用于研究模式豆科植物Medicago truncatula早期胚胎发育调控的合子胚与体细胞胚获取方案

以下实验方案的总体目标是展示如何获取处于不同发育阶段的玉兰属植物合子胚，以研究植物胚胎发育过程中的遗传调控机制。该目标可通过将豆荚形态与合子胚的不同发育阶段相对应，以及通过叶外植体培养获得处于不同阶段的体细胞胚来实现。最终，可利用定量PCR和β-葡萄糖醛酸酶检测来评估特定发育阶段胚胎发生过程中基因的表达水平。这些技术的优势在于体内实验无需对单个花朵进行标记，且体外实验流程经过优化，提供了互补的实验手段。

对培养步骤进行可视化演示非常重要，因为它有助于更准确地观察操作细节。体内实验步骤将由 Wang 演示，而体外实验步骤将由 Kim Nolan 演示。为了促进合子胚的发育，需刺穿来自 Monte cargo 三目植物种子的种皮表面，并将种子完全浸没于水中过夜。

第二天，将三粒种子播种于10个直径15厘米的花盆中，每盆均装有育苗基质，然后将花盆转移至玻璃温室。在14小时光照周期下培养植株，昼夜温度控制在23至19摄氏度之间，在种子萌发后保留最健壮的幼苗，使每盆仅保留一株，并在幼苗周围设置支架，以便植株茎蔓在结荚时攀爬。根据表一和图一所述的适当发育阶段进行采样，以获得所需早期胚胎发育阶段的材料。

接下来，使用镊子从豆荚中分离出胚。或者，为了获得更精细的显微观察效果，可将材料完全置于霍耶尔溶液（Hoyer's solution）中透明处理，然后在标准复式显微镜下观察胚胎，以确认胚胎发育阶段。随后，从豆荚中部区域收集实验所需的一定数量的未成熟胚（UL），并将其保存在适当的温度条件下，用于后续体细胞胚胎发育分析。

从易于在培养中形成胚胎的转基因拟南芥品系的伸长茎上，选取最新长出且几乎完全展开的叶片进行体外采集。将叶片置于湿润的纸巾上，并放入培养皿中以防止脱水。随后在经紫外线灭菌的生物安全柜中操作，将叶片放入已高压灭菌的弹簧茶叶滤球的网状部分内。

将浸入式 infusion 器置于含 70% 乙醇的 250 毫升螺口瓶中，在高压灭菌器中处理。聚碳酸酯培养皿处理 30 秒后，沥干叶片组织，然后将 infusion 器浸入 1:8 稀释的次氯酸钠溶液中 10 分钟。期间偶尔轻轻旋转，轻柔地晃动培养皿，随后沥去多余的水分。

然后冲洗萃取器，再用一个新容器中的新鲜去离子水冲洗一次。现在使用无菌镊子将茶叶从茶萃取器中转移至新鲜培养容器中，加入无菌去离子蒸馏水，并拧紧无菌瓶盖。

然后通过倒置并轻轻搅动来冲洗叶片。接着让小叶漂浮在无菌水表面，以便接种植体。使用无菌操作技术修剪单个已消毒小叶的边缘。

然后将剩余的矩形切成两到三块长8至10毫米、宽3至5毫米的矩形外植体，使每个外植体的中心均保留主脉。每9厘米直径的培养皿中放置6块外植体，置于琼脂固化培养基上，并将外植体的ABA面朝下，以保持叶片的自然方向。

然后用封口膜密封培养皿，并将培养皿置于28°C的恒温室内避光培养。三周后，使用无菌的不锈钢 spatula 和镊子将正在分化的胚性外植体转接到新鲜培养基上。约四周后应可观察到首批胚状体，此时愈伤组织开始形成，且其体积超过图中所示最大外植体的尺寸。

继代培养至新鲜培养基时，仅转移单个愈伤组织的50%。最后，利用体视显微镜，在4至8周的培养期间收集不同胚胎发育阶段的材料，并根据实验目标对外植体进行处理。如上所述收获合子胚后，可在后续实验中采用酵母双杂交或其他适当策略；尤其值得关注的是，如图中所示，通过观察接种的X计划，可以分辨SSIS与Spencer之间的显著差异。

在第四至第八周期间，可以找到处于特定阶段的体细胞胚胎并立即进行分析。例如，这些数据表明，在早期Olein阶段的胚胎会表达一种类型的苜蓿Tula eoin基因，但不会表达另一种。体细胞胚胎系统的一个显著优势在于，愈伤组织的转化可以在不再生完整植株的情况下进行。

事实上，如本视频所示，β-葡萄糖醛酸酶可用于可视化胚胎发育不同阶段的基因表达。观看视频后，您应能充分掌握如何选择和解剖豆荚以获得拟南芥胚胎。

还应充分掌握如何制备和接种无菌外植体以进行体细胞胚胎发生，以及胚胎发育后的相关操作。这些技术手段使得研究人员能够深入探究胚胎发生早期阶段的转录调控机制，及其与胚胎生长发育和营养物质储存之间的关系。