Caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

本实验的总体目标是分离钩端螺旋体游动细胞，以建立同步化细胞培养。首先培养混合的钩端螺旋体细胞，然后将细胞重悬于冷培养基中，短暂抑制其生长。第二步是通过差速密度离心法分离游动细胞。

下一步是将游动细胞重悬于温热的培养基中，这一步骤可使细胞进入细胞周期。最后，可通过生化检测或显微镜技术对分离得到的游动细胞在整个细胞周期中的行为进行追踪。该技术相较于其他方法（如子细胞分离装置）的主要优势在于，能够快速分离细胞，并获得足够量的细胞用于生化研究。

该方法有助于回答细胞生物学领域的一些关键问题，例如染色体分离和不对称细胞分裂周期的调控机制是什么。首先，从含有菌株NA 1000的colo backer CSIS平板中挑取细菌，接种至5毫升PYE培养基中。将培养物在28摄氏度下振荡培养过夜。次日，取0.5毫升过夜培养物转移至含有25毫升M2G培养基的锥形瓶中，并在28摄氏度下振荡培养，直至培养物的光密度达到0.5至0.6之间。

接下来，将培养物稀释至一升 M2G 培养基中，以获得所需起始光密度，并在28摄氏度下振荡培养。当培养物的光密度达到0.5时，用移液器取1微升培养物滴加到载玻片上，然后盖上盖玻片。通过相差显微镜观察细胞，确认是否存在快速游动的群游细胞。将培养物转移至无菌离心管中，随后在4摄氏度下以7,000 × g 离心15分钟。

接下来，倒出上清液时弃去松散沉淀的细胞，加入 180 毫升冷的 M2 培养基。用血清学移液管轻轻重悬细胞。然后向细胞悬液中加入 60 毫升冷的胶体二氧化硅溶液，并充分混匀。

将细胞悬液分装至八个30毫升离心管中，于4 °C下以6,400 ×g离心30分钟。从离心机中轻柔取出离心管，观察管内是否存在两个明显的条带。

下层条带含有游动细胞，而上层条带含有分裂前细胞。接下来，小心吸走上层条带以及位于下层条带上约一厘米处的液体。使用巴斯德移液管取出游动细胞条带，并将其转移至一支干净的离心管中。

用冰冷的M2培养基填充试管，然后离心试管以洗去胶体二氧化硅。接下来，小心弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升冰冷的M2培养基中，再次离心以收集细胞沉淀。将沉淀重悬于30毫升冰冷的M2培养基中，然后测定悬液的光密度。

取1 µL细胞悬液置于显微镜载玻片上，采用相差成像技术检查是否存在游动细胞。随后，离心细胞并将其重悬于M2G培养基中，使光密度值介于0.3至0.4之间。将培养物在28 °C条件下振荡培养，用于后续蛋白质印迹或基因表达分析。

每隔10至30分钟取出1毫升等分试样，持续约140分钟，直至培养物的光密度增加一倍。使用台式离心机将细胞离心30秒，然后迅速吸除上清液。将细胞沉淀在液氮中速冻，并于-80°C保存，用于小规模同步化实验。接种5毫升M2G培养基，加入NA1000细胞，于28°C摇床中过夜培养，次日继续实验。

将培养物稀释于15毫升M2G培养基中，培养细胞至光密度值在0.5至0.6之间。离心收集细胞，然后用1毫升冷M2培养基重悬。将细胞转移至2毫升微量离心管中，离心形成细胞沉淀，并用移液器吸除上清液。

然后将离心管置于冰上，用900 µL冷的M2培养基重悬细胞沉淀。接着加入900 µL冷的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被的胶体二氧化硅，将离心管离心20分钟。小心吸除上层的前分裂细胞带，收集下层的游动细胞带至新的微量离心管中。

在最后一次离心前，用一毫升冷M2培养基将游动细胞洗涤两次，每次洗涤之间离心三分钟。将细胞悬液置于预冷的一毫升玻璃试管中，测定细胞的光密度。然后将细胞转移至微量离心管中，离心后进行离心处理。

Reese，在光密度介于 0.3 至 0.4 之间的预温 M2G 培养基中重悬最终的细胞沉淀，并在 28°C 下振荡培养细胞。如需进行显微镜观察，在适当的时间点取 1 µL 培养物置于 M2G 琼脂垫上。对异步培养物进行差速密度离心可得到两层细胞带。

下方条带包含密度较高的游动细胞，上方条带则包含库存细胞和前分裂细胞，后者密度较低。在细胞周期过程中，培养物的光密度大约增加两倍。在此期间，游动细胞分化为库存细胞，库存细胞随后进行复制并经历不对称细胞分裂。

每次分裂产生一个新的游动细胞和一个亲本的有柄细胞，因此针对细胞周期主调控因子CTRA的Western印迹是验证同步化效果的有效对照。CTRA在游动细胞中抑制DNA复制，并在DNA复制开始后被降解。随后在细胞周期的后期重新合成CTRA，以防止DNA复制的再次启动，并激活多个发育相关基因的转录。CTRA蛋白水平的这种振荡模式表明细胞同步化成功。

观看本视频后，您应能充分理解如何同步 NA 1000 细菌细胞以研究其细胞周期。若操作得当，该细胞同步过程可在一至两小时内完成。进行此操作时，务必注意动作迅速。