直立成像果蝇蛋钱伯斯

该协议中描述的直立成像方法可以详细观察发育中的黑腹果蝇卵的两极。 这种端接视图为滤泡上皮中多种细胞类型的排列和形态提供了新的视角。

该程序的总体目标是实现果蝇卵室两极的高分辨率成像。这是通过首先解剖卵形并用荧光抗体染色来实现的。第二步是识别和分离感兴趣的卵室。

接下来，对选定的样品进行定向和对齐，然后包埋在甘油果冻块中。最后一步是切割和旋转积木以安装蛋室，使长轴垂直。最终，共聚焦显微镜用于揭示卵室两极的细胞和亚细胞组织。

上皮，例如边界细胞排列，通过光学切片和算法 3D 重建查看垂直于成像平面的标本的现有方法会导致光漂白和光散射，并提供较差的分辨率，从而产生不太准确的图像。这种技术的主要优点是它允许我们以新的角度安装标本并直接查看它们。我们使用这种技术对发育中的卵室的两极进行成像，从而深入了解卵泡细胞的组织。

这种方法的视觉演示至关重要，因为制备和安装步骤很难学习，因为它们需要对染色标本进行微作并从传统角度重新定位样品。演示该程序的是 Lathea 在我实验室为一名研究生提供服务。要开始实验，请获得玻璃凹陷载玻片，并将几滴解剖培养基移液到每个腔中。

用二氧化碳麻醉果蝇，并将它们放在解剖显微镜下。接下来，将一只雌性苍蝇的翅膀向下，头部向左。用非惯用手将每只手的镊子与桌面成 30 度角。

用镊子捡起苍蝇。抓住靠近胸部的腹部前部的苍蝇，并将其浸入解剖介质中。在凹陷处用另一对镊子滑行。

抓住腹部腹后方的外骨骼并刺穿。抓住后端的卵巢，然后将它们从腹部拉出，并将它们放入凹陷玻片另一侧的新鲜培养基中。然后在最大的卵室附近握住后端的卵巢，用另一只手缓慢而稳定地捏住最前面的卵室或果酱之一。

从卵巢鞘中拉出卵链，继续单独解剖卵形，直到去除所有所需的卵室。解剖完成后，使用塑料移液管将椭圆囊转移到 0.6 毫升的试管中，让椭圆囊沉降到试管底部。使用移液管小心地从卵巢中去除尽可能多的解剖介质。

小心不要去除新管中的任何卵室或卵室。将 50 微升 16% 多位甲醛加入 150 微升 0.1 摩尔磷酸钾缓冲液中，并将其添加到蛋室中。一边摇动一边孵育 10 分钟孵育孵育后，取出固定剂。

用 NP 40 缓冲液冲洗两次，然后在室温下用 0.5 ml NP 40 缓冲液在天线上洗涤两次，每次 15 分钟。固定和洗涤后，添加一抗并在 4 摄氏度下孵育卵子过夜或在室温下孵育 3 小时孵育后。在室温下用 0.5 mL NP 40 缓冲液洗涤样品 4 次，每次 20 分钟。

然后加入 1 比 200 稀释度的二抗，并在 4 摄氏度下孵育卵瓶 3 小时或过夜。接下来，添加 1 比 1000 稀释的 DPI，并孵育卵形 10 分钟。然后在室温下用 0.5 ml NP 40 洗涤缓冲液洗涤样品 4 次，每次洗涤 20 分钟。

免疫荧光或 IF 方案完成后，将 200 微升 50% 甘油的 PBS 溶液添加到卵室中，让它们在室温下避光放置 2 小时。取出溶液，然后用 PBS 中的 70% 甘油替换，并用铝箔纸盖住试管。将样品储存在 4 摄氏度，直到它们准备好进行封片。

要制备甘油果冻，请用刮刀将甘油果冻等分装，以填充 15 毫升 Pyrex 玻璃培养管，将甘油果冻在 55 摄氏度的水浴中熔化 30 分钟。同时，将储备溶液中的 300 微升甘油滴到两张显微镜载玻片上。使用纸巾，将甘油薄薄地铺在每个载玻片上。

提供能够轻松去除甘油果冻的基质。检查甘油果冻是否完全融化。接下来，切下过滤的 1000 微升移液器吸头，将 1000 至 1， 500 微升温热的甘油果冻缓慢转移到每个显微镜载玻片上，注意防止气泡形成。

让甘油果冻玻片在室温下静置 5 分钟，以固定每个甘油果冻的蕾丝。滑入 60 毫米 x 15 毫米的培养皿中。用保鲜膜盖住培养皿，并将载玻片在 4 摄氏度下存放过夜。

先前制备的 70% 甘油样品中移取几滴 3 微升蛋室，跨一张甘油果冻载玻片。继续移液 3 微升液滴，直到所有蛋腔都在载玻片上，确保每滴至少包含 10 个蛋腔。接下来，在 55 摄氏度的水浴中加热甘油果冻培养管，将带有蛋室的甘油果冻载玻片置于解剖显微镜下并调整放大倍率，以便只有一滴蛋室在视野中。

使用 30 号针头作为勺子，必要时拾取所需的阶段蛋室。使用针头作为刀，将所需的卵室与卵链分开，以避免可能干扰成像的碎屑。将卵室转移到第二个甘油果冻载玻片上。

重复此步骤，直到至少有 7 个蛋室排成一列，前侧朝左。用针头刮掉碎屑或不需要的蛋室，形成新的七列，直到所有需要的蛋室转移到第二个甘油果冻载玻片上，扭动一小块 Kim 湿巾，然后通过轻轻触摸每个蛋室吸收多余的 PBS 甘油。注意不要移除任何蛋室。

切掉过滤器 200 微升移液器吸头的尖端，并转移 150 微升甘油果冻以覆盖卵室的所有列。在显微镜下验证所有卵室柱是否都被覆盖。让封固的蛋室在室温下静置 5 分钟，直到甘油果冻的顶层完全凝固。

然后将已安装的卵室载玻片放入 60 毫米 x 15 毫米的培养皿中，并用保鲜膜盖住。将培养皿在 4 摄氏度下存放过夜，让甘油果冻层在黑暗中凝固。如果可能发生光漂白，请将已安装的卵室的载玻片放在解剖显微镜下。

调整放大倍率，使视野中只有一列卵室。使用 45 度角微型手术刀。沿着第一列蛋室的右侧靠近蛋室的后部切一条直线。

接下来，在顶部的第一个蛋室上方和柱子中最后一个蛋室的下方切开，以便现在在三个侧面切割蛋室。用微型刀沿柱子的左侧尽可能靠近蛋室的正面切片。然后用圆盘和抹刀将 100 微升冷的 1 XPBT 移液到切割柱上。

去除蛋室切割柱三边周围多余的甘油果冻，并丢弃多余的甘油果冻。将刮刀插入蛋室前侧的切口中，将柱子与初级甘油果冻块分开，安装在载玻片上并继续成像。直立成像方法可以直接观察第八阶段前滤泡上皮细胞的组织。

卵泡硫酸盐的一般标志物、眼睛缺失或 IA 蛋白以及核 DNA 标志物 DPI 在该细胞视野中显示均匀表达，并表明所有细胞都可以看到具有相似染色强度。蛋室的传统视图与蛋室的三维重建所创建的现场视图形成鲜明对比。插图显示了车削的轴。

x 轴向下。Z 轴现在朝向左，Y 轴朝向观察者。由于 Z 轴的分辨率较低，单个单元格会变得模糊。

因此，新方法代表了成像的显著改进。直立位成像方法有效地可视化了第九阶段卵室中的前上皮。在这个发育阶段，边界细胞在极性细胞周围聚结在一起。

这些紧凑的簇是通过 endon 成像观察到的。观看此视频后，您应该对如何安装样本以启用新的查看视角有很好的了解。我们使用这种技术对选定阶段发育中的卵室的极点进行成像。

这种通用技术可用于果蝇的其他阶段、卵子发生或其他类型的小组织。