Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

该程序的总体目标是说明从 T 淋巴细胞系中体外产生淋巴细胞微粒或 LMP，并证明它们对气道上皮细胞的促凋亡作用。这是通过首先生产 LMP 来实现的。接下来，通过传真分析对分离的 LMP 进行表征。

然后培养支气管组织外植体。最后，对支气管外植体进行 LMP 处理。最终，组织病理学检查如血红蛋白、厚蛋白和伊红以及 NC 双细胞死亡检测用于显示 LMP 诱导的支气管上皮层损伤和上皮细胞凋亡。

与现有方法（如从人外周血中分离微粒）相比，该技术的主要优势在于，我们能够在体外作用下大规模生成源自细胞系的微粒。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为支气管外膜培养的关键步骤不容易准备。开始培养。

CEMT 细胞装在四个 T 1 75 培养瓶中，每个培养瓶含有 150 mL新鲜培养基，并在 37 摄氏度下孵育至每毫升 200 万个细胞的密度。通过以 200 倍 G 离心 5 分钟从每个培养瓶中收集细胞，然后将 6 个细胞弯曲 300 倍 10 放入含有 150 毫升新鲜培养基的新 T 1 75 培养瓶中。为了保持每毫升 200 万个细胞的密度，向培养基中加入 37.5 微升肌动蛋白霉素 D，终浓度为 0.5 μg/mL，并在 37 摄氏度下孵育 24 小时。

将所有培养基转移到 50 mL 锥形管中，并以 750 倍 G 的离心速度离心细胞 5 分钟。然后将上清液转移到 50 毫升锥形管中，以 1500 倍 G 离心 15 分钟，以去除大细胞碎片。接下来，将上清液转移到 250 毫升瓶中，以 12， 000 倍 G 的超速离心 50 分钟。

然后弃去上清液并收集沉淀。使用 40 毫升无菌 PBS 在 50 毫升试管中洗涤富含 LMP 的沉淀，并以 12， 000 倍 G 离心 50 分钟。重复此步骤两次。

收集最后一次洗涤的上清液，用作含有 1 毫升 PBS 的载体对照。悬浮沉淀并转移到 1.5 毫升无菌微管等分试样中，并将分离的 LMP 储存在零下 80 摄氏度。要通过传真分析表征微粒，首先制备两个连接蛋白缓冲液样品，一个含氯化钙，一个不含钙。

在传真管中，用 44 μL 含氯化钙的 nexin 缓冲液稀释 1 μL LMP。使用不含氯化钙的 nexin 缓冲液准备另一支试管。接下来，向每管中加入 5 微升 X 和 V sci 5，充分混合，在室温下避光孵育 15 分钟。

孵育后，使用 400 μL 传真流感鞘液。为了终止反应，在每个试管中加入 10 μL 7 微米计数微珠悬浮液作为内标。为了获得绝对计数，在流式细胞仪上建立相对大小、FSCH 和相对粒度 SSH 和点图的门。

使用尺寸校准的 1 微米荧光珠作为门 1，并在 7 微米处计数珠子。对于门 2，使用已建立的门和 FL 四通道进行膜联蛋白点图的 F-S-C-H-S-S-C-H 图上的 LMP 样品，通过获取信号直到步态 2 达到 10， 000 个计数珠，确定含有氯化钙的衔接蛋白缓冲液中 LMP 的 ex NV 事件中的阳性，并减去不含氯化钙的衔接蛋白缓冲液中 LMP 的事件。根据以下公式计算 LMP 的绝对数量。

使用手术刀 dumont 超细镊子和手术剪刀对肺组织进行无菌、解剖。小心去除薄壁组织和血管。进一步解剖浸没在组织洗涤介质中的支气管，并将直径为 1 至 2.5 毫米的支气管与外周肺组织分离。

使用手术刀将支气管组织切成约 5 毫米厚的支气管段，使用无菌弯曲的显微解剖钳进行舀取动作。捡起支气管碎片，将它们放在先前准备好的菜肴的划痕区域。根据文本方案，去除组织洗涤培养基并在室温下孵育片段约 5 分钟，以使其粘附在培养皿上。

向每个培养皿中加入 10 毫升完全愈合培养基，并将它们放入具有高氧气混合物的可控气氛模块化培养箱中，冲洗腔室，然后将其放入台式轨道培养箱中，以每分钟 10 次循环的速度在 37 摄氏度下摇动 24 小时，以使培养基间歇性地流过片段。孵育后，在相差和倒置光学显微镜下观察组织外观。选择具有完全细毛运动和活泼支气管上皮的支气管外表，用于后续的 LMP 治疗。

为了治疗 LMP，计数刚刚选择的支气管解释并标记 12 孔组织培养板的每个孔。对于每个解释，将 0.5 毫升完全生长培养基转移到无菌 einor 管中。然后每个处理计划加入 25 微升 l 和 p 原液或加入 25 微升对照载体。

对于对照外植体，通过轻轻敲击试管充分混合。将混合培养基转移到带有弯曲微量解剖钳的标记 12 孔组织培养板的每个孔中。将每个选定的支气管 x ex解释转移到组织培养板的每个孔中。

在 37 摄氏度的受控气氛模块化培养箱中继续孵育，24 小时后轻轻摇晃。使用 PBS 洗涤 EXPLAN 3 次，然后进行固定 h 和 e 染色以及隧道测定。根据此处显示的文本方案，通过传真分析用 nexin V 染色对 LMP 进行表征，并使用 1 微米珠子进行门控，其中 97% 的 mps 为 nexin V 科幻阳性。

通常，按照此方案获得约 2.5 毫克的 LMP。C 57 black 6 只小鼠的支气管组织外观进行载体和 LMP 处理。在该图中，支气管切片的组织病理学分析揭示了 LMP 对支气管上皮结构完整性的影响。

掌控一切。解释，支气管上皮基本未受损。然而，在 LMP 处理的外植体中，浅表上皮细胞层受损或丢失，并且上皮细胞高度和密度显着降低，如图所示。

与对照组织相比，隧道阳性染色是细胞凋亡的标志物，在 LMP 处理的支气管上皮中更为明显。在尝试此程序时，重要的是要记住在产生微粒和进行组织结构外培养时在无菌条件下工作。