术能够制备具有大比表面积的纳米级纤维支架。制备过程是将一种聚合物与挥发性溶剂混合，然后在高压作用下使该溶液以恒定速率通过注射器；高压使溶液带电，并在溶液从针尖释放时将其拉伸，从而形成干燥的纳米级聚合物纤维。这些纤维可通过多种方式收集，用于不同应用。在本实验方案中，我们将聚己内酯聚合物纺丝至一个间隙收集器上，以制备取向排列的纤维基底。然后，我们在随机沉积 PCL 纤维的同时，使用一个逐渐移动的掩模覆盖该基底。大家好，我叫 Carl Kalala，来自 Xing 博士的实验室。我们是内布拉斯加大学医学中心药学科学系及荷兰再生医学计划的研究人员。今天，我们将展示一种具有组织梯度结构的纳米纤维支架的制备方案。此外，我们还将通过纳米包封和干细胞接种，展示这些支架在生物医学领域的应用。首先，在处理可能具有危害性的化学品时，应确保穿戴适当的个人防护装备。该实验步骤的主要环节是配制浓度约为每毫升100毫克的聚己内酯（PCL）溶液。将聚己内酯溶解于二氯甲烷与二甲基甲酰胺的混合溶剂中，两种溶剂的体积比为4:1，总体积浓度为10%（重量/体积），持续搅拌直至溶液呈半透明、均匀且具有适当黏度。将PCL溶液加入一个带有21号钝针的5毫升注射器中。将单个注射泵置于垂直电纺丝位置，并使收集器直接位于注射泵接地端下方。确保收集器单独接地，且不与其他实验设备接触。为实现高效的纤维沉积，将注射泵设置为相对较高的流速，以对针头进行电纺前的预填充。运行泵直至针尖形成的液滴立即被替换。开始电纺时，将泵的流速设置为 0.5 毫升每小时。将电压调节器调至12千伏。注意：此高电压可能非常危险，应避免任何接近操作。使用针头时，我们采用非导电延伸装置来处理针尖或收集器上可能出现的任何堵塞或多余纤维。纤维应开始在收集器的间隙上形成。继续进行静电纺丝，直至制备出一层相对较厚的纤维膜。在收集器的间隙处，将胶水涂抹在小块玻璃片的边缘。平板的尺寸应略小于带有排列纤维的间隙收集器，以便有效去除支架。清除可能积聚在收集器前端的多余纤维。然后将收集器放置在玻璃上，使纤维膜与平板完全接触。轻拍支架，确保纤维与胶水直接接触。让支架静置，直至胶水完全干燥。胶水干燥后，小心地沿支架的粘合边缘进行切割，使一段取向纤维膜固定在玻璃板上。结果应与此类似，纤维支架在三个侧面固定，用于二次沉积。如果需要化学包封，加入Kumar和六。向PCL溶液中加入1%（质量分数）的浓度，混合至溶液均匀并呈现荧光绿色，用于梯度制备。将第二个注射泵垂直于第一个泵和收集器放置。将一个塑料遮罩连接到第二个注射泵上，并将其置于收集器上方约两毫米处。使用高流速对针头进行预处理。当纤维开始在收集器上方沉积时，将水平注射泵设置为以每小时九毫升的速度

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

静电纳米纤维支架与渐变的纤维组织

本文介绍了用于组织工程和细胞培养的聚合物电纺丝技术。具体描述了具有光反应性大分子单体的电纺丝过程，以及进一步的光图案化和多聚合物电纺丝加工能力。...

用于组织工程与细胞培养的电纺纤维聚合物支架

取向排列的静电纺丝纤维可引导神经元在体外的生长，是神经再生支架的潜在组成部分。本文描述了一种制备静电纺丝纤维基底以及在无血清条件下培养原代大鼠E15感觉（DRG）和运动神经元的方法。还包括通过免疫细胞化学对神经元进行可视化观察的技术。...

在电纺聚-L-乳酸纳米纤维支架上使用限定培养基培养初级运动神经元和感觉神经元

静电纺丝技术可用于制备多种组织工程或其他应用领域的纳米纤维支架。本文介绍了一种优化静电纺丝溶液和设备参数的实验步骤，以获得具有理想形貌和取向的纤维。同时提供了常见问题及相应的解决方法。...

静电纺丝基础：优化溶液与装置参数

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。...

组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

本方案结合静电纺丝与微球技术，构建可引导神经元生长的组织工程支架。将神经生长因子包裹于PLGA微球中，并将其静电纺丝至透明质酸（HA）纤维支架内。通过在支架上接种原代鸡背根神经节并培养4-6天，检测蛋白质的生物活性。...

电纺将生长因子释放微球融入纤维支架

报道了一种通过新设计的收集装置，由新型可生物降解聚合物聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）制备电纺长纤维并使其跨越更大沉积区域的合成与制备方法。这些纤维能够支持源自小鼠多能干细胞的细胞生长。...

聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

生物材料技术的进步使得三维多细胞类型结构的构建成为可能。我们已开发出静电纺丝方案，用于制备三种独立的支架，以培养气道的主要结构细胞，从而构建气道细支气管壁的三维体外模型。...

通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

本方案提供了通过熔体静电纺丝在直接书写模式下制备支架的全面指南。我们系统地概述了该过程，并定义了实现目标支架结构的适当参数设置。...

用于组织工程应用的可调控形貌三维聚(ε-己内酯)支架的熔融电纺写入制备

本文演示了一种通过减压亚临界CO2流体，将传统的二维（2D）静电纺丝纳米纤维膜扩展为三维（3D）支架的技术。这些增强型支架具有三维结构，能够紧密模拟细胞的纳米级拓扑结构信号，并保持封装在纳米纤维内生物分子的功能。...

二维静电纺纳米纤维膜扩展为三维支架

学习静电纺丝技术制备具有梯度纤维组织的纳米纤维支架，使用聚己内酯聚合物调控细胞形态与取向。该方法为组织工程和再生医学研究提供了可重复的新方案。

具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

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