Name: 同步新月柄杆菌对细菌细胞周期的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解新月柄杆菌细胞同步化方法，通过密度梯度离心分离游动细胞，建立同步培养体系。该技术可快速获得足量细胞用于生化检测和显微镜观察，为研究细菌细胞周期调控机制提供重要工具。

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作者感谢Shapiro实验室成员和Erin Schrader对本文手稿提出的建议。作者感谢以下资助：JMS获得美国国立卫生研究院（NIH）博士后基金F32 GM100732；LS获得NIH基金R01 GM51426和R01 GM32506。

1. 大规模同步化——适用于蛋白质印迹、微阵列/RNA测序及其他需要大量材料的检测方法
<ol>
	<li>从冻存菌种或平板中接种，培养5 ml&#160;在 PYE 培养基中于 28 °C 摇床培养 NA1000 菌株过夜。</li>
	<li>接种步骤1中0.5 ml的细胞&#160;在25 ml M2G（表1-2）中于28 °C振荡培养，直至菌液达到OD600 介于 0.5 和 0.6 之间。</li>
	<li>将细胞接种至1 L M2G培养基中，在28 °C下振荡培养。</li>
	<li>一旦 OD600 达到0.5至0.6时，使用液体封片相差显微镜确认游动细胞的存在。取1 µl&#160;将细胞置于载玻片上，加盖盖玻片，通过相差显微镜观察成像。通过观察群体中快速游动的细胞，确认游动细胞的存在。</li>
	<li>在JA-10转子中，4 °C、7 k × g离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入180 ml冷M2培养基（表1-2），用血清移液管轻轻重悬所有细胞。弃去沉淀松散的细胞，这些是分裂前且具菌柄的细胞。</li>
	<li>加入60 ml冷的胶体二氧化硅溶液（加入前务必充分混匀胶体二氧化硅悬液），并充分混匀细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液分装至八个30 ml离心管中，在JA-20转子中于4 °C、6.4 k × g条件下离心30分钟。 
	注意：应观察到两条 distinct 的条带；游动型细胞位于下方条带，而带柄细胞/分裂前细胞位于上方条带图&#160;1B).</li>
	<li>小心吸去上层条带，移除液体至距游动细胞条带（下层条带）约1 cm处。</li>
	<li>（关键步骤）使用巴斯德吸管小心移除游动细胞带，转移至一支洁净离心管中。为去除胶体二氧化硅，加入预冷的M2培养基至管满，随后在JA-20转子中以6.4 k × g于4 °C离心10分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液，将细胞重悬于20 ml预冷的M2溶液中，在4 °C条件下使用JA-20转子以6.4 k × g离心10分钟。</li>
	<li>将所有沉淀重悬于30 ml冷M2培养基中，并测定OD值600 使用分光光度计测定，并以冷M2培养基作为空白对照。保留1 µl&#160;进行相位成像以检测游动细胞；90–95% 的细胞应为游动细胞。</li>
	<li>在4 °C、JA-20转子6.4 k × g条件下离心5 min。将细胞重悬于28 °C的M2G培养基中，使A600 约为0.3–0.4，并在28 °C开始振荡培养。 
	注意：通常每1升不同步细胞可获得30至60 mL的游动细胞培养物。</li>
	<li>开始记录时间点（野生型培养物分裂大约需要135–140分钟） 8,9在每个时间点，测定OD值600. 检查 OD600 分裂后约为初始OD的2倍600.</li>
	<li>在所需时间点取1 mL培养物，于台式离心机中以最大速度离心30秒，迅速倾倒或抽去上清液，将细胞沉淀在液氮中快速冷冻。将细胞保存于-80 °C，直至进行后续分析。</li>
</ol>
2. 小规模同步化——适用于显微镜观察的最佳方法
<ol>
	<li>从冻存菌种或平板中接种，于 M2G 培养基中在 28 °C 下振荡培养 5 ml 过夜培养物。</li>
	<li>将过夜培养物按 1:3 比例稀释至 15 ml M2G 培养基（见表 1-2），继续培养至对数中期（OD600 = 0.5–0.6）。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用 JA-20 转子以 6.4 k × g 离心 10 分钟&#160;，弃上清，用 1 ml 冰冷的 M2 培养基（见表 1-2）重悬菌体，转移至 2 ml 微量离心管中。</li>
	<li>在微量离心管中以 15 k × g 离心 3 分钟收集菌体，吸除上清，将菌体沉淀置于冰上，用 900 µl&#160;冰冷的 M2 培养基重悬。</li>
	<li>加入 900 µl&#160;冰冷的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的胶体二氧化硅溶液，在微量离心管中于 4 °C 以 15 k × g 离心 20 分钟&#160;。</li>
	<li>（关键步骤）小心吸除或用移液器移走上层的有柄/前分裂细胞条带，收集底部的游动细胞条带至新的微量离心管中。</li>
	<li>用 1 ml 冰冷的 M2 培养基洗涤游动细胞两次，每次在 15 k × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>最后一次离心前，将细胞转移至预冷的 1 ml 玻璃试管中，以 M2 培养基为空白对照，测定细胞的 OD600 值。</li>
	<li>将最终的细胞沉淀重悬于 28 °C 的 M2G 培养基中，使 OD 值介于 0.3–0.4 之间，并在 28 °C 下振荡或滚动培养细胞。 
	注意：通常可获得 2 至 4 ml 的游动细胞培养物。</li>
	<li>进行显微镜实验时，在预定时间点取 1 µl&#160;细胞样品滴加至 M2G 琼脂糖垫上，用于成像。</li>
</ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细菌细胞周期是生命的基本过程，对于生长研究以及作为下一代抗生素的作用靶点具有重要意义。本文详细介绍了模式生物——C. crescentus NA1000 的快速同步化操作步骤，该生物常用于研究细菌细胞周期和不对称细胞分裂。该方法适用于蛋白质印迹（western blot）、基因表达谱分析以及荧光显微镜检测，以研究细菌细胞周期在时空上的调控机制。
该方案快速，可获得健康的同步化细胞。其他同步化方法需要长时间的细胞饥饿处理，并依赖严紧反应将细胞周期阻滞在相同阶段，从而导致细胞状态与对数生长期的培养细胞差异较大。 13。 当 “婴儿培养箱” 以及其他表面固定方法已成功应用14,15，它们通常产生的同步化细胞产量较低。本文提供的密度梯度离心方案可获得更高纯度和更高产量的同步化细胞 C. crescentus NA1000 游动细胞。
在同步化过程中可能会出现其他复杂情况，从而导致潜在问题。准备一台带有液体封片功能的相差显微镜，用于在细胞同...

细菌细胞周期同时调控基因组的复制和子细胞的分裂。尤为重要的是，由于抗生素耐药性正日益威胁公共健康，细菌细胞周期为抗生素的研发提供了一个尚未充分开发的靶点。
在细菌 Caulobacter crescentus 中，每次细胞周期都会发生不对称分裂，产生两种命运不同的子代细胞（图&#160;1A）1,2。其中一个子代细胞继承鞭毛，具有运动能力；而另一个子代细胞则继承菌柄，处于固着状态。一个整合的遗传回路通过转录调控、磷酸化信号传导以及受控的蛋白质降解来调控细胞周期进程和细胞命运3。此外，染色体复制及其伴随的分离过程确保每个子代细胞恰好含有一份染色体拷贝4。重要的是，在可同步的 NA1000 菌株中，可通过胶体二氧化硅密度梯度离心快速分离这两种细胞类型5-7，从而高效地将游动子细胞从群体中其他细胞中分离出来（图&#160;1B）。分离得到的游动子细胞随后将同步地经历不对称细胞分裂。本文详细描述了用于同步 Caulobacter NA1000 菌株的实验方案，并提供了大规模和小规模同步操作的实验步骤及常见问题解决方案。该实验方法为研究 Caulobacter 细胞周期与细胞命运的时空调控提供了强有力的工具。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅（Percoll）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>胶体二氧化硅（Ludox AS-40）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 转子</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亚铁螯合溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>30 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

细胞周期对所有细胞的生长、基因组复制和发育都至关重要。在细菌中，细胞周期的研究主要集中在非同步化细胞上，这使得确定细胞周期进程、基因组复制和分裂所需的时间顺序事件变得困难。Caulobacter crescentus 为研究细菌细胞周期提供了一个极佳的模型系统，可通过密度梯度离心法将细胞快速同步于 G0 期。细胞周期同步实验已被用于阐明染色体复制与分离的分子事件，绘制调控细胞周期进程的遗传调控网络，并鉴定不对称细胞分裂所必需的极性信号复合物的形成过程。本文提供了一种快速同步 Caulobacter NA1000 细胞的详细实验方案。该同步方法既可用于大规模实验（如基因表达谱分析和蛋白质印迹检测），也可用于小规模实验（如显微镜观察或流式细胞术检测）。Caulobacter 具有快速同步能力和高细胞得率，使其成为研究细菌细胞周期的强有力模型系统。

同步化通常会产生两条细胞条带（图1B）：密度较高的游动细胞条带和密度较低的有柄细胞/分裂前细胞条带。为确保同步化效率，常见的对照措施包括监测OD600值，并在细胞周期的不同时间点通过Western blot检测CtrA蛋白水平。在整个细胞周期过程中，OD600应大约增加2倍（图2）。对细胞周期主调控因子CtrA进行Western blot分析是验证良好同步性的有效对照方法（图2）。CtrA在游动细胞中发挥作用，抑制DNA复制，并在DNA复制启动时被降解10。随后在细胞周期的后期重新合成CtrA，激活一系列发育相关基因的转录，包括鞭毛的多种组分11,12。成功的同步化应呈现出CtrA蛋白水平的振荡变化模式。
<img alt="Cell cycle and differentiation diagram with swar...

细菌细胞的同步化对于细菌细胞周期与发育研究至关重要。Caulobacter crescentus 可通过密度梯度离心实现同步化，从而为细菌细胞周期研究提供一种快速而有效的方法。本文提供了Caulobacter细胞同步化的详细实验方案。

Caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

细胞周期对于所有细胞的生长、基因组复制和发育都至关重要。在细菌中，细胞周期的研究主要集中在……

本实验的总体目标是分离钩端螺旋体游动细胞，以建立同步化细胞培养。该过程首先培养混合的钩端螺旋体细胞，然后通过将细胞重悬于冷培养基中短暂抑制其生长。第二步是通过差速密度离心法分离游动细胞。下一步是将游动细胞重悬于温热的培养基中，这一步可使细胞进入细胞周期。最后，可通过生化分析或显微镜观察来追踪分离得到的游动细胞在整个细胞周期中的变化。该技术相较于其他方法（如子细胞分离装置）的主要优势在于，能够快速分离细胞，并获得足够量的细胞用于生化研究。该方法有助于解答细胞生物学领域的一些关键问题，例如染色体分离和不对称细胞分裂周期的调控机制。首先，取自平板上的菌株 NA 1000（colo backer CSIS）细菌接种于 5 毫升 PYE 培养基中。将培养物在 28°C 条件下振荡培养过夜。次日，取 0.5 毫升过夜培养物转移至含有 25 毫升 M2G 培养基的锥形瓶中，于 28°C 振荡培养，直至培养物的光密度值达到 0.5 至 0.6 之间。接下来，将菌液稀释至一升 M2G 培养基中，以获得所需起始光密度，并在28摄氏度下振荡培养。当菌液光密度达到0.5时，用移液器吸取一微升菌液至载玻片上，然后加盖盖玻片。通过相差显微镜观察细胞，以确认是否存在快速游动的群游细胞。将菌液转移至无菌离心管中，随后在4摄氏度下以7,000 × g离心15分钟。接下来，倒出上清液时弃去松散沉淀的细胞，加入 180 毫升冷的 M2 培养基。用血清学移液管轻轻重悬细胞。然后向细胞悬液中加入 60 毫升冷的胶体二氧化硅溶液，并充分混匀。将细胞悬液分装至八个 30 毫升离心管中，在 4,000 × g 条件下离心 30 分钟，设置温度为 4 摄氏度。轻柔地从离心机中取出离心管，检查每根离心管中是否出现两条明显的条带。下层条带含有游动细胞，而上层条带含有分裂前细胞。接下来，小心抽走上层条带以及距离下层条带约一厘米以上的液体。使用巴斯德移液管取出游动细胞条带，并将其转移至一支干净的试管中。用冷的M2培养基充满离心管，然后离心以洗去胶体二氧化硅。接下来，小心弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升冷的M2培养基中，再次离心以沉淀细胞。将沉淀的细胞重悬于30毫升冷的M2培养基中，然后测定悬液的光密度。取1 µL细胞悬液置于显微镜载玻片上，使用相差成像观察是否存在游动细胞。随后，离心细胞并将其重悬于M2G培养基中，使光密度值介于0.3至0.4之间。将培养物在28 °C条件下振荡培养，用于后续蛋白质印迹或基因表达分析。每隔10至30分钟取出1毫升等分试样，持续约140分钟，直至培养物的光密度增加一倍。使用台式离心机将细胞离心30秒，然后迅速吸除上清液并进行速冻。将细胞沉淀在液氮中速冻，并于-80°C保存，用于小规模同步实验。接种5毫升M2G培养基，加入NA 1000个细胞，于28°C摇床中过夜培养，次日继续实验。将培养物用15毫升M2G培养基稀释，并将细胞培养至光密度在0.5至0.6之间。离心细胞，然后用1毫升冷M2培养基重悬细胞。将细胞转移至2毫升微量离心管中，通过离心收集细胞沉淀，并吸除上清液。然后将离心管置于冰上，用900 µL预冷的M2培养基重悬细胞沉淀。接着加入900 µL预冷的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的胶体二氧化硅，离心20分钟。小心吸除上层的前分裂细胞带，收集底部的游动细胞带至新的微量离心管中。在最终离心前，将游动细胞在 1 毫升冰冷的 M2 培养基中洗涤两次，每次洗涤之间以离心 3 分钟。将细胞悬液置于预冷的 1 毫升玻璃试管中，测定细胞的光密度。然后将细胞转移至微量离心管中，并在离心后进行后续操作。Reese，在光密度介于 0.3 至 0.4 之间时，将最终的细胞沉淀重悬于预热的 M2G 培养基中，并在 28°C 下振荡培养细胞。如需进行显微观察，可在适当的时间点取 1 µL 培养物置于 M2G 琼脂垫上。对非同步培养物进行差速密度离心，可获得两条细胞带。下部条带包含密度较高的游动细胞，上部条带包含密度较低的储存细胞和分裂前细胞。在细胞周期过程中，培养物的光密度大约增加一倍。在此期间，游动细胞分化为储存细胞，储存细胞随后进行复制并发生不对称细胞分裂。每次分裂都会产生一个新的游动细胞和一个保留的母细胞，因此对细胞周期主调控因子CTRA进行Western印迹分析是验证同步化效果的有效对照。CTRA可阻断游动细胞中的DNA复制，并在DNA复制开始后被降解。随后在细胞周期的后期重新合成CTRA，以防止DNA复制的再次启动，并激活多个发育相关基因的转录。CTRA蛋白水平的这种振荡模式表明细胞同步化成功。观看本视频后，您应能充分理解如何同步 callback 或 NA 1000 细胞以研究细菌细胞周期。如果操作正确，该细胞同步化步骤可在一至两小时内完成。进行该操作时，务必注意动作迅速。

synchronization-caulobacter-crescentus-for-investigation-bacterial

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

同步<em&gt;新月柄杆菌</em&gt;对细菌细胞周期的研究

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E.

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

来源：Murata, K. et. al., 利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩结构。J. Vis. Exp.

蓝细菌培养物的光暗周期同步化及DNA压缩

了解细菌中必需过程的功能具有挑战性。利用靶向特异性染料进行荧光显微镜观察，可为微生物细胞生长和细胞周期进程提供关键见解。本文以Agrobacterium...

活细胞荧光显微镜观察微生物细胞生长过程中的关键过程

细菌细胞在空间上具有高度有序的结构。为了在生长缓慢的Myxococcus...

荧光活细胞成像技术对生长缓慢的社会性细菌 Myxococcus xanthus 完整营养细胞周期的观察

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

活细胞荧光显微镜技术用于研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化

本研究介绍了一种显微镜方法，可对大肠杆菌（Escherichia...

生物噪声的连续测量 大肠杆菌 使用延时显微镜

许多细菌利用鞭毛驱动的运动能力来在环境中移动，并单独或集体定植于有利的环境。本文展示了三种成熟方法的应用，这些方法利用运动性作为筛选工具，以鉴定参与游泳和群集运动的组分或通路。...

研究鞭毛驱动的运动性 大肠杆菌 通过依次应用三种成熟技术

抗生素持留现象描述了敏感同基因群体中的少数亚群在短时间内耐受高剂量杀菌性抗生素的能力。本实验方案结合多种方法，在将大肠杆菌（Escherichia...

Escherichia coli中抗生素持留现象的群体与单细胞分析

分析同步时间序列实验的一个挑战在于，不同实验在同步恢复时长和细胞周期周期上往往存在差异。因此，来自不同实验的测量数据无法进行整体分析或直接比较。本文中，我们描述了一种用于对齐实验的方法，以实现特定相位的比较。...

利用细胞周期同步性丧失特征模型对同步化时间序列数据进行对齐以实现跨实验比较

了解新月柄杆菌细胞同步化方法，通过密度梯度离心分离游动细胞，建立同步培养体系。该技术可快速获得足量细胞用于生化检测和显微镜观察，为研究细菌细胞周期调控机制提供重要工具。

Caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

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