完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

本实验的总体目标是测量嗅觉感觉神经元在气味刺激物作用下膜特性的变化。首先，通过解剖获取嗅觉上皮组织，并将其转移至灌流 chamber 中。第二步是在显微镜下定位并选择感兴趣的嗅觉感觉神经元（OSN）。

随后对所选嗅觉感觉神经元（OSN）的树突 knob 进行穿孔膜片钳记录，并在气味分子刺激下进行分析。最终，通过对 OSN 树突 knob 进行穿孔膜片钳记录，可在膜层面表征 OSN 的功能特性。该方法有助于解决嗅觉领域中的关键科学问题，例如记录嗅觉感觉神经元的活动、表达特定的气味受体，以及开展膜片钳记录研究。

提供有关这些神经元膜特性的信息。使用1毫米玻璃管自行拉制刺激电极，或购买预先拉制好的电极，并用火焰处理。将六根电极在距尖端约1厘米处弯曲成45度角。

然后，以一个环形支架为引导，将六支弯头移液管围绕第七支直头移液管排列，并用热缩管包裹。在移液管的另一端加热热缩管使其收缩。再加一层热缩管。

这将制备一个七通道刺激性移液管。现在使用多通道拉制仪拉制该七通道刺激性移液管。拉制完成后，用白色胶水加固环状眼环周围的结构。

然后让胶水在所需溶液中过夜干燥。制备两性霉素B溶液时，必须在使用前新鲜配制。需要时，称取3毫克两性霉素B，加入50微升二甲基亚砜（DMSO）中。

然后涡旋混合20秒。接着超声处理混合物2至3分钟，以确保完全稀释。现在将20 µL混合液加入5 mL细胞内储备液中。

涡旋混合20秒，随后超声处理2至3分钟。然后将工作液置于冰上冷却，并避光保存。如此制备的工作液可在数小时内保持稳定。

用工作液填充配备微孔滤膜的注射器。该溶液在使用后一小时内有效。然而，应将装有溶液的注射器置于冰上保存。

现在拉制一些具有长颈和两微米开口的记录电极。目标是在用制霉菌素溶液填充后，电极电阻达到15至20兆欧。最后，用稀释在任氏液中的气味剂填充刺激微电极。

本实验方案需准备 2 至 4 周龄的小鼠。在本演示中，使用表达或 IRES tau GFP 的小鼠。所有表达目标嗅觉受体的神经元均会标记有 GFP。

该方法可用于或表达于所有区域。然而，对于表达于背侧区域的嗅觉受体，其解剖和记录操作将更为简便。首先对小鼠进行麻醉，随后将其处死并断头。

该实验方案的结果取决于解剖的质量。这些解剖步骤必须尽可能简短且精确。开始手术时，使用解剖剪沿背部中线做一纵向切口。

拉开皮肤以去除。然后沿下颌切开，并平行于牙齿做冠状切口。由此去除上颌门齿。

现在在眼睛后方对头部进行冠状切开，弃去后部头组织，将前部置于冰冷的林格液中。随后在解剖显微镜下于5至10分钟内分离 septum 组织。首先沿腹侧做纵向切口。

然后沿鼻腔背外侧纵向切开背侧骨。接着，去除大部分骨骼和腭部。将分离出的鼻中隔及其附着的上皮转移至含有充氧林格液的容器中，并在室温下保存。

在开始记录前五分钟内完成最终准备工作。溶液温度不可过高，否则制备的样品会显得受损。为记录而暴露神经上皮。

首先，用镊子将上皮从其下方的隔膜剥离。然后使用显微Vanna剪刀剪开隔膜的前端，以释放上皮。现在小心移除犁鼻器。

从其背部附着处将其切断。现在可将分离的上皮组织转移至记录室，黏液面朝上。放置妥当后，使用网格状固定器将组织压平。

然后将样品室转移至直立显微镜下，使用40倍水浸物镜观察神经上皮，同时在室温下持续灌注新鲜的任氏液。开始寻找目标细胞时，由于本实验中的细胞表达EGFP，因此采用480纳米的激发光，扫描发射光在530至550纳米范围内的细胞。

在明场下以 80 至 160 倍放大倍数观察时，靶向的树突结和嗅觉纤毛应能与支持细胞明显区分开来。现在用 S statin 溶液填充电极。轻敲以排出形成的气泡，并将电极安装到电极夹持器上。

现在施加一定的正压，预期电阻应在15至20兆欧之间。然后在保持正压的同时将电极移向细胞。

当电阻增加至约 40 兆欧时，释放压力并施加轻微的负压。若已形成吉欧封接，膜电位应被钳制在约负 75 毫伏。细胞现已开放，可继续进行实验。

根据需要施加刺激、设定方案，并使用药理学处理进行灌注，以单个气味分子进行测试。记录200至500毫秒的自发性活动。施加气味分子500毫秒，然后按照所述方案，持续测量最多10秒内的反应。

表达 MOR 23 并用 EGFP 标记的神经元被膜片钳并用不同浓度的醛刺激。在电流钳模式下，醛是 MOR 23 的配体。或者，细胞在电压钳模式下进行模拟。

在电压钳模式记录中，监测了不同的特性。为了量化反应，采用经典的电生理学方法，以最大反应幅度来评估，使用Hill方程绘制剂量-反应曲线。这些结果提供了关于每个嗅觉神经元（OSN）编码特性的信息，包括其检测阈值、时间特性、动态范围以及饱和水平。

掌握后，该技术的解剖步骤可在 10 到 15 分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何研究小鼠中表达特定气味受体的嗅觉感觉神经元的功能特性。