在丝氨酸依赖的基因调控:一个快速和可靠的管道细菌转录组分析案例研究肺炎链球菌
2015年4月25日
这份手稿描述了 DNA 微阵列提供的最先进技术的使用。微阵列芯片概述了在特定条件下细菌发生的转录组变化。此外，我们强调了使用方便的内部开发软件包可以轻松分析大量数据。
该程序的总体目标是提供在特定条件下细菌转录组学变化的概述。这是通过首先在特定条件下生长和收获细菌细胞来实现的。接下来，从收获的细胞中分离总 RNA，并从 RNA 制备 CDNA。
然后将 CDNA 标记并与内部制造的微量测定载玻片杂交。最后，清洗载玻片，然后扫描和分析载玻片。最终，微阵列用于显示特定条件下细菌细胞的转录组变化。
与其他现有的基因表达研究方法（如 QPCR 或 Northern 印迹）相比，DNA 微阵列技术的主要优势在于，它提供了在特定条件下发生的所有转录组变化的全局概述。它快速、可靠且相对便宜。演示该程序的是我的分子遗传学实验室的 PSD 学生 Mohammed Sal 和 Airon Manzu 解冻后，s pmo、ED 39 细胞沉淀和 Resus 悬浮在 400 微升 te 中，根据文本方案，在无 RNA 螺旋帽管中制备以下内容，0.5 克玻璃珠，50 微升 10%SDS，500 微升先前制备的苯酚氯仿和重悬的细胞沉淀。
要破坏细胞，请将试管放入微珠打浆器中，匀浆两次，每次 60 秒，每次在两次脉冲之间将它们放在冰上 1 分钟，然后在 10， 000 Gs 和 4 摄氏度下离心样品 10 分钟。将上层相转移到新试管中，以 500 微升氯仿 i a、a 离心另外 5 分钟。从上相移取 500 μL 到新管中。
加入两倍体积的裂解结合缓冲液，并通过上下吹打混匀。然后使用 RNA 分离试剂盒按照制造商的方案分离总 RNA，以去除 RNA 中的污染 DNA。加入 100 微升 D a's one 混合物，并在 15 至 25 摄氏度下孵育 20 至 30 分钟。
使用 RN a 试剂盒洗涤清洁后的 RNA，并将洗脱液洗脱成 50 μL 体积，以便在 300 μL PCR 管中进行跪姿反应。将总 RNA 与 2 μL 随机单体混合，必要时使用不含核酸酶的水，使体积达到 18 μL。将跪着的混合物在 70 摄氏度下孵育 5 分钟。
然后在室温下冷却反应物 10 分钟，快速旋转，然后将试管放在冰上至少 1 分钟。要逆转录 CDNA，请制备逆转录混合物，将 18 微升混合物与 12 微升预混液混合，并在 42 摄氏度下孵育反应 2 至 16 小时。通过添加 3 微升 2.5 摩尔和一个 OH 并将其置于 37 摄氏度约 15 分钟，降解反应中的 mRNA。
然后加入 15 微升两摩尔堆游离酸以中和 NAOH。然后在使用 PCR 纯化柱用分光光度计纯化 CDNA 后，测量 CDNA 浓度以标记 CDNA。将 5 微升 am 平均反应性染料添加到每微升 CDNA 中 20 至 60 纳克。
将混合物置于黑暗并孵育的室温下 60 至 90 分钟，然后使用 PR 纯化柱用分光光度计纯化在 50 微升进化缓冲液中游离的染料标记的 CDNA，确保标记的 CDNA 浓度至少为 0.5 皮摩尔/微升，总体积为 50 微升。准备好害羞的缓冲液后，根据文本协议，将缓冲液在 68 摄氏度下预热至少 30 分钟。为了制备样品，混合等量的标记 CDNA，然后在高温下使用真空浓缩器将体积减少到 7 微升或更少。
同时，要清洁升降片以减少背景信号，请使用肥皂和大量自来水，然后在吹干升降片后用 100% 乙醇吹干，将一个放在载玻片上，白色特氟龙衬里朝下。接下来，将干燥的染料样品溶解在 7 微升 H 2 O 中，并在 94 摄氏度下孵育 2 分钟。立即加入 35 微升预热的害羞缓冲液，轻轻混合并旋转并以最大速度运行一分钟。
要沉淀沉淀物，请在加载前将探针在 68 摄氏度下预热约 5 分钟。要组装载玻片和升降片，请将杂交载玻片支架放在 50 摄氏度的加热块上。将带有升降玻片的 DNA 微阵列玻片放在加热的杂交玻片支架上，并用升降玻片预热玻片一分钟。
然后，尽快将 40 μL 样品目标添加到载玻片的末端。允许流体通过毛细管力在玻璃表面之间流动。现在从杂交炉中取出预热的杂交盒并关闭机器。
然后将浸泡有 3 毫升 Two XSSC 的滤纸放入杂交盒中。将带有载玻片的杂交玻片架轻轻放入杂交盒中。关闭杂交盒并将其放回杂交炉中，孵育 16 至 18 小时。
洗涤玻片时，准备新鲜的洗涤缓冲液 1、2 和 3，并将它们置于 30 摄氏度。为确保 SDS 在孵育完成后溶解，请尽快将玻片轻轻浸入装有 50 毫升洗涤缓冲液的 Falcon 管中，直到玻璃杯位于管底部。提升器滑动后，沉到管底而不刮伤阵列，用镊子取下载玻片并将其放入清洗站的机架中。
立即使用 500 mL 洗涤缓冲液 1 洗涤玻片 5 分钟。然后将玻片转移到洗涤缓冲液 2 中 20 到 30 分钟，然后再转移到 500 毫升洗涤缓冲液 3 中，持续 5 分钟。最后，在进行微阵列分析之前，以 2000 RPM 的转速干燥载玻片 2 分钟。
根据研究 L 丝氨酸对肺炎 S 综合征全转录组影响的文本方案，对在 CDM 中生长的 D 39 菌株与 150 μmol L Seine 中生长的 D 39 菌株与在同一培养基中生长的 D 39 菌株进行比较进行了分析。下表列出了从每种培养物中分离的总 RNA 的浓度，如下图所示。去除 DNA 后，检查 RNA 的质量。
这两个泳道代表来自 150 微摩尔围网的 RNA，而这两个泳道来自用 10 毫摩尔围网生长的培养物。存在两个透明条带表明 RNA 质量良好。从总 RNA 合成的 CDNA 浓度记录在该列中，此处列出了 AM 平均反应性染料标记样品的浓度。
如图所示，对 AM 平均无功晶片比率进行了散点图分析，并进一步分析了数据以降低噪声。下表总结了应用大于或等于两倍差异且 P 值小于 0.001 的标准后微阵列研究的结果。如图所示，与最大 L 丝蛋白相比，在最小 L 丝蛋白存在下，许多基因在此过程后表达差异。
其他方法，如 beag、电细胞测定 QPCR、敲除和/或表达强度，可用于回答即将到来的问题 在其开发之后。这项技术使分子和细胞生物学领域的 VFR 研究人员能够探索 RAM 阳性的调节网络和机制。
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概述
本手稿描述了使用DNA微阵列提供的最先进技术来分析细菌的转录组变化。该过程包括在特定条件下培养细菌细胞，分离总RNA，并使用内部开发的软件进行数据分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因组学
- 生物信息学
背景
- DNA微阵列是研究基因表达的强大工具。
- 转录组分析有助于理解细菌对环境变化的反应。
- 内部软件可以促进大型数据集的分析。
- 本研究集中在影响细菌细胞的特定条件。
研究目的
- 提供细菌转录组变化的概述。
- 展示DNA微阵列在分析基因表达方面的有效性。
- 突出使用自定义软件进行数据分析的便利性。
使用的方法
- 在特定条件下培养和收集细菌细胞。
- 从收集的细胞中分离总RNA。
- 将RNA转换为cDNA。
- 标记和杂交cDNA到微阵列片。
主要结果
- 成功分离RNA并转换为cDNA。
- cDNA有效杂交到微阵列片。
- 分析显示显著的转录组变化。
- 使用内部软件简化了数据分析。
结论
- DNA微阵列对于研究细菌转录组学有效。
- 自定义软件增强了数据分析能力。
- 此方法可以应用于各种细菌研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
DNA microarray technology enables rapid, cost-effective global transcriptome profiling in bacterial systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. By capturing genome-wide transcriptional responses to environmental stimuli such as nutrient availability, the method provides predictive confidence in pathway modulation and gene regulatory networks. This facilitates early-stage hypothesis triage and portfolio prioritization in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to serine availability, clarifying gene regulatory networks in S. pneumoniae.
- Operational Value: Provides a standardized workflow from cell harvest to data analysis using optimized RNA isolation and labeling protocols.
- Predictive Value: Identifies differentially expressed genes with ≥2-fold change and p<0.001, supporting confidence in target modulation under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide expression profiles enabling comparison of transcriptional states across growth conditions.
- Operational Value: Utilizes homemade microarray slides and standardized hybridization/wash buffers to ensure reproducibility and low background signal.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple samples via vacuum concentration and automated scanning for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro transcriptional responses to potential in vivo relevance by modeling nutrient stress conditions encountered during infection.
- Mechanistic De-risking: Clarifies serine-dependent gene regulation, reducing uncertainty in target essentiality and pathway inhibition strategies.
- Preclinical Alignment: Enables identification of co-regulated gene clusters that may represent druggable pathways or virulence modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in target validation and informing lead identification through mechanistic insights into bacterial adaptation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by revealing condition-specific transcriptional reprogramming.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs suitable for assay readiness and cross-condition comparison in antimicrobial screening campaigns.
- Analytics: Employs Microprep for preprocessing and Cyber-T for statistical analysis, enabling robust identification of significant expression changes.
- Translational Research: Connects laboratory observations to pathogenic relevance by modeling host-associated metabolic pressures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across bacterial strains and growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies through unbiased, global expression profiling.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA quality checks, dye labeling thresholds, and slide washing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by highlighting condition-specific essential genes and regulatory hubs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to microarray scanning equipment and spectrophotometric quantification tools.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation, labeling efficiency, and data preprocessing workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to Gram-negative or fastidious bacterial models.
- Limited by the requirement for prior sequence knowledge to design homemade microarray probes.
