Name: 从人类诱导多能干细胞使用小分子调制分化和随后的葡萄糖饥饿高度纯化心肌推导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 了解利用小分子调控分化结合葡萄糖饥饿法从人诱导多能干细胞高效纯化心肌细胞的技术流程。该方法可建立高纯度心肌细胞群，适用于心血管疾病体外建模及高通量药物筛选研究。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHBI，项目号 U01 HL099776-5）、NIH 院长新创新者奖（DP2 OD004411-2）、加州再生医学研究所（RB3-05129）、美国心脏协会（14GRNT18630016）以及来自卢西尔·帕卡德儿童基金会和斯坦福大学儿童健康研究所的捐赠教职学者奖（授予 SMW）的支持。我们还感谢美国心脏协会博士前奖学金（13PRE15770000）以及美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目（DGE-114747，AS）提供的经费支持。

注意：本实验方案中使用的所有试剂的供应商信息均已列在表1和材料清单中。所有与细胞接触的溶液和设备必须无菌，并应相应地采用无菌操作技术。除非另有说明，所有细胞培养孵育均应在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中进行。在本方案中，所有分化操作均在6孔板中进行，hiPSCs被接种于其中。完成分化和纯化后，细胞可被解离并重新接种，用于后续实验。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>对于 E8 培养基，为每种培养基组分（NaHCO3、L-抗坏血酸-2-磷酸、亚硒酸钠、转铁蛋白、胰岛素、FGF2、TGFB1）分别配制储存液，并将储存液保存于 -20 °C。将适量储存液加入 DMEM/F12 培养基瓶中，过滤除菌。储存液组分及 E8 培养基的溶液浓度与反应体系设置详见表 1。</li>
	<li>对于细胞外基质溶液，于 4 °C 过夜解冻基底膜基质（通常浓度为 10 mg/ml）。Matrigel 常用于多能干细胞培养，因为人类多能干细胞可通过 α-6-β-1 整合素很好地黏附于该材料9。解冻后，使用预冷的枪头和离心管在冰上分装成每份 2.25 mg（250 µl），并保存于 −80 °C。
	<ol>
		<li>使用细胞外基质溶液（ECMS）预包被培养板时，于冰上解冻并分装 ECMS。在冰上按 1:200 的比例将 ECMS 与预冷的 DMEM/F12 培养基混合。保持低温以防止 ECMS 过早凝固。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于不含胰岛素的 RPMI/B27 培养基，将 10 ml B27 无胰岛素添加剂加入 500 ml RPMI 培养基中。</li>
	<li>对于含胰岛素的 RPMI/B27 培养基，将 10 ml B27 补充剂（含胰岛素）和 5 ml 青霉素-链霉素抗生素加入 500 ml RPMI 培养基中。</li>
	<li>对于低葡萄糖培养基，将 10 ml B27 补充剂和 5 ml 青霉素-链霉素抗生素加入 500 ml 无葡萄糖 RPMI 培养基中。</li>
	<li>对于冻存培养基，按 9:1 的比例将胎牛血清与二甲基亚砜（DMSO）混合。冻存培养基可在 4 °C 保存最多 1 个月。 
	注：所有培养基均需过滤后保存于 4 °C，并在 2 周内使用，除非另有说明。以下所用所有试剂/溶液的体积均针对 6 孔板中的单个孔，除非另有说明。</li>
</ol>
2. 使用ECMS预包被6孔板
<ol>
	<li>通过将基底膜基质（例如，Matrigel）与预冷的DMEM/F12培养基按1:200的比例混合制备ECMS，然后将2 ml新鲜配制的ECMS加入6孔板的每个孔中。6孔板的每孔将含有约90 mg ECMS。</li>
	<li>将包被ECMS的培养板在37 °C孵育1小时。在接种细胞前立即吸除每个孔中的DMEM/F12溶液。此时培养板即可用于接种细胞。</li>
</ol>
3. 解冻冻存的 hiPSCs
注意：请严格遵循本操作步骤，因为这可能有助于在冻融循环后实现人诱导多能干细胞（hiPSCs）的最佳培养，并促进其向人心肌细胞（hiPSC-CMs）的下游分化。
<ol>
	<li>为每孔6孔板准备一管hiPSCs解冻。每个冻存管对应准备一个15 ml锥形管，内含9 ml添加ROCK抑制剂（10 μM）的冷E8培养基。ROCK抑制剂可提高hiPSCs在冻存后的存活率10。将冻存管置于37 °C水浴中解冻，直至管内仅剩约5 mm直径的冰晶。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒冻存管外表面，并用纸巾擦拭后转移至无菌超净台中。</li>
	<li>将细胞转移至已准备好的锥形管中。用500 μl E8培养基冲洗冻存管一次，并将含有解冻细胞的冲洗液一并转移至同一锥形管中。在室温下以200 × g离心4分钟。</li>
	<li>离心后吸除上清液，用2 ml含ROCK抑制剂（10 μM）的E8培养基轻柔重悬细胞沉淀。将重悬的细胞接种至预先包被ECMS的6孔板中的一个孔内。</li>
	<li>培养24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的E8培养基。此时细胞应已贴壁。</li>
</ol>
4. hiPSCs 的传代
<ol>
	<li>通常在6孔板中hiPSCs达到75%-80%融合度后进行传代。吸除培养基，用1 ml无菌室温&#160;PBS快速洗涤各孔，随后吸除PBS。
	<ol>
		<li>加入500 μl 0.5 mM EDTA或1x细胞解离溶液（例如，Accutase），在室温下孵育1-7分钟。EDTA孵育的合适时间因hiPSC细胞系而异。当观察到细胞集落边缘出现明显的卷曲或增厚时，表明EDTA或细胞解离溶液已发挥作用，可进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除EDTA或细胞解离溶液，加入1 ml添加了10 μM ROCK抑制剂的E8培养基。使用P1000移液器反复吹打并喷射细胞集落，使其从孔底脱离。操作完成后，细胞集落应被分散为含5-10个细胞的小团块。</li>
	<li>将悬浮于1 ml含ROCK抑制剂E8培养基中的细胞集落转移至15 ml锥形管中。</li>
	<li>在E8培养基中将较大的细胞团块进一步分散为较小的团块。根据细胞密度和待接种的孔数，加入适量含抑制剂的E8培养基对细胞悬液进行稀释。理想情况下，单个80%融合度的hiPSC孔应按1:12比例稀释。
	<ol>
		<li>向上述15 ml锥形管中已有的1 ml细胞悬液中加入11 ml含ROCK抑制剂的E8培养基，以获得1:12的稀释比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进一步吹打细胞团块，使其成为更小的细胞片段（每个片段含约50-200个细胞为宜）。注意避免过度吹打，以免降低细胞存活率。</li>
	<li>吸除预先包被板中的ECMS，每孔加入2 ml重悬的细胞悬液。对于6孔板，每孔约100,000个细胞为理想接种量。加样时应尽量均匀分布于孔内，避免细胞聚集在孔中央。</li>
	<li>培养24小时后，更换为不含ROCK抑制剂的E8培养基。此后每24小时更换一次培养基，直至细胞再次达到80%融合度，即可进行下一次传代。通常两次传代之间需要3-6天以达到80%融合度。</li>
</ol>
5. 冻存 hiPSCs
注意：请严格遵循本操作步骤，因为这可能有助于在冻融循环后实现hiPSC的最佳培养，并高效地将其下游分化为hiPSC-CMs。
<ol>
	<li>用细胞系名称、细胞类型、传代次数和冻存日期标记冻存管。一般建议每孔板（6孔板）使用一个冻存管。准备一个15 ml离心管，加入9 ml含ROCK抑制剂（10 μM）的E8培养基。配制冻存液（90% FBS和10% DMSO），并在使用前将冻存液置于4 °C保存。</li>
	<li>吸除培养基，加入500 μl 0.5 mM EDTA或1×细胞解离液，在室温下孵育2–7分钟。EDTA或细胞解离液的作用时间因细胞系而异。</li>
	<li>吸除EDTA或细胞解离液，加入1 ml E8培养基。</li>
	<li>使用移液器反复吹打，使hiPSC集落从孔中脱落，并用P1000移液器喷洗集落。集落不应被打散成小于100个细胞的团块。将悬浮细胞转移至预先准备好的含E8培养基的离心管中，在室温下以200 × g离心4分钟。</li>
	<li>吸除上清液，向细胞沉淀中加入500 μl预冷的冻存液。轻轻吹打1–2次使细胞重悬。保持细胞形成较大团块有助于提高细胞存活率。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至已标记的冻存管中。迅速将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中，以实现逐步降温。将装有细胞的冻存盒置于-80 °C环境中24小时，随后将细胞转移至液氮中进行长期保存。</li>
</ol>
6. 人类iPSC的心脏分化
注意：添加的所有培养基均应至少达到室温。
<ol>
	<li>使用EDTA或1×细胞解离溶液解离后，将约100,000个人类iPSC接种于ECM包被的6孔培养板中进行分化（操作步骤与细胞传代相同）。当细胞融合度达到85%时，更换为不含胰岛素的RPMI/B27培养基，并添加6 µM GSK3-β抑制剂CHIR99021（CHIR），继续培养48小时。</li>
	<li>48小时后，移除含CHIR的培养基，更换为不含胰岛素的RPMI/B27培养基，静置培养24小时（至第3天）。</li>
	<li>第3天，更换为含5 µM Wnt抑制剂IWR1的不含胰岛素RPMI/B27培养基，继续培养48小时（至第5天）。 
	注意：也可使用其他小分子化合物实现Wnt通路抑制，如先前研究中所述11。相较于其他小分子Wnt抑制剂，选择IWR1的原因在于其已被证实可在更宽的浓度范围内有效抑制Wnt信号通路11。</li>
	<li>第5天，将培养基更换回不含胰岛素的RPMI/B27培养基，继续培养48小时（至第7天）。</li>
	<li>第7天，更换为含胰岛素的RPMI/B27培养基，此后每3天更换一次该培养基。心肌细胞的自发搏动通常在第8至第10天首次出现。</li>
</ol>
7. 通过葡萄糖饥饿法纯化人心肌细胞
<ol>
	<li>分化后第10天，将6孔板每孔中的培养基更换为2 ml低糖培养基，并在此培养基中继续培养细胞3天（至第13天）。</li>
	<li>第13天，将细胞重新换回RPMI/B27培养基（含胰岛素）。</li>
	<li>可选：在第二轮葡萄糖饥饿处理前对心肌细胞进行传代，有助于使非心肌细胞从培养板上松脱，从而在葡萄糖饥饿过程中更易于去除非心肌细胞。
	<ol>
		<li>第13天，吸除培养基，用PBS洗涤一次，然后加入500 μl细胞解离酶，在37 °C下孵育5分钟以将细胞解离为单细胞。具体操作：酶处理5分钟后，使用1,000 µl移液器手动解离6孔板上的心肌细胞，通过反复吸取细胞解离酶并喷射至心肌细胞单层表面，实现机械解离。可能需要重复吹打多达30次，才能将心肌细胞完全解离为单细胞状态。</li>
		<li>待细胞完全解离成单细胞后，将所有细胞收集至含有5 ml含胰岛素RPMI/B27培养基的15 ml锥形管中，以稀释细胞解离酶，随后在200 × g条件下离心4分钟。吸除并弃去上清液。</li>
		<li>用2 ml RPMI/B27培养基重悬细胞，接种至新的ECMS包被的6孔板中。通常，较高的心肌细胞汇合度有助于提高传代过程中的细胞存活率。建议每孔新6孔板接种200万个细胞，以获得最佳的传代存活效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第14天，将培养基再次更换为2 ml低糖培养基，开始第二轮葡萄糖剥夺周期。在此低糖条件下继续培养细胞3天。大多数非心肌细胞将在该低糖培养条件下死亡。</li>
	<li>第17天，将培养基更换为2 ml含胰岛素的RPMI/B27培养基。此时剩余的细胞即为高度纯化的心肌细胞。这些心肌细胞可用于基因表达分析、药物筛选、代谢分析以及多种其他下游实验。</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+And+Development%22%5BJournal%5D)">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+de+novo+cardiomyocytes%3A+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争利益。

获得大量高纯度的由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞，对于基础心脏研究以及临床和转化应用均至关重要。近年来，心脏分化方案取得了巨大改进，已从基于拟胚体并利用心源性生长因子的方法2，发展到基质夹心法12，最终演进为小分子调控的单层培养方法5。在上述各种方案中，本文所述方案通过使用小分子CHIR和IWR调控Wnt/β-catenin信号通路，对不同hiPSC细胞系均表现出最高且最可重复的心脏分化效率5,7。具体而言，未分化的hiPSC首先通过GSK3-β抑制剂CHIR诱导中胚层分化，随后使用Wnt信号抑制剂IWR1促进心脏分化。这些Wnt信号通路调控的连续步骤，结合心脏谱系诱导阶段的胰岛素去除，实现了高效的心脏分化。CHIR是一种常用于中胚层诱导的GSK3-β小分子抑制剂，但其他GSK3-β抑制类小分子也已在心肌细胞分化方案中得到测试11。在后续的Wnt小分子抑制剂选择上也有多种替代方案。例如，近期一篇专注于化学成分明确条件下将多能干细胞分化为心肌细胞的研究报道，采用2 µM Wnt-C59实现有效的Wnt信号抑制和心脏中...

由于需要进行侵入性心脏活检、难以解离为单个细胞以及体外培养时细胞长期存活率差，原代人类心肌细胞难以获取。鉴于原代人类心肌细胞的缺乏，患者特异性的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）技术已被视为基础研究以及疾病建模和药物发现等临床与转化应用中强有力的心肌细胞替代来源1。早期将多能干细胞分化为心肌细胞的研究采用的是拟胚体（EB）分化方案，但该方法在心肌细胞生成方面效率较低，因为拟胚体中跳动的心肌细胞通常不到25%2,3。相比之下，使用细胞因子activin A和BMP4的单层培养分化方案比拟胚体法效率更高，但该方案仍相对低效，需要昂贵的生长因子，且仅适用于少数几种人类多能干细胞系4。最近，通过调控Wnt/β-Catenin信号通路，开发出一种高效、基于hiPSC单层培养的心肌细胞分化方案5。这些hiPSC-CM表达心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白，这两种肌节蛋白是心肌细胞的标准标志物6。本文所述方案即基于该小分子诱导、无饲养层细胞、单层分化方法的改进版本5,7。我们可在7–10天后获得跳动的心肌细胞（图1）。然而，在心肌细胞分化后获得约50%跳动细胞的情况下，免疫染色结果持续显示存在一群不表达心肌细胞特异性标志物（如心肌特异性肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白）的非心肌细胞。为进一步纯化心肌细胞并清除非心肌细胞，将异质性的分化细胞群体置于极低葡萄糖培养基中进行多天的葡萄糖饥饿处理（图2）。该处理可选择性地清除非心肌细胞，原因是心肌细胞能够在低葡萄糖环境中利用乳酸作为主要能量来源以维持生存，而非心肌细胞则不具备此代谢能力8。经过此纯化步骤后，心肌细胞与非心肌细胞的比例提高了40%（图3、图4），这些细胞可用于后续的基因表达分析、疾病建模及药物筛选实验。

<table><tbody><tr><td>Matrigel（9-12 mg/ml）</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖 RPMI 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>B27（不含胰岛素）</td><td>Invitrogen</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂（含胰岛素）</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素抗生素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>BenchMark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Thermo Fisher</td><td>508306</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Sigma</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮</td><td>Fisher</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Fisher（NUNC 管）</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶</td><td>Invitrogen</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为重要的细胞来源，用于解决基础研究和转化应用中缺乏原代心肌细胞的问题。为了将hiPSCs分化为心肌细胞，研究人员已开发出多种方案，包括基于拟胚体（embryoid body, EB）的分化方法和生长因子诱导法。然而，这些方法在生成纯化心肌细胞的效率方面较低，且结果变异性高。近期，一种基于小分子、通过调控Wnt/β-Catenin信号通路的分化方案被证明可高效促进心脏分化。采用该方案， consistently 观察到超过50%–60%的分化细胞为心肌肌钙蛋白阳性的心肌细胞。为进一步提高心肌细胞纯度，利用心肌细胞与非心肌细胞之间的代谢差异，对分化细胞实施葡萄糖饥饿处理，以特异性清除非心肌细胞。通过这一筛选策略，我们在分化细胞群体中心肌细胞与非心肌细胞的比例 consistently 提高了30%以上。这些高度纯化的心肌细胞应能增强基于人iPSC的研究结果的可靠性 体外 疾病建模研究和药物筛选实验。

hiPSC 分化过程中的形态学变化。
在无饲养层培养板中培养的hiPSC以扁平的二维集落形式生长。当细胞融合度达到约85%时，使用6 µM CHIR处理hiPSC以诱导分化（图1A）。CHIR处理24小时后，观察到大量细胞死亡，这是一种正常且常见的现象。经过两天的CHIR处理后，hiPSC继续向中胚层命运分化。与hiPSC集落中的细胞相比，第2天细胞的细胞体积增大，并通过细胞分裂使细胞数量增加（图1B）。在第5天，中胚层细胞被引导进入心肌谱系（心脏中胚层）。此时，细胞开始聚集并形成特征性的树枝状结构（图1C）。到第10天，树枝状结构变得非常明显，心肌细胞开始自发搏动（图1D）。终末分化的心肌细胞在此之后不再增殖。分化方案的时间线见图2。
免疫染色和流式细胞术结果表明，通过葡萄糖饥饿法可实现心肌细胞的纯化。</s...

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为解决原代心肌细胞来源不足的重要细胞资源……

本实验的总体目标是获得高纯度的人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞。首先，将人诱导性多能干细胞在单层细胞培养体系中培养至约85%汇合度。随后加入一种可激活Wnt细胞信号通路的小分子化合物，细胞继续孵育两天，以诱导中胚层的形成。接下来，向细胞中加入一种抑制 Wnt 细胞信号通路的小分子化合物，以诱导心源性中胚层的分化。随后，细胞继续培养两天。到第 7 天时，已分化的心肌细胞开始搏动，将这种异质性的分化细胞群体置于低葡萄糖细胞培养基中继续培养，以选择性地纯化心肌细胞。最后，在光学显微镜下对细胞进行肉眼观察，并通过流式细胞术分析，以确认获得高纯度的搏动型心肌细胞群体。该技术相较于其他利用小分子的心肌细胞分化方案的主要优势在于，其额外采用了葡萄糖剥夺步骤。这使得我们能够纯化出可利用葡萄糖以外的其他能源物质进行细胞能量代谢的心肌细胞。可从该异质性分化细胞群体中选择性地去除非心肌细胞。随后，心肌细胞可用于后续应用，例如体外疾病建模或高通量药物筛选。实验前准备：使用细胞外基质溶液（ECMS）包被六孔板，并按照随附文本所述方法解冻一管冻存的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）。离心后，将冻存细胞用含ROCK抑制剂的E八培养基重悬。然后将冻存管中的细胞转移至预先包被ECMS的六孔板中的一个孔内。将细胞置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中培养。24 小时后，细胞将已贴壁。用不含 ROCK 抑制剂的 E 八培养基替换原培养基。继续培养细胞，并每天更换 E 八培养基。当 HI PSCs 达到 75% 至 80% 汇合度时，即可进行传代。迅速吸除培养基。用一毫升无菌室温 PBS 洗涤孔板，随后吸除 PBS。然后加入 500 µL 的 0.5 mM EDTA 或其他细胞解离溶液。在室温下孵育 1 至 7 分钟，使用显微镜观察，当可见菌落边缘出现卷曲或增厚时即表明细胞开始解离，随后吸除细胞解离溶液。接着加入 1 mL 含 10 µM ROCK 抑制剂的 E8 培养基，使用 P1000 移液器反复吹打，彻底将 H-iPSC 菌落从培养板上解离下来，形成 5 至 10 个细胞团块。然后将悬液转移至15毫升锥形管中，以进一步分散较大的细胞团块。用移液器反复吹打，直至形成较小的细胞团块，如图所示。随后，在1毫升细胞悬液中加入11毫升含ROCK抑制剂的E8培养基，将细胞按1:12比例稀释。接下来，从预编码的孔板中吸除ECMS。向各孔中加入2毫升重悬的细胞，每孔约100,000个细胞，六孔板每孔接种100,000个细胞为理想数量。加样时应尽量将细胞均匀分布于孔内，避免细胞聚集在孔中央。将孔板放入培养箱中培养24小时。次日，将培养基更换为不含ROCK抑制剂的E八培养基。每隔24小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到80%。通常情况下，细胞在经EDTA或一倍Xcel解离溶液解离后三至六天即可再次传代。将约100,000个人源iPSCs接种于ECMS包被的六孔培养板中，用于分化。当细胞达到85%融合度时，参照HI PSCs的相同操作步骤，更换为不含胰岛素但含有六微摩尔GSK3β抑制剂CHIR 99021的RPMI/B27培养基。将细胞培养48小时，每天在显微镜下观察细胞状态。CHIR 处理 24 小时后可观察到大量细胞死亡。这种情况是正常的，在处理两天后常可见到。人诱导性多能干细胞（HIPS）的大小和数量增加，并继续向中胚层命运分化。将含有 CHIR 的培养基更换为 RPMI-B27 含胰岛素培养基，并培养至第3天。在第3天，将培养基更换为不含胰岛素的 RPMI-B27 培养基，加入5 µM 的 Wnt 抑制剂 IWR-1，继续培养细胞48小时。第五天，在显微镜下观察细胞。中胚层细胞应已定向分化为心肌谱系，并开始聚集形成特征性的分支样结构。将培养基更换为不含胰岛素的RPMI B27，继续培养细胞48小时。第7天。此后每三天用含胰岛素的RPMI-B27培养基更换一次培养液，在第8至第10天之间也更换为相同的培养基。心肌细胞分化10天后将出现自发性搏动。超过50%的细胞区域出现搏动。然而，搏动的心肌细胞片可能与非心肌细胞相互混杂；到第10天，分支样结构将变得非常明显。终末分化的心肌细胞在此之后将不再增殖。在第10天，即分化后，将六孔板中每孔的培养基更换为2毫升低糖培养基，并在此培养基中维持细胞培养至第13天，共三天时间。在第13天，将细胞重新置于含胰岛素的RPMI-B27培养基中，或可选地更换为用于细胞复壮的培养基，以促进非心肌细胞在葡萄糖饥饿条件下的解离。吸弃培养基，用 PBS 洗涤一次。加入 500 µL 细胞解离酶，将细胞孵育 5 分钟。酶处理 5 分钟后，使用 P1000 移液器通过上下吹打最多 30 次，将心肌细胞机械分散为单细胞悬液，细胞解离后转移至 15 mL 圆锥管中。加入5 mL含胰岛素的RPMI-B27培养基以稀释细胞解离酶，随后在200 ×g条件下离心4分钟。离心后吸除并弃去上清液。然后将细胞重悬于2 mL RPMI-B27培养基中，并接种至新的ECMS包被的六孔板中。通常，细胞存活率随汇合度增加而提高，以实现最佳的细胞存活。每六孔板每孔重新悬浮 200 万细胞，用于未重新接种的细胞。第 14 天，将培养基更换为 2 毫升低糖培养基，以进行第二次葡萄糖剥夺循环培养。使细胞在此低糖状态下继续培养 3 天。大多数非心肌细胞将在第17天死亡。将培养基更换为2毫升含胰岛素的RPMI-B27。剩余细胞将为高纯度心肌细胞。这些细胞可用于基因表达分析、药物筛选、代谢分析以及多种其他下游检测，以在通过葡萄糖饥饿法进行分化和纯化后评估心肌细胞的纯度。利用针对心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，CTNT）的免疫染色对细胞进行表征。对未纯化的分化细胞群体进行免疫荧光显微镜观察显示，在第13天时，尽管许多细胞呈CTNT阳性（绿色显示），但仍有大量细胞不表达CTNT，提示存在非心肌细胞。相比之下，在第10天开始进行为期三天的葡萄糖饥饿处理后，至第13天时几乎所有细胞均呈CTNT阳性，表明经葡萄糖饥饿处理后心肌细胞得到了有效纯化。这些数据进一步通过流式细胞术分析得到了证实。如红色所示，未经历葡萄糖饥饿的细胞中约有 50% 为 TN NT2 阳性，而经历葡萄糖饥饿的细胞中约有 90% 为 TN NT2 阳性。观看本视频后，您应能充分理解如何将人诱导性多能干细胞分化为高度纯化的心肌细胞群体。这些纯化细胞可大规模制备，适用于多种后续体外应用。在培养多能干细胞时，需注意：在进行传代前，切勿让细胞生长至完全汇合。某些干细胞系在初始多能干细胞的融合度低于85%时分化效果最佳。最后，某些干细胞系可能对葡萄糖剥夺步骤反应更快或更强烈。在使用新的干细胞系之前，务必始终监测这些参数。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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了解利用小分子调控分化结合葡萄糖饥饿法从人诱导多能干细胞高效纯化心肌细胞的技术流程。该方法可建立高纯度心肌细胞群，适用于心血管疾病体外建模及高通量药物筛选研究。

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