Name: 淋巴细胞微粒和检测其促凋亡作用的气道上皮细胞产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 了解从T淋巴细胞系体外产生淋巴细胞微粒的方法，并检测其对气道上皮细胞的促凋亡作用。该技术通过流式分析表征微粒，利用支气管组织外植体培养模型，为研究微粒在呼吸系统疾病中的病理生理机制提供可靠的实验手段。

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本工作获得了加拿大卫生研究院（178918）和魁北克健康研究基金会－视觉健康研究网络的资助。

注意：雄性C57BL/6小鼠（5–7周龄）购自查尔斯河实验室国际公司（Charles River Laboratories International, Inc.，加拿大魁北克省圣康斯坦）。所有操作均依照圣心医院（CHU Sainte-Justine）动物护理委员会批准的方案进行。小鼠支气管组织外植体是获取原代支气管上皮细胞的良好来源，可用于研究LMPs对上皮细胞的促凋亡作用。本方案描述了 体外 LMPs 的生成，以及在经 LMPs 处理的支气管组织外植体上检测凋亡上皮细胞的方法。本方案包含 3 个部分。
1. LMPs 的制备与表征
注意：为防止污染，确保本实验中使用的所有材料均为无菌或经过高压灭菌处理。除非另有说明，所有步骤均须在室温下于生物安全柜内的无菌条件下进行。
1.1）微囊泡（MPs）的刺激与收集9
<ol>
	<li>在37 °C水浴中解冻一份含有1000万CEM T细胞的分装样品。将其加入含有10 ml预热的无血清造血细胞培养基（如X-VIVO）的15 ml无菌离心管中，于200 g条件下离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml预热的培养基中。</li>
	<li>将细胞转移至一个T75组织培养瓶（适用于悬浮细胞），加入15 ml预热的造血细胞培养基（如X-VIVO），在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养4天。</li>
	<li>4天后，将全部培养基和细胞转移至含有100 ml新鲜培养基的T175组织培养瓶中，在相同条件下继续培养约72小时，直至细胞密度达到200万个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞均匀分至四个T175培养瓶中，每个瓶内含150 ml新鲜培养基，继续培养至细胞生长至约200万个细胞/ml（约需48小时培养）。</li>
	<li>通过在200 × g条件下离心5分钟收集各培养瓶中的细胞，将300 × 106个细胞重悬于一个新的T175培养瓶中，该瓶含有150 ml新鲜培养基，以维持200万个细胞/ml的密度。</li>
	<li>向培养基中加入放线菌素D（以DMSO溶解，浓度为2 mg/ml），使其终浓度为0.5 µg/ml，继续孵育24小时。</li>
	<li>将全部培养基转移至50 ml锥形离心管中，在750 × g条件下离心5分钟。将上清液转移至新的50 ml锥形离心管中，在1,500 × g条件下离心15分钟，以去除较大的细胞碎片。</li>
	<li>将上清液转移至250 ml离心瓶中，在12,000 × g条件下进行超速离心50分钟。弃去上清液，收集沉淀。</li>
	<li>在50 ml离心管中用40 ml无菌PBS洗涤富含LMPs的沉淀物，并在12,000 × g条件下离心50分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>收集最后一次洗涤的上清液，作为溶剂对照使用。将LMPs沉淀物重悬于1 ml PBS中，转移至1.5 ml无菌微量离心管中。分装后将分离的LMPs储存于-80 °C（避免反复冻融）。</li>
</ol>
1.2）通过流式细胞术分析表征微囊泡（MPs）4
<ol>
	<li>准备两份annexin缓冲液，一份含有CaCl2，另一份不含：Hepes 10 mM，NaCl 140 mM，加或不加5 mM CaCl2。</li>
	<li>使用0.22 µm滤膜过滤annexin缓冲液和FACS流动鞘液，以去除颗粒物。</li>
	<li>将1 µl LMPs加入含5 mM CaCl2的44 µl annexin缓冲液中，置于FACS管内。另准备一管，将1 µl LMPs加入不含CaCl2的44 µl annexin缓冲液中（阴性对照）。</li>
	<li>每管加入5 µl annexinV-Cy5，充分混匀。室温避光孵育15分钟。每管加入400 µl FACS流动鞘液稀释反应体系，以终止反应。</li>
	<li>每管加入10 µl（200,000个微球）7 µm计数微球悬液作为内参标准，用于获得绝对计数。</li>
	<li>在流式细胞仪上，使用1 µm尺寸校准的荧光微球（门控1）和7 µm计数微球（门控2），建立相对大小（FSC-H，PMT E00，对数尺度）和相对颗粒度（SSC-H，PMT 325，对数尺度）的点图门控。</li>
	<li>在已建立的门控基础上，通过FSC-H/SSC-H点图分析LMPs样本，并结合FL-4通道（annexin检测，PMT 765，对数尺度）的点图，采集信号直至门控2中达到20,000个计数微球。</li>
	<li>确定在含CaCl2的annexin缓冲液中LMPs的annexinV阳性事件数，再减去不含CaCl2的annexin缓冲液中LMPs的事件数（阴性对照）。</li>
	<li>根据以下公式计算微颗粒（MPs）的绝对数量： 
	<img alt="MP计数公式：显示用于体积分析的微塑料定量方程。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式1"></li>
</ol>
1.3）MP 蛋白浓度测定（Bradford 法）
<ol>
	<li>配制浓度为 1.25 至 20 µg/ml 的蛋白质标准品的 5 个连续稀释梯度。每种标准品和样品溶液取 800 µl，重复两份加入洁净的试管中。向每支试管中加入 200 µl Bradford 染色试剂。充分混匀后，在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 595 nm 处测定吸光度。利用标准曲线的线性回归方程确定 LMPs 的蛋白质浓度。</li>
</ol>
2. 支气管组织外植体及LMPs处理
注意：请特别注意无菌工作环境，并以无菌操作方式配制后续实验中所用的溶液和培养基。配制完全愈合培养基时，将1 ml含血清的组织愈合培养基添加剂（冰上解冻）加入100 ml组织愈合培养基中，充分混匀。
2.1）支气管组织外植体的制备
<ol>
	<li>培养前，在6个区域各划出1 cm的划痕2 用手术刀片在每个100 mm组织培养皿表面的边缘进行划痕。每个划痕后的100 mm组织培养皿中加入2 ml培养皿包被液，随后将培养皿置于湿润的CO₂孵箱中孵育。2 过夜孵育于培养箱中 37 °C吸除多余溶液，加入15 ml组织洗涤液。</li>
	<li>通过 CO₂ 处死 5 至 7 周龄的 C57BL/6 小鼠2 根据动物护理伦理委员会批准的方案进行吸入。</li>
	<li>无菌条件下使用手术刀、Dumont超细镊子和手术剪解剖肺组织。仔细去除肺实质和血管。如需转运至实验室，将肺组织置于冰上预冷的组织洗涤液中。</li>
	<li>将浸没在组织洗涤液中的支气管进一步解剖，分离出直径为1至2.5 mm的支气管，并去除周围肺组织。用手术刀将支气管组织切成厚度约为5 mm的支气管环。</li>
	<li>使用无菌弯头显微解剖镊，以刮取动作拾起支气管片段，并将其放置于培养皿的划痕区域。</li>
	<li>移除组织洗涤液，将组织碎片在室温下孵育约5分钟，使其贴附于培养皿表面。</li>
	<li>向每皿中加入 10 ml 完全愈合培养基，将培养皿放入受控气氛的模块化培养箱中。用高浓度 O2 气体混合物（70% O₂）2，25% N2 和5% CO2，将培养室置于台式轨道摇床中，振荡培养 37 °C将培养室在每分钟10个循环的条件下振荡24小时，使培养基间歇性流过组织碎片。</li>
	<li>24小时孵育后，在相差倒置显微镜下观察组织外植体。选择具有完整、细微纤毛运动和活跃支气管上皮的支气管外植体用于后续LMPs处理。</li>
</ol>
2.2）LMPs 处理
<ol>
	<li>配制完全生长培养基：将含血清和成纤维细胞抑制剂的生长培养基补充物置于冰上解冻。向100 ml生长培养基中加入1 ml含血清的生长培养基补充物和200 μl成纤维细胞抑制剂，充分混匀。使用前将完全生长培养基在37 °C预热10分钟。</li>
	<li>用PBS在新的无菌离心管中稀释分离得到的LMPs，制备浓度为800 µg/ml的LMPs储备液。</li>
	<li>向12孔组织培养板的每孔中加入0.5 ml完全生长培养基。</li>
	<li>用弯头显微解剖镊子将前一步骤（第2.1节）中选定的支气管外植体转移至组织培养板的各孔中。</li>
	<li>正确标记培养板以区分LMPs处理孔和对照孔。向每个LMPs处理孔中加入25 µl LMPs储备液（终浓度为40 μg/ml），向对照孔中加入25 µl对照溶剂（参见LMPs制备方法）。</li>
	<li>将培养板置于可控气氛模块化培养箱中，在37 °C下轻轻振荡继续孵育。</li>
	<li>孵育24小时后，用PBS洗涤外植体3次，随后进行下一步操作（4%多聚甲醛[PFA]固定）。</li>
</ol>
3. 组织病理学检查
3.1）在进行下一步之前，准备以下溶液
<ol>
	<li>通过混合 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.76 mM KH2PO4，调节 pH 至 7.4，制备 1x PBS 缓冲液。</li>
	<li>为制备 4% PFA，将 20 g PFA 溶于 400 ml 水中，在 60 °C 下加热搅拌；加入数滴 10 M NaOH 以澄清溶液。随后加入 1x PBS 缓冲液，定容至 500 ml，并调节 pH 至 7.4。过滤后分装，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>准备以下脱水或复水试剂：100%、90%、70%、50% 乙醇和二甲苯。</li>
</ol>
3.2）组织块固定与组织切片脱蜡
<ol>
	<li>将每个组织块放入已标记的微量离心管中，加入1.5 ml 4%多聚甲醛，4 °C过夜孵育。用1×PBS将组织块清洗两次。</li>
	<li>通过梯度乙醇系列对组织块进行脱水（70%乙醇：每次30分钟，重复3次；90%乙醇：每次30分钟，重复2次；100%乙醇：每次30分钟，重复3次；然后二甲苯：每次20分钟，重复3次）。所有步骤均在室温下于通风橱中进行。</li>
	<li>将组织块置于58 °C烘箱中用石蜡包埋。使用旋转式切片机制备5 µm厚的组织切片。</li>
	<li>将切片漂浮于56 °C水浴中，然后转移至已标记的组织学载玻片上。将载玻片放入手动染色架中，65 °C烘干1小时。随后在室温下冷却载玻片。</li>
	<li>将染色架依次浸入4个盛有二甲苯的染色缸中，每个10分钟，以去除石蜡。再将染色架浸入梯度乙醇溶液中以去除二甲苯：依次为100%、95%、80%、70%、50%乙醇（每步5分钟）。最后用自来水冲洗染色架5分钟，以去除乙醇。</li>
</ol>
3.3）苏木精和伊红（H&amp;E）染色
<ol>
	<li>继续处理固定好的组织切片；将切片架放入盛有 Mayer 苏木精染液的染色缸中，染色 15 分钟。用自来水冲洗切片架 20 分钟，以去除苏木精染液。</li>
	<li>将切片架依次浸入蒸馏水中 30 秒，再放入 95% 乙醇中 30 秒。随后放入伊红 Y 溶液染色缸中染色 1 分钟。依次用两次 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯各脱水 2 分钟。</li>
	<li>在显微镜下快速检查，确保伊红染液已充分去除。在每张载玻片上滴加 2 至 3 滴封片介质（Fisher SP15-100），然后加盖盖玻片。</li>
</ol>
3.4) 原位 细胞死亡检测：TUNEL 法
<ol>
	<li>开始前，配制蛋白酶K工作液：将蛋白酶K溶于10 mM Tris/HCl（pH 7.4）中，终浓度为20 µg/ml。</li>
	<li>重复第3.2节中的步骤1至5（组织块固定及切片脱蜡）。用去离子H2O冲洗载玻片。</li>
	<li>将载玻片浸入1x PBS中孵育10分钟，倾去多余PBS。在室温下用蛋白酶K工作液孵育组织切片30分钟，随后用1x PBS冲洗载玻片两次。</li>
	<li>按照细胞死亡检测试剂盒说明书进行TUNEL实验。使用封片剂封片，并手动加盖玻璃盖玻片。</li>
	<li>在光学显微镜下观察样品。使用Image Pro 4.5软件分析呈棕褐色的凋亡细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
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<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-proliferative+and+anti-tumour+effects+of+lymphocyte-derived+microparticles+are+neither+species-+nor+tumour-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Anti-proliferative and anti-tumour effects of lymphocyte-derived microparticles are neither species- nor tumour-type specific.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微囊泡（MPs）是细胞间相互作用的活性介质，其研究在科学的多个领域具有广阔前景。11 本研究提供了一项详细的实验方案 体外 大规模制备源自凋亡T细胞系的淋巴细胞微粒（LMPs）。这些微粒表达多种淋巴细胞分子，在细胞和组织稳态的调控中具有重要的生物学功能。然而，来源于不同来源的LMPs在生物学特性上可能存在差异。4,9,12,13
LMPs 的特性随生成其所用刺激因素的不同而有所差异 体外 以及它们所来源的细胞。因此，对所获得数据的外推 体外 使用永生化细胞系衍生的LMPs与由LMPs生成的数据 体内 应谨慎操作。
本方案描述了分离微粒体（MPs）所需的多个离心步骤；因此，需谨慎操作以尽量减少此过程中MPs的损失。建议将分离得到的LMPs在-70 °C下快速冷冻；我们观察到，在此条件下LMPs的生物活性可保持长达2年（未发表数据）。
迄今为止，流式细胞术被认为...

微粒（MPs）是细胞活化或凋亡后释放的具有生物活性的亚微米级膜囊泡。MPs来源于正常和受损细胞，参与多种生理和病理过程。1 微囊泡（MPs）不仅在人血浆中被检测到，也在炎性组织和凋亡组织中被发现。细胞膜来源的微囊泡在多种情境下已展现出其生物学用途，包括细胞信号传导模型以及作为药理学工具的应用。2,3 我们先前已证实，经放线菌素D（actinomycin D）刺激（以诱导凋亡）的T淋巴细胞所释放的淋巴细胞微颗粒（LMPs）可抑制血管生成，并抑制内皮细胞的存活与增殖。4,5 LMPs 的抗血管生成作用可能因用于激活 T 淋巴细胞的刺激物不同而存在显著差异 体外.6
气道上皮发挥着保护性的物理和功能屏障作用。气道中T淋巴细胞数量增加可导致细胞损伤和气道炎症。7 我们已证明LMPs可诱导人支气管上皮细胞发生凋亡，8 这表明LMPs可能改变支气管上皮的屏障功能 体内. 凋亡细胞可利用TUNEL法进行鉴定，该方法可检测DNA断裂末端 原位 DNA片段化 
本实验方案的总体目标是阐明 体外 从T淋巴细胞系制备LMPs，并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。 原位 细胞死亡检测表明，LMPs 能强烈诱导气道支气管上皮细胞死亡，提示 LMPs 介导的气道上皮损伤可能影响受损上皮的屏障功能。

<table><tbody><tr><td>LMPs 的制备与表征</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM T细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC&amp;nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 培养基&amp;nbsp;</td><td>Cambrex，沃克维尔</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>T175 培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>放线菌素&amp;nbsp;D&amp;nbsp;</td><td>Sigma化学公司</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&amp;nbsp;</td><td>559933</td><td></td></tr><tr><td>FACS 流式溶液</td><td>BD 生物科学</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>荧光微珠（1 &amp;micro;m)</td><td>分子探针&amp;nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯计数微球（7 &amp;micro;m)</td><td>邦斯实验室</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯FACS管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 移液管</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 移液管</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 锥形聚丙烯微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形聚丙烯管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 高速聚丙烯共聚物管</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 高速聚丙烯瓶</td><td>贝克曼</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>蛋白质定量分析（Bradford 法）</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>蛋白测定标准品 II</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>试管 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>试管 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>低速离心机</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>贝克曼</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>适用于250 ml瓶的高速转子</td><td>贝克曼</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>适用于50 ml离心管的高速转子</td><td>贝克曼</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>贝克曼</td><td>600 系列</td><td></td></tr><tr><td>支气管组织外植体与切片&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠（5-7周龄）&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河实验室公司&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠气道原代细胞&amp;trade; 系统：</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;肋纹背碳钢手术刀片</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools 公司&amp;nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>奥林巴斯光学株式会社&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>高氧&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气体混合物&amp;nbsp;</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>模块化培养箱室</td><td>Billups-Rothenberg 公司</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 恒温轨道摇床</td><td>Barnstead Lab-Line，&amp;nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>塑料细胞培养皿（100 mm）</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools 公司&amp;nbsp;</td><td>14060-09</td><td>直、锋利、9 cm长</td></tr><tr><td>半弯式格雷费镊</td><td>Fine Science Tools 公司&amp;nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>加湿CO2培养箱</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&amp;nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;组织病理学检查&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醛 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp; 国际有限公司</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克股份公司，达姆施塔特</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;戊二醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>卡考基酸盐</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&amp;nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp; 国际有限公司</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's 苏木精</td><td>Sigma-Aldrich公司&amp;nbsp;</td><td>MHS16</td><td>带滤纸的漏斗&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp; 国际有限公司&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>伊红&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich公司&amp;nbsp;</td><td>HT110116</td><td>带滤纸的漏斗&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>佩尔蒙特&amp;trade; 封片剂</td><td>赛默飞世尔科技公司&amp;nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24&amp;times;24&amp;nbsp;#1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL 检测试剂盒</td><td>原位细胞死亡检测，POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>烤箱</td><td>德斯帕奇工业公司</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>徕卡显微系统公司</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康影像日本有限公司</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>染色皿完整</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>包括培养皿、支架、盖子</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Sarstedt 公司&amp;nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>振荡式与往复式水浴箱</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td>Nicram RD 服务</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

近年来，人们对细胞膜来源囊泡在细胞间通讯中的生物学作用日益关注。微囊泡（microparticles, MPs）是其中一类囊泡，直径范围为0.1 μm至1 μm，通常由处于激活或凋亡状态的真核细胞质膜脱落而产生。本文描述了利用放线菌素D诱导CEM T细胞凋亡，从而生成T淋巴细胞来源的微囊泡（LMPs）的方法。LMPs通过多步差速离心法进行分离，并采用流式细胞术进行表征。本方案还介绍了 原位 用于证明LMPs对源自小鼠原代呼吸性支气管组织外植体的支气管上皮细胞促凋亡作用的细胞死亡检测方法。本文所述方法提供了一种可重复的程序，用于从凋亡淋巴细胞中分离出大量LMPs 体外以这种方式获得的LMPs可用于评估各种疾病模型的特征，并用于药理学和毒理学检测。由于气道上皮在外部环境与下层组织之间提供了保护性的物理和功能屏障，因此相较于永生化上皮细胞系，使用支气管组织外植体可为需要气道组织的研究提供更为有效的模型。

通过荧光激活细胞分选（FACS）分析结合膜联蛋白V染色10对LMPs进行表征，并使用1 µm微珠设门，其中97%的微囊泡（MPs，≤1 µm）呈膜联蛋白V-Cy5阳性（图1A和1B）。通常，按照本方案可获得约2.5 mg的LMPs。将C57BL/6小鼠的支气管组织外植体分别用载体对照和LMPs处理。支气管切片的组织病理学分析揭示了LMPs对支气管上皮结构完整性的效应。在对照组外植体中，支气管上皮基本未受损（图2A）；而在LMPs处理的外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，且上皮细胞高度和密度显著降低（图2B）。与对照组相比，LMPs处理的支气管上皮中TUNEL阳性染色（凋亡标志物）更为明显（图3）。
<img alt="流式细胞术散点图；图形显示染色的细胞群；SSC 对 FSC，Annexin-Cy5 检测。" src="/files/ftp_upl...

细胞膜脱落的微颗粒（MPs）是具有生物活性的囊泡，可在多种模型中分离并研究其病理生理学效应。本文介绍一种从T淋巴细胞衍生微颗粒（LMPs）的制备方法，并展示其对气道上皮细胞的促凋亡作用。

近年来，人们对细胞膜来源囊泡在细胞间通讯中的生物学作用日益关注。微囊泡……

本实验的总体目标是展示如何从T淋巴细胞系体外制备淋巴细胞微颗粒（LMPs），并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。首先通过制备LMPs实现该目标，随后利用流式分析对分离得到的LMPs进行表征。然后对支气管组织外植体进行培养。最后对支气管外植体进行LMP处理。最终，通过苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin）以及TUNEL细胞死亡检测等组织病理学检查，来显示LMP诱导的支气管上皮层损伤及上皮细胞凋亡。与现有的从人外周血中分离微粒的方法相比，该技术的主要优势在于我们能够在体外大规模生成来源于细胞系的微粒。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为支气管组织块培养中的关键步骤不易准备。开始培养。将CEMT细胞接种于四个T175培养瓶中，每个培养瓶加入150毫升新鲜培养基，在37°C培养至细胞密度达到每毫升200万个。将每个培养瓶中的细胞以200 × g离心5分钟收集细胞，并将300 × 10⁶个细胞重新悬浮于含150毫升新鲜培养基的新T175培养瓶中。为维持每毫升200万个细胞的密度，向培养基中加入37.5 µL放线菌素D，使其终浓度为0.5 µg/mL，并在37°C孵育24小时。将所有培养基转移至50毫升锥形管中，在750 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞。然后将上清液转移至50毫升锥形管中，在1500 × g条件下离心15分钟，以去除较大的细胞碎片。接着将上清液转移至250毫升离心瓶中，在12,000 × g条件下超速离心50分钟。然后弃去上清液，收集沉淀。用40毫升无菌PBS在50毫升离心管中洗涤LMP富集的沉淀，于12,000 ×g离心50分钟。重复此步骤两次。取最后一次洗涤的上清液，与一毫升 PBS 一起用作阴性对照。将沉淀重悬后转移至 1.5 毫升无菌微量离心管中，分装保存分离得到的大型微粒（LMPs）于负 80 摄氏度。为通过膜联蛋白分析对微粒进行表征，请先配制两份膜联蛋白缓冲液样品，其中一份含氯化钙，另一份不含氯化钙。在离心管中，将1 µL LMPs加入含氯化钙的44 µL Nexin缓冲液中稀释。另取一管，使用不含氯化钙的Nexin缓冲液。随后，向每管中加入5 µL X和V sci five，充分混匀，室温避光孵育15分钟。孵育后，使用 400 微升 Fax Flu 鞘液。为终止反应，在每管中加入 10 微升 7 微米计数微球悬浮液作为内参标准。为获得绝对计数，需在流式细胞仪上根据相对大小、FSC-H 和相对颗粒度 SSC-H 设定已建立的门控，并绘制点图。使用直径一微米的尺寸校准荧光微球作为门控一，并计数直径七微米的微球。对于门控二，在F-S-C-H-S-S-C-H图上利用已建立的门控，通过FL4通道获取信号，直至门控二中计数微球达到10,000个，用于分析LMP样本的膜联蛋白点图；确定在含有氯化钙的膜联蛋白缓冲液中LMPs的阳性外泌体事件数，并减去不含氯化钙的膜联蛋白缓冲液中LMPs的事件数。根据以下公式计算LMPs的绝对数量。使用手术刀、杜蒙超细镊子和手术剪无菌解剖肺组织。小心去除肺实质和血管。将支气管浸入组织洗涤液中进一步解剖，并分离出直径为1至2.5毫米的支气管与外周肺组织。使用手术刀，在无菌弯头显微解剖镊的刮取动作辅助下，将支气管组织切成约五毫米厚的支气管条状片段。拾取支气管组织碎片，并将其放置于先前已划痕处理的培养皿区域上。根据文本方案，移除组织清洗培养基，将组织碎片在室温下孵育约五分钟，以使其贴附于培养皿表面。向每个培养皿中加入 10 毫升完全愈合培养基，将其放入含有高氧气体混合物的可控气氛模块化培养室中，冲洗培养室后，置于台式轨道摇床中，在 37°C 下以每分钟 10 个循环的速度振荡 24 小时，使培养基间歇性流过组织碎片。培养结束后，在相差倒置显微镜下观察组织外植体，选择具有完整纤毛运动和活跃支气管上皮的支气管外植体用于后续 LMP 处理。为处理LMPs，计数刚刚选定的支气管外植体，并标记12孔组织培养板中的每个孔。针对每个外植体，将0.5毫升完全生长培养基转移至无菌Eppendorf管中。然后，每份处理用外植体加入25微升L和P储备液，或每份对照组外植体加入25微升对照溶剂。对于对照组外植体，轻轻敲击离心管以充分混匀。使用弯头显微解剖镊子将混匀的培养基转移至已标记的12孔组织培养板的每个孔中。将每个选定的支气管外植体转移至组织培养板的各个孔中。24小时后，在37摄氏度的可控气氛模块化培养箱中继续孵育，并轻轻摇动。使用PBS将EXPLAN洗涤三次，然后进行固定、苏木精和伊红染色以及TUNEL检测。根据此处所示的文本方案，通过膜联蛋白V染色和流式分析对LMPs进行表征，并使用1微米珠进行设门，其中97%的MPS为膜联蛋白V-SCI-FI阳性。通常，按照本方案可获得约 2.5 毫克的 LMPs。将 C57BL/6 小鼠的支气管组织外植体分别用载体和 LMPs 处理。本图中，支气管切片的组织病理学分析揭示了 LMPs 对支气管上皮结构完整性的影响。对照组中，支气管上皮基本未受损伤。然而，在LMP处理的组织外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，上皮细胞高度和密度均显著降低，如此处所示。TUNEL阳性染色作为凋亡的标志物，在LMP处理的支气管上皮组织中比对照组织更为明显。在进行该操作时，需注意在制备微粒和进行组织外植体培养时应始终在无菌条件下操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

淋巴细胞微粒和检测其促凋亡作用的气道上皮细胞产生

本文描述了分离小鼠肺泡巨噬细胞（肺部固有先天免疫细胞）并检测其在与聚酐纳米颗粒共培养后活化反应的实验方案。...

收获小鼠肺泡巨噬细胞及评估聚酸酐纳米颗粒诱导的细胞活化

本视频展示了经放线菌素-D处理后，从T淋巴细胞中生成并分离T淋巴细胞来源的微颗粒（LMPs）的过程。...

体外分离源自凋亡T淋巴细胞的微颗粒

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了解从T淋巴细胞系体外产生淋巴细胞微粒的方法，并检测其对气道上皮细胞的促凋亡作用。该技术通过流式分析表征微粒，利用支气管组织外植体培养模型，为研究微粒在呼吸系统疾病中的病理生理机制提供可靠的实验手段。

淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

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