Name: 在丝氨酸依赖的基因调控:一个快速和可靠的管道细菌转录组分析案例研究肺炎链球菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 了解如何使用DNA微阵列技术分析肺炎链球菌在特定条件下的转录组变化。该方法包括细菌培养、RNA提取、cDNA合成与标记、杂交及数据分析，为研究细菌基因调控网络提供快速可靠的实验流程。

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感谢 Anne de Jong 和 Siger Holsappel 在 DNA 微阵列芯片制备方面的帮助。同时感谢 Anne de Jong 在生物信息学分析方面的支持。我们还感谢 Jelle Slager 对论文的审阅。Muhammad Afzal 和 Irfan Manzoor 由巴基斯坦高等教育委员会（HEC Pakistan）教师发展计划资助，由巴基斯坦费萨拉巴德政府学院大学（GC University, Faisalabad, Pakistan）支持。

1. 培养基制备与细胞培养
<ol>
	<li>培养 S. pneumoniae D39 野生型菌株21 如前所述11. 将保存在 -80 的细胞接种&#160;o在50 ml化学成分明确培养基（CDM）中，含10%甘油（以1/100比例加入50 ml无菌管），终末pH为6.4 15，但需从氨基酸混合物中省略L-丝氨酸。 
	注意：使用了两种不同的化学成分明确培养基（CDM）；一种含有最低浓度的L-丝氨酸（150 µM），另一种含有最高浓度的L-丝氨酸（10 mM）。该最低浓度基本相当于人血浆中L-丝氨酸的浓度，目的是比较基因表达水平 S. pneumoniae D39菌株在这两种条件下。</li>
</ol>
2. 总RNA的提取
<ol>
	<li>材料
	<ol>
		<li>使用酸性酚（酸性苯酚），RNA 级，用于总 RNA 的提取。</li>
		<li>Macaloid
		<ol>
			<li>将2克Macaloid悬浮于100 ml TE中，煮沸5分钟。冷却至室温，超声处理至Macaloid形成凝胶。在2,000 × g条件下离心溶液5分钟。&#160;室温下，重悬于50 ml TE缓冲液（pH 8）中，4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>溶液：
		<ol>
			<li>所有溶液均用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。每100 ml溶液中加入100 µl DEPC，37 °C孵育过夜，然后15 min高压灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法
	<ol>
		<li>培养50 ml的 S. pneumoniae D39 细胞在 50 ml 离心管中于 37 ℃ 培养 oC（不振荡）至对数中期（OD ~0.3）。在 4 °C、10,000 × g&#160;孵育2分钟。弃去培养基，立即将细胞沉淀物在液氮中冷冻。</li>
		<li>预先混合 300 µl 氯仿:IAA（24:1）和 300 µl 苯酚（酸性苯酚，RNA 级）。在步骤 2.2.3 中使用 500 µl 有机相。</li>
		<li>提前在无RNA的螺旋盖管中配制以下混合液：0.5 g 玻璃珠、50 µl 10% SDS、500 µl 苯酚/氯仿:IAA（按步骤2.2.2制备）、Macaloid层（150–175 µl，体积无需精确，因其黏稠度较高）。用400 µl TE（DEPC）重悬细胞沉淀，并将重悬后的细胞加入螺旋盖管中。</li>
		<li>为破碎细胞，将带螺口盖的离心管放入珠磨机中，以每次60秒、共2次脉冲（“均质”）进行处理，两次之间间隔1分钟&#160;冰上孵育一定时间。将样品离心10分钟&#160;在10,000 × g&#160;(4 °C)</li>
		<li>将上层相转移至新离心管中，加入500 µl 氯仿:IAA（24:1），在10,000 × g条件下离心5分钟 g (4 °C)</li>
		<li>将上相500 µl转移至新的离心管中，加入2倍体积（1 ml）裂解/结合缓冲液，通过反复吹打混匀。使用RNA提取试剂盒并按照制造商推荐的方案分离总RNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RNA&#160;纯化
<ol>
	<li>为去除总RNA中的DNA污染，加入100 µl DNA酶I混合液（90 µl DNA酶缓冲液和10 µl DNA酶I），在15-25 ºC下孵育20-30分钟。</li>
	<li>使用RNA酶试剂盒洗涤纯化后的RNA，收集50 µl洗脱液。</li>
</ol>
4. RNA 分析
<ol>
	<li>使用分光光度计测定 RNA 浓度。通过以下方法检测 RNA 质量（图 2）。
	<ol>
		<li>取 1 µl 样品与 50 µl DEPC 水混合稀释，使浓度达到 20–200 ng/µl。</li>
		<li>取 1 µl 稀释后的 RNA 样品，按照制造商说明书在 Bioanalyzer 上检测其质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注意：23S:16S 比值约为 2.0 时视为质量良好。1 A260 单位的 RNA 相当于 40 µg/ml。建议用于标记的 RNA 量为 10–20 µg。</li>
</ol>
5. cDNA 的制备与标记
注意：以下方案用于 cDNA 的制备与标记。
<ol>
	<li>退火
	<ol>
		<li>在300 µl PCR管中进行退火反应，自制载片的总RNA浓度保持为10–15 µg，商用载片为5 µg。将RNA与2 µl随机九聚体（1.6 µg/µl）混合，必要时加入无核酸酶水，使退火混合物的终体积为18 µl。</li>
		<li>将退火混合物在70 °C孵育5分钟。随后冷却至室温&#160;10分钟（退火），如需要，短暂离心使反应液沉降至管底。将反应管置于冰上至少1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录
	<ol>
		<li>按如下方法配制逆转录酶混合液：向18 µl退火混合物中加入12 µl主混合液（包含6 µl 5x第一链缓冲液、3 µl 0.1 M DTT、1.2 µl 25x AA-dUTP/核苷酸混合液和1.8 µl逆转录酶（商用载片使用1 µl））。在42 °C孵育反应混合物2–16小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. mRNA 的降解与 cDNA 的纯化
<ol>
	<li>为降解反应混合物中的 mRNA，加入 3 µl 的 2.5 M NaOH，并于 37 °C 孵育约 15 分钟。随后加入 15 µl 的 2 M HEPES 游离酸以中和 NaOH。</li>
	<li>使用 PCR 纯化柱纯化 cDNA 混合物，并按照制造商的说明书操作。</li>
</ol>
7. cDNA 浓度的测定
<ol>
	<li>使用分光光度计测定 cDNA 浓度。若要继续进行标记步骤，需确认 cDNA 浓度至少为 60 ng/µl（自制载玻片）或 20 ng/µl（公司制备的载玻片）。</li>
</ol>
8. 使用胺反应性染料标记 cDNA 及纯化
<ol>
	<li>使用胺反应性染料标记 cDNA。将 cDNA 与一份胺反应性染料（5 µl）直接混合。</li>
	<li>将混合物在室温避光条件下孵育 60 至 90 分钟，随后直接进行染料标记 cDNA 的纯化。使用 PCR 纯化柱并按照制造商的说明书纯化染料标记的 cDNA。用 50 µl 洗脱缓冲液洗脱 cDNA。</li>
</ol>
9. 标记cDNA的测定
<ol>
	<li>使用分光光度计检测胺反应性染料在cDNA中的掺入情况。检查胺反应性染料的浓度是否在50 µl总体积中至少达到0.5 pmol/µl。</li>
</ol>
10. 标记cDNA样品的混合
<ol>
	<li>对于自制芯片，应使用全部标记的cDNA进行杂交，且cDNA浓度差异不超过30%。对于商业芯片，所用cDNA的浓度差异不得超过2倍。 
	注意：通常情况下，商业芯片约需300 ng cDNA，与自制芯片所需的cDNA量相比，用量极少。</li>
</ol>
11. 杂交与洗涤
<ol>
	<li>使用以下试剂：去离子水、99% 乙醇、SHY 缓冲液（自制；含&#160;40 µl 酵母RNA）。SHY溶液最大制备量为1 ml。</li>
	<li>仪器与溶液的准备
	<ol>
		<li>至少在干燥前1小时打开真空浓缩仪和加热器。打开杂交炉，并将设定温度调整至正确的杂交温度（对于 S. pneumoniae DNA 微阵列使用 45 °C。同样，将杂交盒和烘箱预热 30-60 分钟。</li>
		<li>将SHY缓冲液在68 ˚C预热至少30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备（标记的 cDNA）
	<ol>
		<li>等量混合标记的cDNA（最大差异不超过30%）。使用真空浓缩仪在高温下干燥样品（约40分钟），直至体积小于7 µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>升降器-滑脱
	<ol>
		<li>使用洁净的盖玻片。注意：载玻片上可加载约 ± 30 µl 液体。</li>
		<li>用肥皂、大量自来水和100%乙醇清洁载片架。注意：脏的载片架会导致高背景。</li>
		<li>用气枪吹干载片架，以去除灰尘颗粒。将一块干净的载片架放置在载玻片上，确保两侧的白色聚四氟乙烯衬垫朝下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入杂交缓冲液（至标记的 cDNA）
	<ol>
		<li>将干燥的染料样品溶于 7 µl H2O，并在 94 °C 下孵育 2 分钟。</li>
		<li>立即加入35 µl预热的SHY缓冲液（68 °C），轻轻混匀后以最大速度离心1分钟，以去除沉淀物。在上样前，将探针于68 ˚C预热约5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片托架-载玻片组件装配及预热
	<ol>
		<li>将杂交玻片架置于50 ˚C的加热块上。将带有加样槽的DNA微阵列玻片放置在预热的杂交玻片架上，并预热带加样槽的玻片约1分钟。随后步骤应尽快完成。</li>
		<li>向载玻片末端加入 40 µl 样品靶标，通过毛细作用使液体在玻璃表面间流动。所有移液操作均应缓慢且小心进行。</li>
		<li>始终保持载玻片与升降滑块水平，并缓慢移动，以确保升降滑块未发生位移。</li>
		<li>从杂交炉中取出预热的杂交盒，并关闭仪器。将用3 ml 2x SSC（标准柠檬酸钠）溶液浸润的滤纸放入杂交盒中。</li>
		<li>将装有载玻片的杂交孵育盒轻轻放入杂交盒中，盖上杂交盒并再次置于杂交炉中（约16-18小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载玻片清洗
	<ol>
		<li>配制新鲜的洗涤缓冲液 I、II 和 III（每个洗涤步骤需 750 ml）。配制 500 ml 洗涤缓冲液 I，使用 2 x SSC / 0.5 % SDS；配制 500 ml 洗涤缓冲液 II，使用 1 x SSC / 0.25 % SDS；配制 500 ml 洗涤缓冲液 III，使用 1 x SSC / 0.1 % SDS（可选）</li>
		<li>将洗涤缓冲液置于 30 °C（以确保 SDS 完全溶解）。</li>
		<li>尽快但非常轻柔地将载玻片浸入装有50 ml洗涤缓冲液I的 Falcon 管中，直至玻片底部接触管子的锥形底部。</li>
		<li>数秒后，当提升滑块沉降至管底时，用镊子取出载玻片，避免刮擦芯片阵列，并将其放入洗涤站的支架中。立即继续洗涤步骤，不得有时间间隔。</li>
		<li>在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液I洗涤载玻片5分钟。随后在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液II洗涤20-30分钟。同样，在洗涤站中用500 ml洗涤缓冲液III洗涤载玻片5分钟（可选）。</li>
		<li>以2,000 rpm离心2分钟，干燥载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. 微阵列分析
<ol>
	<li>使用扫描仪以相应波长扫描图像，并保存至“Jove Project”文件夹中。</li>
	<li>使用软件初步分析扫描文件，具体方法如前所述22。运行该软件后，选择“Open Image”选项卡，将红色图像文件（-.550）加载为“Red”，绿色图像文件（-.635）加载为“Green”。通过选择“Load Array List”选项卡，上传包含 S. pneumoniae 芯片列表的 gal 文件（.gal）至图像文件中22。 
	注意：此阵列列表包含48个网格，每个网格有16行和15列。网格上的每个点代表一个单独的基因，点的位置信息（包括基因名称）通过点描述文件添加。点的编号从左到右、从上到下依次排列。</li>
	<li>仔细点样后，选择“Find Array, Find Blocks, Align Features”选项卡以对点阵进行对齐。完成所有特征对齐后，选择“Analyzing”选项卡进行图像分析。创建包含结果、直方图和散点图的新文件。通过“Save results as”选项卡将该文件保存为.gpr文件，用于后续分析。</li>
	<li>使用内部开发的 Microprep 软件包对数据进行进一步的标准化和处理，具体步骤如下所述9.</li>
	<li>使用染料交换的独立生物学重复样本进行DNA微阵列数据分析。按照文献1所述方法，采用CyberT实现一种t检验的变体，并计算错误发现率（FDR）。9.</li>
	<li>对于差异表达基因，取 p &#60; 0.001 和 FDR &#60; 0.05 作为标准。</li>
	<li>在NCBI提交页面上传DNA微阵列数据，以获取GEO（基因表达综合数据库）登录号。</li>
</ol>

<ol><li>Kayala, M. A., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyber-T+web+server%3A+differential+analysis+of+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data.</a> Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).</li>
<li>Chang, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+cells+to+matrixes+of+distinct+antibodies+coated+on+solid+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface.</a> J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).</li>
<li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
<li>Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+procedure+for+the+isolation+of+RNA+from+high-phenolic-containing+tissues+of+pecan%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan.</a> 27 (12), 1316-1318 (1992).</li>
<li>Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extraction+of+intact+RNA+from+fruits+rich+in+polysaccharides+using+ripe+mango+mesocarp%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp.</a> (5), 440-442 (1992).</li>
<li>Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Report%22%5BJournal%5D)">A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).</li>
<li>Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+protocol+for+isolation+of+functional+RNA+from+plant+tissues+rich+in+secondary+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Report%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites.</a> Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).</li>
<li>Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+isolating+high-quality+RNA+from+leaves+of+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Enol.+Vitic%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine.</a> Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).</li>
<li>Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPreP%3A+a+cDNA+microarray+data+pre-processing+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework.</a> Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).</li>
<li>Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors+in+host+respiratory+colonization+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease.</a> Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacR+is+a+repressor+of+lacABCD+and+LacT+is+an+activator+of+lacTFEG%2C+constituting+the+lac+gene+cluster+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).</li>
<li>Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UlaR+activates+the+expression+of+the+ula+operon+in+Streptococcus+pneumoniae+in+the+presence+of+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid.</a> Microbiol. Read. Engl. , (2014).</li>
<li>Hendriksen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+contributions+of+glutamine-dependent+regulator+GlnR+and+GlnR-regulated+genes+to+virulence+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae.</a> Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+arginine+acquisition+and+virulence+gene+expression+in+the+human+pathogen+Streptococcus+pneumoniae+by+transcription+regulators+ArgR1+and+AhrC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC.</a> J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).</li>
<li>Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+have+neighbour%27s+fare%3A+extending+the+molecular+toolbox+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Read.+Engl%22%5BJournal%5D)">To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIVA%3A+Functional+Information+Viewer+and+Analyzer+extracting+biological+knowledge+from+transcriptome+data+of+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinforma.+Oxf.+Engl%22%5BJournal%5D)">FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes.</a> Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosecutor%3A+parameter-free+inference+of+gene+function+for+prokaryotes+using+DNA+microarray+data%2C+genomic+context+and+multiple+gene+annotation+sources%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources.</a> BMC Genomics. 9, 495(2008).</li>
<li>Blom, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCLOSE+%3A+DISsection+of+CLusters+Obtained+by+SEries+of+transcriptome+data+using+functional+annotations+and+putative+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites.</a> BMC Bioinformatics. 9, 535(2008).</li>
<li>Baerends, R. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome2D%3A+a+visualization+tool+for+the+rapid+analysis+of+bacterial+transcriptome+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data.</a> Genome Biol. 5 (5), R37(2004).</li>
<li>De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PePPER%2C+a+webserver+for+prediction+of+prokaryote+promoter+elements+and+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons.</a> BMC Genomics. 13, 229(2012).</li>
<li>Lanie, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Avery%27s+virulent+serotype+2+strain+D39+of+Streptococcus+pneumoniae+and+comparison+with+that+of+unencapsulated+laboratory+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6.</a> J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).</li>
<li>Molecular Devices, Corp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GenePix+Pro+6.0+Microarray+Acquisition+and+Analysis+Software+for+GenePix+Microarray+Scanners-Use%27s+Guide+and+Tutorial%22">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial</a>. , Molecular Devices, Corp. (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们描述了一种用户友好的实验方案，可用于细菌的全转录组分析。该技术的关键在于，细胞收获的条件可能因具体情况而异。在收获细胞并提取RNA之后，此技术对所有类型的细菌样本均相同，并遵循完全一致的操作步骤，因此可适用于任何类型的细菌培养物。该方案非常简单便捷，从RNA提取开始。我们的RNA提取方案（使用Macaloid和RNA提取试剂盒）相较于传统的苯酚-氯仿法和Trizol法更节省时间。下一步是使用逆转录酶III进行cDNA的合成。随后进行cDNA标记，首先将cDNA与胺反应性染料混合，然后纯化标记后的cDNA。标记过程同样简便，耗时较短，样品只需在避光条件下孵育约1小时即可。所有这些步骤均可在任何标准实验室中完成，无需特殊设备。扫描芯片需要使用微阵列扫描仪。芯片扫描与数据分析采用GenePix Pro软件，该软件操作极为简单且易于使用22。
完成所有实验后，使用 MicroPrep 和 CyberT 进行数据分析。MicroPrep 软件包包含三个模块， 即PrePreP、PreP 和 PostPreP9该数据预处理框架可...

在特定时间点或特定条件下，对单细胞生物或真核细胞基因组所编码的全部mRNA丰度（转录组）进行的研究，包括基因过表达或基因敲除情况下的分析，称为转录组学。转录组学使我们能够观察在某一时间点X的特定条件下基因的表达程度，并提供基因表达水平相对于参考样本的强弱信息。
微阵列是一种固定在固体基质（通常为玻璃载片或硅薄膜芯片）上的二维阵列，可用于利用高通量筛选以及微型化、多重化和平行化处理与检测方法来检测大量生物材料。微阵列有多种类型，包括DNA微阵列、蛋白质微阵列、多肽微阵列、组织微阵列、抗体微阵列、细胞微阵列等。DNA微阵列本质上是由固定在固体表面（通常为玻璃）上的大量微小DNA点组成。DNA微阵列可用于同时检测一个或多个基因的表达水平，或对基因组的多个区域进行基因分型2,3。每个代表特定DNA序列（也称为报告基因）的DNA点中含有皮摩尔（10-12 摩尔）量的探针。来自样本的标记mRNA分子被称为“靶标”。通过使用荧光染料来检测探针与靶标的杂交情况，荧光标记靶标的检测结果可反映靶标中核酸序列的相对丰度。由于微阵列可包含数万个探针，因此一次微阵列实验可同时完成多项遗传检测。一个简单的微阵列实验设计如图1所示。最近，我们实验室及其他实验室已证实这些微阵列可重复使用，使该技术具有较高的成本效益。
多年来已开发出多种RNA分离与纯化技术，包括C-TAB、SDS和GT法4–8。此外，市面上也有多种商用试剂盒可供选择。对于基因表达研究而言，高质量的RNA至关重要。因此，RNA分离方法经过优化以获得最大量的RNA。同样，cDNA的制备及标记步骤也得以简化。扫描后的数据归一化通过使用自主研发的软件包和工具高效完成9。
Streptococcus pneumoniae 是一种革兰氏阳性人类病原菌，定植于鼻咽部，可引起肺炎、败血症、中耳炎和脑膜炎等多种感染10。该细菌能够利用多种生长和生存所必需的营养物质11,12。已有大量研究关注肺炎链球菌的氮代谢及其调控机制，强调了氨基酸及其在毒力中的作用13,14。本研究采用DNA微阵列技术，报道了S. pneumoniae 对L-丝氨酸（一种在人血浆中含量丰富的氨基酸）不同浓度的转录组响应。通过比较S. pneumoniae 在最低L-丝氨酸浓度（150 µM）与最高浓度（10 mM）条件下的转录组反应，开展分析。本研究使用化学成分明确的培养基（CDM或最小培养基）15，以精确控制丝氨酸浓度。本研究的重点是使该技术更易于操作，并提供多种数据标准化与分析工具。因此，开发了多种用于数据分析与解释的工具。FIVA（功能信息查看与分析平台）提供了一个处理具有相似基因表达模式的基因簇中所含信息的平台，并可用于构建功能谱型16。PROSECUTOR 是另一款软件包，有助于识别基因的假定功能和注释17。通过使用聚类方法，DISCLOSE 提供了一种DNA结合位点检测算法，可用于预测基因的cis-调控基序18。Genome2D 提供了一个基于Windows的平台，通过多种颜色范围在基因组图谱上可视化和分析转录组数据，以表征基因表达水平的变化19。PePPER网络服务器除了提供一体化分析方法外，还提供了一个用于挖掘调控子、启动子和转录因子结合位点的工具箱20。使用该软件包可实现对细菌基因组中非编码区的完整注释。生物学家可从PePPER中获益良多，因为它提供了一个实验设计平台，可用于在体外验证假设信息in vitro20。这些软件包极大地促进了微阵列数据分析，其中大多数均可免费获取，使数据标准化和分析过程更加可靠。

<table><tbody><tr><td>酸性酚</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA 提取试剂盒</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>第一链缓冲液</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY 缓冲液</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac 冷却器</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac 浓缩仪 plus</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>擦拭纸</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix 自动加载仪 4200A1</td><td>MSD analytical technologies</td><td></td><td>微阵列扫描仪</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

一种快速可靠的细菌转录组分析流程 
案例研究：丝氨酸依赖性基因调控 肺炎链球菌

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

基因表达及其调控对于理解细胞在不同条件下的行为至关重要。目前有多种技术可用于研究基因表达，但大多数技术在提供整个转录组表达情况的整体图景方面存在局限性。DNA 微阵列提供了一种快速且经济的研究技术，能够全面概述全局基因表达，其应用广泛，包括新基因和转录因子结合位点的鉴定、细胞转录活性的表征，以及帮助在单次实验中分析数千个基因。在本研究中，我们优化了从细菌细胞收获到 DNA 微阵列分析的转录组研究条件。综合考虑实验的时间、成本和准确性，该技术平台被证明在研究细菌转录组方面非常有用且具有广泛的适用性。在此，我们以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为案例，通过比较在培养基中添加不同浓度 L-丝氨酸条件下 S. pneumoniae 的转录响应，进行 DNA 微阵列分析。采用 Macaloid 方法并结合 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，并使用 RNA 质量检测试剂盒检测 RNA 质量。利用逆转录酶合成 cDNA，并使用两种胺反应性荧光染料之一对 cDNA 样本进行标记。采用自制的 DNA 微阵列芯片对标记后的 cDNA 样本进行杂交，微阵列数据通过 cDNA 微阵列数据预处理框架（Microprep）进行分析。最后，使用 Cyber-T 对 Microprep 生成的数据进行分析，以鉴定具有统计学显著性的差异表达基因。此外，还使用了自主研发的软件包（PePPER、FIVA、DISCLOSE、PROSECUTOR、Genome2D）对数据进行分析。

RNA、cDNA 的提取与分析
L-丝氨酸是一种必需氨基酸，在儿童和成人血液血浆中的浓度范围为60-150 µM。它在嘌呤和嘧啶生物合成中的作用凸显了其在代谢过程中的重要性，并且是多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸和色氨酸）的前体。为了研究L-丝氨酸对S. pneumoniae D39野生型菌株全转录组的影响，进行了微阵列分析，比较了D39菌株在化学成分确定培养基（CDM）中分别含有最低浓度（150 µM）和最高浓度（10 mM）L-丝氨酸条件下的基因表达差异。首先，从两种不同浓度条件下培养的细胞中提取总RNA。RNA样品的浓度见表1。使用质控检测方法评估总RNA的质量。在进行该检测前，RNA经DNase I处理以去除可能存在的基因组DNA。图2展示了RNA的质量情况；其中L泳道为分子量标记，泳道1和2代表150 µM丝氨酸条件下的RNA，泳道3和4代表10 mM丝氨酸条件下的RNA。两条对应于两种RNA亚基的清晰条带表明RNA质量良好，可进行后续实验步骤。
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本文描述了利用DNA微阵列提供的尖端技术。微阵列可提供细菌在特定条件下所发生的转录组变化的全面概览。此外，我们还强调了通过使用便捷的自主开发软件包，能够轻松分析大量数据的优势。

基因表达及其调控对于理解细胞在不同条件下的行为至关重要。如今，多种技术被用于……

本实验的总体目标是概述细菌在特定条件下发生的转录组变化。首先在特定条件下培养并收集细菌细胞，然后从收集的细胞中提取总RNA，并以RNA为模板合成cDNA。然后对cDNA进行标记，并杂交到实验室自制的微阵列芯片上。最后，芯片经过洗涤后进行扫描和分析。最终，利用微阵列技术展示细菌细胞在特定条件下的转录组变化。与研究基因表达的其他现有方法（如定量PCR或Northern印迹）相比，DNA微阵列技术的主要优势在于，它能够提供特定条件下所有转录组变化的全局概览。该方法快速、可靠且相对经济。演示本实验操作的将是来自我实验室分子遗传学方向的PSD学生Mohammed Sal和Airon Manzu。在解冻spmo、ED 39细胞沉淀并按照文本方案将其重悬于400微升te中后，于无RNA酶的螺旋盖离心管中配制以下组分：0.5克玻璃珠、50微升10% SDS、500微升预先配制的酚-氯仿混合液以及重悬后的细胞沉淀。为裂解细胞，将离心管放入珠磨机中，每次震荡60秒，共两次，两次之间将样品置于冰上冷却一分钟。随后在10,000 G和4摄氏度条件下离心10分钟。将上层液体转移至新的离心管中，加入500微升氯仿，混匀后再次离心5分钟。用移液器从上层液体中取出500微升转移至新的离心管中。加入两倍体积的裂解结合缓冲液，通过上下吹打混匀。然后使用RNA提取试剂盒，按照制造商的说明书操作，分离总RNA以去除RNA中的污染性DNA。加入100微升的DNase I反应液，在15至25摄氏度下孵育20至30分钟。使用RN a试剂盒洗涤纯化的RNA，并将其洗脱至50微升体积中，用于在300微升PCR管中进行反转录反应。将总RNA与2微升随机引物混合，必要时使用无核酸酶水将体积补至18微升。将反转录反应体系在70摄氏度孵育5分钟。然后将反应物在室温下冷却10分钟，并在将离心管置于冰上至少1分钟前短暂离心。为进行cDNA反转录，配制反转录混合液，将18微升混合液与12微升主混合液混合，于42摄氏度孵育反应体系2至16小时。通过加入3微升2.5摩尔氢氧化钠降解反应中的mRNA，并在37摄氏度下放置约15分钟。然后加入15 µL的2 M磷酸（无酸）以中和NaOH。随后使用PCR纯化柱纯化cDNA，并用分光光度计测定cDNA浓度以进行标记。向每微升含20至60 ng的cDNA中加入5 µL的胺反应性染料。将混合物置于避光处，在室温下孵育60至90分钟，然后使用PR纯化柱进行纯化，用50微升洗脱缓冲液洗脱标记的cDNA。使用分光光度计检测，确保标记cDNA的浓度在50微升总体积中至少为0.5皮摩尔/微升。按照文本方案配制杂交缓冲液后，将缓冲液在68摄氏度预热至少30分钟。制备样品时，等量混合标记的cDNA，然后使用高温真空浓缩仪将体积减少至7微升或更少。在此期间，为清洁提升器滑片以降低背景信号，需使用肥皂和大量自来水清洗，然后在吹干后的提升器滑片上用100%乙醇处理，再将一片滑片置于载玻片上，白色聚四氟乙烯衬里朝下。接下来，将干燥的染料样品溶解于7 µL H₂O中，在94 °C孵育2分钟。立即加入35 µL预热的shy缓冲液，轻轻混匀后以最大速度离心1分钟。为沉淀物离心，需在上样前将探针于68摄氏度预热约五分钟。组装载玻片和盖玻片时，将杂交载玻片架置于50摄氏度的加热块上。将DNA微阵列载玻片与盖玻片一起放置在预热的杂交载玻片架上，并将载玻片连同盖玻片预热一分钟。然后，尽快将40微升的样本靶标加入到载玻片的一端。通过毛细作用使液体在玻璃表面之间流动。现在，从杂交炉中取出预热的杂交盒，并关闭仪器。然后将用3毫升2×SSC溶液浸湿的滤纸放入杂交盒中。轻轻将载有玻片的杂交孵育架放入杂交盒内。盖上杂交盒，放回杂交炉中，于16至18小时内进行孵育。为清洗载玻片，配制新鲜的洗涤缓冲液一、二和三，并将其置于 30 摄氏度环境中。为确保 SDS 在孵育结束后充分溶解，应尽快将载玻片轻轻完全浸入装有 50 毫升洗涤缓冲液一的 Falcon 管中，直至玻片沉降至管底。当载玻片自然滑落并沉至管底且未刮伤芯片表面时，用镊子取出载玻片，并放入洗涤站的支架中。立即用500毫升洗涤缓冲液一清洗载玻片5分钟。然后将载玻片转移至洗涤缓冲液二中孵育20至30分钟，再将其转入500毫升洗涤缓冲液三中清洗5分钟。最后在2000 RPM条件下离心干燥载玻片2分钟，随后进行微阵列分析。根据该实验方案，为研究L-丝氨酸对肺炎链球菌（S. pneumoniae）D39野生型菌株全转录组的影响，对在化学成分明确培养基（CDM）中分别添加150微摩尔L-丝氨酸和10毫摩尔L-丝氨酸条件下培养的D39菌株进行了微阵列分析。该表格列出了如图所示各培养物中提取的总RNA浓度。在去除DNA后，对RNA的质量进行了检测。这两条泳道代表来自 150 微摩尔/升 Seine 的 RNA，另两条泳道来自在 10 毫摩尔/升 seine 中培养的样品。两条清晰条带的存在表明 RNA 质量良好。由总 RNA 合成的 cDNA 浓度记录在此列中，而 AM 均值反应性染料标记样品的浓度则列于此处。本图展示了 AM 平均反应性染料比率的散点图分析，且对数据进行了进一步分析以降低噪声。该表格总结了在应用差异大于或等于两倍且 P 值小于 0.001 的标准后，微阵列研究的结果。如图所示，在最低量 L-丝氨酸存在条件下，多个基因的表达水平相较于最大量条件下表现出差异表达。此结果基于上述实验步骤得出。其他方法，如beag、电细胞测定、QPCR、基因敲除以及表达强度分析等，可在该技术开发后用于解答后续提出的问题。该技术为VFR研究人员在分子与细胞生物学领域探索RAM阳性样本中的调控网络与作用机制提供了有力工具。

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生物学

在丝氨酸依赖的基因调控：一个快速和可靠的管道细菌转录组分析案例研究<em&gt;肺炎链球菌</em

本方案提供了一种利用自动荧光延时显微镜随时间监测不同细菌单细胞行为的逐步操作流程。此外，我们还提供了显微镜图像分析的指导方法。...

活细胞成像 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 使用自动延时显微镜技术

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。...

配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

本视频演示了一种 体内 在细菌中进行的用于研究RNA结合蛋白（RBPs）与RNA相互作用的检测。将两种质粒构建体转化至细菌细胞中——一种为结合位点质粒，编码在RBP结合位点下游含有荧光报告基因的mRNA；另一种为RBP质粒，在诱导剂调控下表达RBP蛋白。当通过诱导剂增加RBP的表达时，RBP结合到mRNA上，导致报告基因的翻译受到抑制 通过...

研究目的基因翻译调控的报告基因抑制实验

本文介绍了用于假定噬菌体基因功能表征的表型组学方法。技术包括一种可监测宿主合成代谢的改良检测方法——多表型检测平板（MAPs），以及能够测量对分解代谢影响的既定代谢组学方法。...

噬菌体表型组学：通过生理学方法表征新型病毒蛋白

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

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发现CsgD调控靶点 沙门氏菌 使用染色质免疫沉淀和高通量测序（ChIP-seq）研究生物膜

我们描述了一种在革兰氏阴性细菌中构建饱和转座子突变文库的方法，以及随后为高通量测序制备DNA扩增子文库的步骤。以ESKAPE病原体Acinetobacter...

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本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。...

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一种用于合成生物学与天然产物研究的高效 Streptomyces 转录-翻译工具包

了解如何使用DNA微阵列技术分析肺炎链球菌在特定条件下的转录组变化。该方法包括细菌培养、RNA提取、cDNA合成与标记、杂交及数据分析，为研究细菌基因调控网络提供快速可靠的实验流程。

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