一种用于脑活动介观宽场光学成像的大范围侧颅开颅术

本项大型侧颅骨切开术的主要目标是对大脑半球的广阔区域进行实时成像。该技术的主要优势在于，能够暴露大面积的皮层以供观察，并可与光遗传学等技术联合使用。该方法能够在不同的时间和空间分辨率下，帮助研究细胞之间的神经动态特性以及不同脑回路之间的相互作用。

由于硬脑膜通常附着在脑表面和血管上，该操作存在较高的出血和皮层损伤风险，因此对该方法进行可视化演示至关重要。该方法可用于研究脑回路发育的神经生物学机制，以及其在生命过程中因新经验或阿尔茨海默病、中风等病理状态所引发的变化。开始此操作前，需对所有手术器械进行高压灭菌，并确保手术全程保持无菌状态。

确保手术有足够的脑部缓冲液。接下来，将麻醉后的小鼠转移至头部固定装置，并将其放置在设定为 37 摄氏度的温控加热垫上。将小鼠的上门齿固定在门齿夹中。

然后将小鼠头部向左旋转约30度，以暴露头部右侧侧面。随后，用耳杆的钝端固定小鼠头部。接着涂抹眼膏以防止角膜干燥。

为减轻脑水肿，可肌肉注射地塞米松，剂量为每千克体重4毫克。用浸有4%氯己定的棉签擦拭手术区域皮肤三次，随后用70%酒精擦拭三次。在颅骨开窗部位皮下注射利多卡因。

在解剖显微镜下，用镊子夹住耳后中线左侧一毫米处的皮肤，用手术剪做一个小的横向切口。向右耳方向做5至6毫米的侧向切口，然后向头的吻端方向切割。在初始切口处插入剪刀，向前（吻侧）剪开10毫米。

随后，剪开右耳周围及右眼附近的皮肤，以暴露颅骨右侧和颞肌。确保暴露区域最宽处至少为七毫米。若需扩大手术区域，可进一步修剪皮肤。

使用棉签以环形运动摩擦颅骨表面，以去除颅骨上的骨膜。确保彻底清除所有骨膜，并使颅骨完全干燥，这对头板的成功固定至关重要。接下来，使用弹簧剪和镊子将颞肌与颅骨分离。

沿外侧剪开并牵拉肌肉，直至暴露鳞状骨。需格外小心，避免损伤沿鳞状骨近眼侧走行的浅颞静脉，否则可能引起出血。若发生出血，可用预先浸润脑缓冲液的明胶海绵进行止血。

对于严重出血，使用热灼器处理。将丁基氰基丙烯酸酯胶滴加至出血部位。开始此操作时，首先标记前囟以定位 underlying 脑区，沿头板底部边缘涂抹乙基氰基丙烯酸酯胶，并将头板粘附于颅骨开窗区域上方。

随后，用牙科水泥填充颅骨与头板之间的开口间隙，仅暴露颅窗区域。然后等待牙科水泥干燥并固化。接着，使用牙科钻在颅骨表面轻轻划线，标出颅窗区域的轮廓。

轻柔地沿着原始划痕轨迹进行钻孔，以加深切口，同时确保钻头不会穿透颅骨进入脑组织。在此过程中，每隔几分钟交替进行钻孔和用湿润的卷状纸巾轻拭颅骨表面。这一极具挑战性的初始步骤要求外科医生在不损伤下方皮层的前提下，通过钻开老化颅骨使其松解，以便移除。

慢工出细活，操作要平稳流畅。钻孔过程中，应定期用镊子或不旋转的钻头轻轻按压颅骨，检查是否发生变形。当骨面开始出现凹陷时，立即停止钻孔，并将整个窗区浸入脑缓冲液中。

在去除颅骨前，至少等待五分钟，以软化骨质并降低硬脑膜黏附于骨组织的风险，从而使颅骨去除过程更加容易。接下来，从颅骨前缘开始进行颅骨去除操作。使用镊子轻轻将松动的颅骨从硬脑膜上剥离。

当骨片松动并漂浮在硬脑膜上时，用镊子牢固夹住，将其从硬脑膜上抬起移开。确保骨片 never 刺入脑组织。使用镊子和弹簧剪轻轻撕开并剪除硬脑膜。

必须小心操作，以确保脑实质和血管不受损伤。持续操作直至颅窗部位的硬脑膜完全清除。若操作得当，脑组织将显得非常干净，血管清晰可见，且无任何瑕疵。

用70%乙醇喷洒盖玻片，并使用压缩空气罐轻轻吹干。确保玻片完全清洁，无任何斑点或灰尘残留。接着，通过加热将200毫克琼脂糖粉末溶解于15毫升脑缓冲液中，制备1.3%琼脂糖溶液。

将温度计放入热的琼脂糖中，使琼脂糖冷却至略高于凝固温度，约为 40 摄氏度。可通过在管外冲洗冷水来加快冷却速度，注意避免任何水进入琼脂糖中。在监测温度的同时，用温度计轻轻搅拌。

在施加琼脂前立即从颅窗中移除脑组织缓冲液。确保无气泡或颗粒存在，因为这些会干扰成像。现在用移液头吸取琼脂糖，并将琼脂糖直接滴加到脑组织上。

然后迅速将盖玻片覆盖在表面，并用琼脂糖液滴在四个角上固定盖玻片。图中所示为宽侧单侧开颅术的显微照片，每张图像中均以白色圆圈标示前囟位置。图中显示了小鼠在0.5%异氟烷麻醉下，经对侧胡须刺激、听觉刺激、对侧前肢刺激、对侧后肢刺激以及用发光二极管对对侧眼睛进行视觉刺激后的大脑皮层激活模式。

在初级感觉皮层激活后的10至25毫秒内，所有形式的感觉刺激均引起中线区域的激活。一旦掌握，该技术可在三到四小时内完成。在实施该操作时，重要的是要牢记尽量减少失血，并确保不损伤皮层。

通过该操作流程，其他成像技术（如光学成像）可帮助回答一些重要问题，例如在正常和病变大脑中，自发性活动如何影响神经动态。该技术发展之后，为系统神经科学领域的研究人员探索小鼠远距离皮层区域之间的相互作用和神经动态奠定了基础。本视频将向您展示如何在小鼠中进行大范围侧颅骨开窗手术，同时最大限度减少出血和皮层损伤，使您能够获取回答关键科学问题所需的必要数据。