Name: 染色昆虫行为检测:麻醉的交配行为果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学习使用食用色素对果蝇进行非侵入性染色标记的方法，用于行为实验中的个体识别。该技术操作简便，适用于交配试验等多种实验场景，且不会影响果蝇的正常行为表现。

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我们感谢 Alex Hitchen 和 Meg Booth 在交配试验中提供的帮助。本工作由 NERC 资助项目 NE/H015604/1 支持，资助对象为 TP。

1. 含食用色素的果蝇培养基的制备
<ol>
	<li>取一个标准的 Drosophila 培养瓶，底部装有约 20 ml 培养基（图 1）。使用以下配方制备培养基：将 10 g 琼脂、85 g 葡萄糖、60 g 玉米粉、40 g 酵母加入 1 L 沸水中，搅拌并持续微沸 5 分钟&#160;。待混合物冷却至 75 °C 后，加入 25 ml 10% 尼泊金溶液。</li>
	<li>待培养基冷却凝固后，在其表面滴加两滴（约 0.5 - 1 ml）蓝色食用色素，并均匀涂抹至整个培养瓶内表面（图 1）。可根据需要选用其他颜色的染料。</li>
	<li>将培养基置于冰箱中静置两天，使染料被表层充分吸收；此举可避免在果蝇成熟期间因湿度过高而损害果蝇。若仍存在过多水分，可放置一小片滤纸吸除多余水分，随后将其移除。</li>
	<li>将果蝇以单只或群体方式转移至培养基上。 
	注意：果蝇在接触染色培养基后 1 天内即可出现肠道染色。或者，也可在实验前将果蝇全程饲养于染色培养基上完成成熟过程（在成熟期间暴露于食用染料未观察到死亡率升高）。</li>
	<li>检查染色果蝇是否可与未染色果蝇清晰区分。若无法区分，请重复步骤 1.1 - 1.4，使用更高浓度的染料或更换不同种类的染料。</li>
</ol>
2. 使用食用色素进行的两次雄性交配试验
<ol>
	<li>为获得后代，准备多个装有雌雄果蝇配对的试管（少量雌雄果蝇组成的小组亦可，但需注意避免幼虫过于拥挤）。让雌蝇产卵，并每隔5–7天将果蝇转移至新的试管中。将试管置于目标物种适宜的温度下保存（对于黑腹果蝇为22 °C） D. pseudoobscura 和 D. subobscura 25 °C D. melanogaster).</li>
	<li>在采集实验果蝇前，需在预定时间提前将收集瓶中的所有果蝇清除，以确保待采集的雄性和雌性果蝇均为处女蝇（D. melanogaster&#160;– 25 °C 下 6 小时， D. pseudoobscura&#160;– 22 °C 下 18 小时，以及 D. subobscura&#160;– 24 小时，22 °C。 
	注意：如果果蝇不是处女蝇，将会影响其在交配试验中的行为表现15.
	<ol>
		<li>将雄性个体单独饲养在标准的75 × 20 mm塑料小瓶中（每瓶含约20 ml食物）并使其成熟。此举可避免某些物种中因雄性群体饲养而导致的交配行为和适合度下降的负面影响16.</li>
		<li>将一半的雄性个体暴露于所需的处理（CO2 麻醉（在此情况下）。使用 CO2 轻拍或轻触培养瓶以在规定时间内使果蝇暴露。将每种处理中的一半雄蝇饲养在有色食物上，直至交配开始。这将使它们在交配试验中具有视觉可区分性。</li>
		<li>转移果蝇时使用吸虫器17. 为每个小瓶贴上标签，以标明处理方式和雄性个体的颜色状态。此处使用四种处理方式（麻醉、非显色 = G-NC，麻醉、显色 = G-C，无麻醉、非显色 = NG-NC，以及无麻醉、显色 = NG-C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将新羽化的雌性个体转移至新鲜食物试剂瓶中，每10只一组进行成熟培养。</li>
	<li>让果蝇发育至性成熟交配年龄（D. melanogaster&#160;– 3天， D. pseudoobscura&#160;– 5 天， D. subobscura&#160;– 7 天18. 将果蝇储存在所研究物种适宜的温度条件下（例如， 22 °C 下 D. pseudoobscura 和 D. subobscura 25 °C D. melanogaster).</li>
	<li>将雌性个体转移至单独的试剂瓶中（每瓶含约 20 ml 食物），每只雌性单独饲养，置于交配实验前 1 天，以适应交配用试剂瓶环境。对这些试剂瓶进行标记，以便区分不同个体。标记时需采用中性标签，确保实验的盲法设计即，1 - 150），因此无法判断任何一瓶果蝇的身份。 
	注意：将果蝇放入每个试剂瓶的实验人员需要知晓每瓶中果蝇的身份，因其需记录对应处理组的染色情况。然而，观察交配行为的实验人员则不应知晓果蝇的身份。为此，至少需要两名实验人员，一人负责实验设置，另一人负责观察。</li>
	<li>在上午10点至12点之间开始交配试验，或选择与果蝇所处光/暗循环光照开启时间一致的时段（即果蝇的“黎明”）。使用吸虫器将两只雄性果蝇加入每个交配小瓶（每个小瓶已含一只雌性果蝇）中。确保这两只雄蝇来自不同的处理组（麻醉或对照），且其中一只有肠道染色，以便区分二者，并记录哪只雄蝇被染色。</li>
	<li>如果发生交配，记录交配雄性个体的状态（有色或无色）。若试验持续2小时仍未交配，则视为雌性不会交配。 
	注意：2 小时适用于这些物种，但其他 果蝇 可能需要更长或更短的时间。</li>
</ol>
3. 单雄性交配试验
<ol>
	<li>进行单只雄性实验时，重复方案2，但需做以下两点修改：
	<ol>
		<li>在步骤2.3中，不要将雄蝇保留在有色食物上。</li>
		<li>在步骤2.7中，每个小瓶仅加入一只雄蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤2.8中，记录果蝇加入小瓶的时间、交配开始的时间以及交配结束的时间。根据这些数据计算交配成功率、交配潜伏期和交配持续时间。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用合适的统计软件包进行分析。如果数据符合正态分布且仅有两种处理方式，则使用 t 检验或等效的广义线性模型（GLM）。对于两雄性实验，可使用任何基础统计软件包中提供的二项检验或二项 GLM。 
	注意：示例数据的所有分析均在 R 版本 3.0.319 中完成。</li>
	<li>通过绘制各处理组交配潜伏期和交配持续时间的频数直方图20，并使用 Shapiro-Wilk 等正态性检验方法，检查交配潜伏期和持续时间数据的正态性。若数据不符合正态分布，应进行数据转换，或采用相应的非参数统计方法20。 
	注意：示例数据中单雄性实验的对数转换后数据满足正态性和方差齐性要求。</li>
	<li>若数据可被标准化，当使用两种处理方式时，可用 t 检验分析单雄性交配实验中交配潜伏期和持续时间的差异21。若使用多种处理方式，可尝试方差分析（ANOVA）20。若数据无法标准化，则尝试使用相应的非参数检验方法21。</li>
	<li>使用二项检验分析食用色素或 CO2 麻醉对竞争雄性交配成功率的影响20。若使用多种处理方式（如示例数据所示），则采用具有二项误差结构的 GLM21。</li>
	<li>对于示例数据中的双雄性实验，使用具有二项误差结构的 GLM。其中一个 GLM 以颜色为响应变量（着色 = 0，未着色&#160;= 1），以物种、气体状态和气体处理作为解释变量；另一个 GLM 以 CO2 处理为响应变量（麻醉 = 0，未麻醉 = 1），以物种、着色状态和气体处理作为解释变量。每种情况下均构建最大模型，并基于 AIC 进行模型简化20。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

这些数据表明，CO2 麻醉对不同物种的影响存在差异，三种物种中有两种受影响较小。我们的结果提示，对于黑腹果蝇（D. melanogaster），使用食用染料标记对雄性交配成功率的影响低于CO2麻醉。这些实验表明，食用染料可被简单且低成本地用于在涉及多只雄蝇的交配试验中对果蝇进行标记。
三种模型中的 黑腹果蝇 所研究的物种中，仅有 D. melanogaster 显示出 CO 的效应2 麻醉对竞争环境下交配表现的影响。相比之下，在单次交配试验中，无论交配潜伏期如何，均未发现采集气体对任何物种产生影响，这与先前的研究结果相反 D. melanogaster5因此，竞争效应可能凸显了CO更细微的适合度影响2 麻醉，仅在雄性间竞争的情况下才可被检测到。在采集早期以及试验前一天的暴露对雄性个体的能力产生负面影响 D. melanogaster 以获得交配机会。然而，试验前两天的暴露并未显示出任何效果。两者 D. pseudoobscura 和 D. subobscura 在任何一次试验中均未显示出暴露于气体的任何效应。一种解释是 D. melanogaster 易受早期一氧化碳暴露的影响2 因为它需要在生命早期（0–6小时龄）采集，早于其他物种，以确保雄性为处男状态。因此雄性 D. melanogaster 此龄期的果蝇可能更为敏感，因为其体壁仍在硬化过程中，而其他物种的体壁已有更长时间完成硬化。总体而言，这支持了CO的影响效应2 麻醉效果具有物种特异性，研究人员应针对其目标物种进行适当的效果测试。目前，关于CO2 麻醉已实施于 黑腹果蝇5,11,22 因此可能不适用于其他相关物种。
用于区分果蝇的另一种非侵入性方法是食用染料。结果表明，该处理在所有受试物种中均未产生不良影响。然而，尽管该方法在提供一种廉价且易于观察的个体标记方面是成功的，但应注意，染料在D. pseudoobscura和D. subobscura中的可辨识度高于D. melanogaster。此前的研究人员曾使用过多种颜色（红色、绿色和蓝色）4,6。我们发现，蓝色染料在所有物种中均最容易辨别，尤其是D. pseudoobscura和D. subobscura。使用多种颜色可能有助于开展涉及大量个体标记果蝇的更复杂实验。然而，对不同染料进行初步测试至关重要，因为某些食用染料无法对果蝇着色，可能在摄入后被消化。其他染料可能具有毒性作用，降低果蝇存活率，应予以避免14。此外，也有研究采用成本更高的染色剂作为替代的食品染色方法，用于检测中国台湾D. melanogaster的肠道完整性23。这些方法可能提供一种替代但更昂贵的染色方案23。
染料法与CO同样快速2 剪翅后可将果蝇储存在染色食物中以便标记。食物摄取迅速（约3小时），因此在彩色食物中过夜储存也足以对果蝇进行标记，此方法已在其他研究中使用。6然而，与翅剪标记（永久性）或荧光粉尘标记（10–12天）相比，染色标记的持续时间相对较短（约4–5小时）。24。当 果蝇 物种在外形上存在差异，不同染料对不同物种的效果也会有所差异，且某些品系（例如，基因敲除突变体）可能对饮食变化敏感，因此使用染料前必须进行有效性预实验，特别是长期暴露于染料可能具有毒性时14与Kalaw的研究相比 等14，我们发现，在多种颜色的食物上储存数天后，未出现显著的死亡率 D. melanogaster （3天）， D. pseudoobscura （5 天），或 D. subobscura （7天），这可能是由于所用染料不同所致。
染料标记技术成功应用的关键步骤是第1.5步，即验证所选染料是否适用于正在使用的物种和品系。另一种替代技术是在果蝇用于野外实验前，将其体表涂抹有色粉尘24。由于标记持续时间较长且可大规模标记果蝇，该方法已被用于野外个体追踪24。尽管我们尚未在交配实验中明确测试该方法，但有必要考察粉尘可能对交配过程中重要的感官（特别是在Drosophila中）产生的影响25, 26。然而，在无法进行肠道染色的物种中，这些方法可能是合适的。
总之，我们发现，在所测试的三个物种中的两个物种中（D. pseudoobscura 和 D. subobscura）无论是CO2 麻醉或食用色素对雄性交配能力的影响。对于 D. melanogaster CO的负面影响2 麻醉被检测到，但食用色素并未影响该物种的交配成功率。总体而言，染色法提供了一种简单、廉价且非侵入性的个体识别方法 果蝇 其效果相当于或优于需要CO的方法2 麻醉。该方法可能适用于多种物种。

在过去的几十年中，人们对性选择以及雄性个体之间的竞争如何影响进化过程产生了日益浓厚的兴趣1,2。关于交配行为的实验在性选择理论的发展与验证中发挥了重要作用3,4。特别是利用果蝇属（Drosophila）物种开展的研究，极大地促进了人们对性选择和行为机制的理解。然而，有必要探讨常用实验技术是否可能人为地影响标准交配实验的结果5,6。
麻醉在实验中常用于动物的处理与识别7例如，果蝇通常在交配前收集，或使用二氧化碳（CO₂）进行麻醉后按基因型或实验处理分组。2麻醉剂。在需要区分两个或多个个体的实验中，通常的做法是将果蝇麻醉后剪除部分翅膀，以区分各个个体或处理组5,8然而，了解CO如何作用至关重要2 处理将影响行为。CO的效应2 麻醉已被研究过 果蝇黑腹果蝇 其中暴露于CO的雄性2 交配时间显著延长，且总体交配成功率低于未麻醉雄性或通过低温暴露进行麻醉的雄性5该效应在实验当天施加麻醉以及在果蝇给予一天恢复时间后均被观察到。然而，本研究仅局限于分析每只雌蝇仅面对一只雄蝇的试验条件。5一种更符合实际情况的场景是雌性个体遇到多个雄性个体9,10，允许雄性之间相互竞争，这可能有助于检测麻醉导致的雄性适应性更细微的下降。使用CO₂2 麻醉还被发现会降低成虫的繁殖力和寿命 D. melanogaster 当它们在羽化后不久即被暴露时，这在收集处女蝇时很常见11.
CO 的一种替代方案2 麻醉后通过喂食染料标记的饲料来标记果蝇4,6,10,12,13该染料可进入果蝇的肠道，并通过腹部可见，从而能够将染色的果蝇与未染色的果蝇或标记为不同颜色的果蝇区分开来。应用方法有所不同：可直接添加到食物中12，通过染色的补充性酵母膏6，或通过接触一种新的染色食物基质13这些标记技术似乎对交配行为没有影响4,6然而，一篇直接研究相同食用色素对成人的影响的论文 D. melanogaster 发现寿命显著缩短14此前的研究几乎完全集中在 D. melanogaster, 在CO效应方面2 麻醉5,11 和食用色素14 方法。目前，关于一氧化碳如何影响2&#160;麻醉或使用肠道染色会影响其他个体的交配行为 果蝇.
以下研究评估了CO2 麻醉对三种物种交配行为的影响 果蝇（D. melanogaster，D. pseudoobscura， 和 D. subobscura. 收集果蝇对CO的影响2 在单雄性和双雄性交配试验中均进行了检测。CO的影响2 也发现在不同情况下存在差异 D. melanogaster5因此，暴露于CO后的潜伏期各不相同2 并进行了交配测试。此外，还评估了一种替代麻醉和剪翅的标记方法：即利用食用染料对果蝇进行染色标记。

<table><tbody><tr><td>塑料管</td><td>Fisher Scientific</td><td>TWT-200-061G</td><td>其他类型的管材也可能适用，但必须能够插入1 ml移液器吸头内。</td></tr><tr><td>细网筛</td><td>任意裁缝用品店</td><td>-</td><td>细窗帘网布适用</td></tr><tr><td>1 ml移液器吸头</td><td>VWR</td><td>83007-376</td><td>各种品牌的移液器吸头均可使用</td></tr><tr><td>塑料小瓶</td><td>Sarstedt</td><td>58.49</td><td>也可使用更大的小瓶或瓶子</td></tr><tr><td>棉球</td><td>Lewis Medical Solutions</td><td>28170</td><td>棉球的尺寸将根据所用小瓶的大小而有所不同</td></tr><tr><td>蓝色食用色素</td><td>Thesugarcraftcompany</td><td>-</td><td>其他染料颜色和品牌可能会产生不同的效果</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气瓶</td><td>BOC</td><td>BOC 40VK</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie记号笔</td><td>Staedtler</td><td>Lumocolor 313 S</td><td>可使用多种颜色，但Lumocolor S在耐用性和精细度方面表现出色</td></tr><tr><td>秒表</td><td>Salter</td><td>SL3920</td><td>任何带有良好数字显示屏的秒表均可使用</td></tr></tbody></table>

为行为实验染色昆虫：麻醉状态下昆虫的交配行为 果蝇

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

使用交配实验 果蝇 极大地促进了对性选择和行为的理解。实验通常需要简单、快速且低成本的方法来区分试验中的个体。一种常用的技术是CO2 麻醉，然后对每只果蝇进行标记或剪翅。然而，这种方法具有侵入性，且已被证明会影响果蝇的行为。其他技术曾使用体色标记来识别果蝇。本文介绍了一种简单且非侵入性的果蝇标记方法 果蝇 可通过食用色素对个体进行标记，以便在实验中加以区分。该方法应用于两只雄性竞争与一只雌性交配的试验中。染色使得个体能够快速且易于识别。然而，在所测试的三个物种中，染色强度存在一定差异。数据显示，与一氧化碳相比，该染色方法对交配行为的影响较小2 在 黑腹果蝇. 一氧化碳的影响2 麻醉效果被证明取决于物种 果蝇，其中 D. pseudoobscura 和 D. subobscura 显示无影响，而 D. melanogaster 雄性个体的交配成功率降低。所介绍的染料方法适用于多种实验设计。

雄性交配试验——CO2 麻醉对交配行为的影响
能够解释 CO 效应变异性的最佳模型2 麻醉包含物种作为一个因素（以 D. pseudoobscura 和 D. subobscura 融合，因为它们彼此之间没有差异）。在 D. pseudoobscura 和 D. subobscura 二氧化碳没有显著影响2 麻醉对两次雄性交配试验中交配成功率的影响（Z1,589 = 0.087，P = 0.931）。对于 D. melanogaster，暴露于CO的雄性2 麻醉处理的个体交配成功率显著降低（Z1,589 = 2.467，P = 0.014）。物种与处理之间也存在显著的交互作用（χ21,589 = 6.83，P = 0.009），当观察到更大的效应时 D. melanogaster 在采集时或试验前1天暴露于气体表1。然而， D. melanogaster 暴露于一氧化碳的雄性2 实验前两天未显示出 CO 的作用效果2.
两次雄性交配试验——肠道着色对交配行为的影响
模型简化结果显示，三种果蝇中均未发现食用色素具有显著影响（P &gt; 0.1）。当分析中纳入处理方式或气体状态时，这些因素也均无显著性（P &gt; 0.1）。不同处理条件下，食用色素果蝇成功交配的比例见表2。食用色素饲料与无色素饲料饲养果蝇之间的体色差异可见于图1。肠道内食用色素的强度在D. pseudoobscura和D. subobscura中高于D. melanogaster。
单次交配试验——使用CO2麻醉对交配行为的影响
在使用CO2麻醉收集新羽化的成虫时，三种物种的交配潜伏期均无差异。在交配试验前两天暴露于CO2的条件下，D. subobscura的交配持续时间显示出影响（图2和图3；表2）。
<img alt="果蝇遗传学实验；两支含有幼虫的试管，成年果蝇表现出表型差异。" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 显示有色与无色果蝇培养基试管（A）以及雄性D. subobscura肠道着色强度（B）的照片。
<img alt="柱状图比较果蝇物种的带有误差线的时间数据；统计分析。" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 三种果蝇在单雄性试验中交配潜伏期的均值及95%置信区间，雄性在性成熟前作为处女蝇采集时经麻醉（浅色柱）或未经麻醉（深色柱）处理。
<img alt="比较不同果蝇物种交配持续时间的柱状图，包含表示变异性的误差线。" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 三种果蝇物种在单雄性试验中交配持续时间的均值及95%置信区间，雄性在性成熟前作为处女蝇采集时经麻醉（浅色柱）或未经麻醉（深色柱）处理。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>处理</td>
			<td>物种</td>
			<td>试验次数</td>
			<td>交配的染色果蝇数</td>
			<td>p值</td>
			<td>交配的麻醉果蝇数</td>
			<td>p值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">以 CO2 麻醉采集</td>
			<td>D. mel</td>
			<td>73</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td>27</td>
			<td>0.0344</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pse</td>
			<td>79</td>
			<td>41</td>
			<td>0.8221</td>
			<td>44</td>
			<td>0.3682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. sub</td>
			<td>71</td>
			<td>40</td>
			<td>0.3425</td>
			<td>33</td>
			<td>0.6353</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">暴露于 CO2 18 小时前</td>
			<td>D. mel</td>
			<td>57</td>
			<td>28</td>
			<td>1</td>
			<td>19</td>
			<td>0.0163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pse</td>
			<td>65</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>31</td>
			<td>0.8043</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. sub</td>
			<td>68</td>
			<td>38</td>
			<td>0.3961</td>
			<td>35</td>
			<td>0.9036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">暴露于 CO2 2 天前</td>
			<td>D. mel</td>
			<td>56</td>
			<td>19</td>
			<td>0.0222</td>
			<td>32</td>
			<td>0.3497</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pse</td>
			<td>70</td>
			<td>32</td>
			<td>0.5504</td>
			<td>33</td>
			<td>0.7202</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. sub</td>
			<td>56</td>
			<td>29</td>
			<td>0.8939</td>
			<td>26</td>
			<td>0.6889</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 所有被检测物种和处理条件下两次雄性选择实验的结果。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>性状</td>
			<td>d.f.</td>
			<td>t值</td>
			<td>p值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">D. melanogaster</td>
			<td>潜伏期</td>
			<td>58</td>
			<td>1.379</td>
			<td>0.174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>持续时间</td>
			<td>58</td>
			<td>1.243</td>
			<td>0.221</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">D. pseudoobscura</td>
			<td>潜伏期</td>
			<td>109</td>
			<td>0.419</td>
			<td>0.676</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>持续时间</td>
			<td>109</td>
			<td>0.436</td>
			<td>0.664</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">D. subobscura</td>
			<td>潜伏期</td>
			<td>83</td>
			<td>0.098</td>
			<td>0.922</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>持续时间</td>
			<td>83</td>
			<td>1.767</td>
			<td>0.081</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 单次交配实验结果：考察采集对CO的影响2 麻醉对交配潜伏期和持续时间的影响 在三个物种上进行了测试 果蝇 (D. melanogaster, D. pseudoobscura 和 D. subobscura).

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于对个体进行单独识别 果蝇 或其他昆虫。针对三个物种的交配成功率进行研究的示范数据 果蝇 表明该方法与使用CO相比具有相当或更优的效果2 麻醉

利用果蝇进行的交配实验极大地促进了人们对性选择和行为的理解。实验通常需要简单、便捷……

本实验的总体目标是以非侵入性的方式使昆虫在行为学实验中能够被明显区分。该方法首先在标准果蝇培养管中正常的果蝇培养基表面滴加数滴食用色素，使其表面明显着色。随后将果蝇放入培养管中培养三小时，此时果蝇的腹部应呈现出明显的颜色。可以进行交配实验，例如观察雌性是否更倾向于被染成特定颜色的雄性个体。最终，这种染色技术是一种快速、简单且非侵入性的标记昆虫方法，便于实验中的识别。与现有方法（如切除果蝇部分翅膀）相比，该技术的主要优势在于操作更快捷、侵入性更小，且对后续行为的影响更小。该方法可用于多种需要识别果蝇个体或类别的实验，且操作简便，适用于中小学或高校的简单实验。本技术由利物浦大学的两位博士研究生 Rudy Verse Bo 和 Chloe Hayes 演示。待培养基冷却凝固后，开始在培养基表面加入 0.5 至 1 毫升蓝色食用色素，并将染料均匀涂抹至离心管整个表面。然后将食物在 4°C 下保存两天，使食物上层充分吸收饲料。接着根据实验需求将果蝇转移至该食物中。一天内，摄取饲料的果蝇即可与未染色果蝇明显区分，可用于与染色果蝇进行交配试验。使用移液器将单个未交配雄蝇转移至含有20毫升培养基的标准75毫米×20毫米塑料培养瓶中。若进行双雄交配实验，则将每组处理中一半的雄蝇放入含彩色培养基的培养瓶中。随后，将新羽化的雌蝇按每10只一组转移至新鲜培养基培养瓶中。现在让两种性别的果蝇在适合该物种的温度下生长至性成熟阶段。当果蝇准备就绪后，将实验组雄性果蝇暴露于所需处理条件下。例如，在试验前一天，用二氧化碳麻醉其他果蝇，并标记试管，以识别处理方式及果蝇的颜色状态。将雌蝇转移至含有20毫升培养基的单个试剂瓶中，使果蝇适应交配环境，并使用中性标签标记试剂瓶以实现实验的盲法设计。然后，在每个含有单只雌蝇的交配瓶中加入一至两只雄蝇。视具体情况而定。开始交配试验，使其与培养箱的光照开启时间同步，共进行两次雄性果蝇交配试验。注意每次试验中的每只雄蝇应来自不同的处理组，并且其中一只果蝇需表现出腹部染色现象。记录每只雄蝇的处理方式及其体色特征。如果在两小时内发生交配，记录单只雄性交配试验中成功交配雄性的骰子状态。记录交配开始和结束的时间。然后计算该次试验的交配成功率潜伏期和持续时间数据。最能解释二氧化碳效应变异性的模型包含物种作为因子。例如，在这些代表性实验中，二氧化碳麻醉对果蝇的交配成功率没有显著影响。在黑腹果蝇的两次雄性实验中，伪隐果蝇和亚隐果蝇表现出交配行为，然而，暴露于二氧化碳麻醉的雄性果蝇交配成功率显著降低，当黑腹果蝇在采集时或实验前一日暴露于气体中，其影响更为明显。对于三种果蝇中的任何一种，食物染色果蝇在交配方面均未观察到显著差异，无论是否将处理因素纳入分析，或在单次交配实验中考虑昆虫的交配状态，交配情况均无差异。当使用二氧化碳麻醉来收集新羽化的成虫时，这三种物种均出现了延迟现象。仅在交配试验前两天暴露于二氧化碳的亚黑果蝇中观察到对交配持续时间的影响。观看本视频后，您应能充分了解如何在实验过程中利用肠道染色作为一种非侵入性技术对果蝇进行标记。在尝试该实验操作时，重要的是要检测目标染料对焦点物种可能产生的影响。某些染料可能具有毒性，而某些颜色可能直接影响交配成功率。例如，在某些物种中，红色食用色素可能更受偏好。在此，我们利用这种染料标记技术在竞争性交配实验中区分果蝇。然而，该技术也可用于多种其他需要对果蝇进行个体识别的实验，例如评估攻击性、领地防御、食物偏好活动或社会行为的实验。

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