淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

本实验的总体目标是展示如何从T淋巴细胞系体外制备淋巴细胞微颗粒（LMPs），并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。首先通过制备LMPs实现该目标，随后利用流式分析对分离纯化的LMPs进行表征。

然后对支气管组织外植体进行培养。最后，对支气管外植体进行LMP处理。最终，通过苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin）以及NC二细胞死亡检测等组织病理学检查，以显示LMP诱导的支气管上皮层损伤及上皮细胞凋亡。

与现有的从人外周血中分离微粒的方法相比，该技术的主要优势在于我们能够在体外大规模生成来源于细胞系的微粒。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为支气管组织外植体培养的关键步骤不易制备。开始培养。

将CEMT细胞接种于四个T175培养瓶中，每个培养瓶中加入150毫升新鲜培养基，在37°C下培养至细胞密度达到每毫升200万个细胞。通过以200 × g离心5分钟收集每个培养瓶中的细胞，并将300 × 10⁶个细胞重新悬浮于含150毫升新鲜培养基的新T175培养瓶中。为维持每毫升200万个细胞的密度，向培养基中加入37.5微升放线菌素D，使其终浓度为0.5微克/毫升，并在37°C下继续孵育24小时。

将所有培养基转移至50毫升锥形管中，在750 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞。然后将上清液转移至50毫升锥形管中，在1500 × g条件下离心15分钟，以去除较大的细胞碎片。接着将上清液转移至250毫升离心瓶中，在12,000 × g条件下超速离心50分钟。

然后弃去上清液，收集沉淀。用40毫升无菌PBS在50毫升离心管中洗涤LMP富集的沉淀，于12,000 ×g离心50分钟。重复此步骤两次。

取最后一次洗涤的上清液，加入1毫升PBS，用作阴性对照。将沉淀重悬后转移至1.5毫升无菌微量离心管中，将分离的LMPs于-80摄氏度保存。为通过膜联蛋白分析对微颗粒进行表征，请先准备两份结合缓冲液样品，其中一份加入氯化钙，另一份不加氯化钙。

在离心管中，将1 µL LMP加入含氯化钙的44 µL nexin缓冲液中稀释。另取一管，使用不含氯化钙的nexin缓冲液。随后，向每管中各加入5 µL X和V sci五，充分混匀后，避光室温孵育15分钟。

孵育后，使用 400 微升 Fax Flu 鞘液。为终止反应，在每管中加入 10 微升 7 微米计数微球悬浮液作为内参标准。为获得绝对计数，需在流式细胞仪上根据相对大小 FSC-H 和相对颗粒度 SSC-H 设定已建立的门控，并进行点图分析。

使用一微米大小校准的荧光微球作为门控一，并以七微米微球进行计数。对于门控二，在F-S-C-H-S-S-C-H图上利用已建立的门控和FL4通道分析LMP样本，通过annexin点图采集信号，直至门控二中计数微球达到10,000个；确定在含有氯化钙的annexin缓冲液中LMPs的阳性外泌体（ex NV）事件数，并减去不含氯化钙的annexin缓冲液中LMPs的事件数。根据以下公式计算LMPs的绝对数量。

使用手术刀、Dumont超细镊子和手术剪无菌解剖肺组织。小心去除肺实质和血管。将支气管浸入组织洗涤液中进一步解剖，并分离出直径为1至2.5毫米的支气管与外周肺组织。

使用手术刀，在无菌弯头显微解剖镊的辅助下，以刮取动作将支气管组织切成约五毫米厚的支气管条状片段。拾取支气管碎片，并将其放置于预先划痕处理的培养皿区域。根据文本方案，移除组织清洗液，将碎片在室温下孵育约五分钟，使其贴附于培养皿表面。

向每个培养皿中加入10毫升完全愈合培养基，将培养皿放入含有高氧气体混合物的受控气氛模块化培养室中，冲洗培养室，然后将其置于台式轨道摇床培养箱中，在37°C下以每分钟10个循环的速度振荡24小时，使培养基间歇性流过组织碎片。培养结束后，在相差倒置显微镜下观察组织外植块。选择具有完整纤毛运动和活跃支气管上皮的支气管外植块用于后续LMP处理。

为处理LMPs，计数刚刚选定的支气管外植体，并标记12孔组织培养板中的每个孔。针对每个外植体，将0.5毫升完全生长培养基转移至无菌Eppendorf管中。然后，每份处理用外植体加入25微升L和P储备液，或加入25微升对照载体。

对于对照组外植体，轻轻敲击离心管以充分混匀。使用弯头显微解剖镊子将混匀的培养基转移至已标记的12孔组织培养板的每个孔中。将每个选定的支气管外植体转移至组织培养板的各个孔中。

24小时后，在37摄氏度的受控气氛模块化培养箱中继续孵育，并轻轻摇动。使用PBS将EXPLAN洗涤三次，然后进行固定、苏木精和伊红染色以及TUNEL检测。根据此处所示的文本方案，通过膜联蛋白V染色结合流式分析对LMPs进行表征，并使用1微米珠进行设门，其中97%的MPS呈膜联蛋白V-SCI-FI阳性。

通常，按照此方案可获得约 2.5 毫克的 LMPs。将 C57BL/6 小鼠的支气管组织外植体分别用载体和 LMPs 处理。本图中，支气管切片的组织病理学分析揭示了 LMPs 对支气管上皮结构完整性的影响。

对照组中，支气管上皮基本未受损伤。然而，在LMP处理的组织外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，上皮细胞高度和密度均显著降低，如此处所示。

TUNEL阳性染色作为凋亡的标志物，在LMP处理的支气管上皮组织中比对照组织更为明显。在进行该操作时，需注意在制备微粒和进行组织外植体培养时应始终在无菌条件下操作。