Name: 应用立体定向注射技术在研究动物行为的遗传效应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习使用立体定向注射技术在小鼠特定脑区调控基因表达，结合旷场实验和强迫游泳实验定量评估焦虑与抑郁相关行为变化，并通过组织学验证注射位点准确性，为神经科学研究提供基因与行为关系的可靠方法。

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本工作部分由美国心脏协会科学家发展奖和NARSAD青年研究者奖资助，授予Yingwei Mao。

注意：所有涉及动物的实验方案均遵循宾夕法尼亚州立大学动物护理指南及 IACUC #44057 的规定
1. 慢病毒生产
注意：转染前一天，LentiX-293 细胞应达到 80% 汇合度。
<ol>
	<li>转染前用 DMEM 清洗细胞，并在 10 ml 含青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 µg/ml）的 DMEM/10% FBS 中于室温孵育 5 分钟&#160;。</li>
	<li>将 DNA 与聚乙烯亚胺（PEI）（1 mg/ml）按 1:3 的比例（1 µg DNA : 3 µl PEI）溶于 1 ml DMEM 中，涡旋混匀 1 分钟。所加 DNA 的体积取决于 DNA 浓度。室温孵育 10 分钟。
	<ol>
		<li>例如，每皿使用 20 µg 质粒 DNA，包括 10 µg 载体质粒、5 µg psPax214 质粒、5 µg 水疱性口炎病毒（VSV）质粒，以及 60 µl PEI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次涡旋混匀 DNA 与 PEI 溶液 1 分钟，室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入相当于总培养基体积 1/10 的 DMEM（即&#160;在 100 mm 培养皿中，10 ml 培养基加入 1 ml）。将 1 ml DNA-PEI 混合液逐滴加入培养皿中，并轻轻旋转培养皿，使混合液与培养基充分混匀。</li>
	<li>于室温孵育 6 小时&#160;，移除上清液，加入 5 ml 新鲜培养基。</li>
	<li>转染后 48 小时&#160;，收集病毒上清液，于 4 °C 在 50 ml 离心管中以 627 × g 离心 5 分钟&#160;。将 30 ml 病毒上清液通过 0.45 µm 注射式滤器过滤至超速离心管中。</li>
	<li>用无菌水平衡离心管，并用一小块封口膜覆盖管口。于 4 °C 以 11,249 × g 离心 120 分钟&#160;，使用真空吸头移除液体。</li>
	<li>向离心管中加入 100 µl 冷 PBS，于 4 °C 轻柔振荡过夜。</li>
	<li>为重悬病毒，用移液器将步骤 1.8 中加入的 PBS 在沉淀上反复吹打 10 次，注意避免枪头接触沉淀。直至完成此操作前，沉淀不会完全重悬。</li>
	<li>将病毒按每管 10–20 µl 分装，液氮速冻后于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 立体定位注射
2.1）仪器准备
<ol>
	<li>将剪刀、钝头镊子、持针器、手术刀、棉签和一块布与灭菌指示剂一起放入密封包装中，并在手术前进行高压灭菌。此外，准备10%聚维酮碘溶液、70%乙醇、可吸收缝线、加热垫、人工泪液、玻璃珠灭菌器、钻机、钻头、2个一次性注射器、一个注射用注射器、电动剃毛器、镇痛剂（酮洛芬）、麻醉剂（avertin）、手套，以及配备注射泵的立体定位仪。</li>
	<li>当天新鲜配制1.25% avertin溶液，在无菌操作台中使用0.2 µm无菌注射器滤器过滤后，置于无菌血清小瓶中备用。将2.5 g 三溴乙醇（2,2,2-tribromoethyl alcohol）溶于5 ml 叔戊醇（tert-amyl alcohol）中，再加200 ml 水溶解。保持pH值低于5。15</li>
</ol>
2.2）小鼠的准备
<ol>
	<li>根据小鼠体重给予阿佛丁（375 mg/kg）。通过腹腔（IP）注射方式给予阿佛丁，然后将小鼠放回笼中直至完全麻醉。15</li>
	<li>通过腹腔注射给予镇痛剂（酮洛芬，5 mg/kg），并在小鼠眼睛上涂抹人工泪液以防止干燥。</li>
	<li>通过轻捏小鼠足部确认其是否完全入睡。若小鼠对足部夹捏有反应，则需追加麻醉剂（每次50 µl）。使用电动剃须刀剃除小鼠头部毛发，手术区域通常从耳后至鼻尖上方，并包括周围区域。</li>
	<li>将小鼠放入立体定位仪中。将门齿卡入前部夹具，下压并拧紧夹具，确保下颌完全固定。</li>
	<li>将耳棒插入耳道以充分固定头部。注意不要插入过深，以免损伤内耳。操作完成后，移动小鼠身体时头部位置应保持稳定不变。</li>
	<li>在小鼠身下放置加热垫，以在整个手术过程中维持其体温。</li>
	<li>彻底清洁手术区域。使用棉签蘸取10%聚维酮碘，以手术部位中心为起点向外做环形擦拭。随后用另一棉签蘸取70%乙醇，以相同方式擦拭手术区域。重复该过程两次。</li>
</ol>
2.3）第一次切口
<ol>
	<li>小鼠准备就绪后，打开无菌器械袋。在接触器械前更换手套。取出无菌布并将器械放置于布上。若任何器械接触到非无菌表面，请使用玻璃珠灭菌器灭菌15秒&#160;。</li>
	<li>用优势手持手术刀，非优势手持钝头镊。用钝头镊轻轻夹住小鼠皮肤，使用手术刀进行切口。切口起始位置位于耳部上方约1.5 cm处（朝向鼻部），向下延伸至耳部下方约0.5 cm处。沿小鼠头部中线垂直向下延伸切口，以暴露前囟（图1）。</li>
	<li>观察到前囟后，取无菌棉签轻轻擦去覆盖颅骨表面的血液。使用两根棉签将皮肤向头部两侧推开。</li>
</ol>
2.4）设备设置
<ol>
	<li>清除颅骨表面所有血液并清晰暴露前囟后，准备注射器（病毒浓度为 108 TU/ml，体积为 1 µl）。在通风橱内将待注射病毒吸入注射器，确保内部无气泡。将注射器安装至立体定位仪，确认其完全固定。</li>
	<li>缓慢降低注射器，使其位于颅骨正上方，无菌注射针尖对准前囟与耳间线的交点。将此点设为零点，并从此处确定坐标。</li>
	<li>根据目标脑区调整立体定位坐标，可参考脑图谱4确定具体坐标。确定坐标后，移动注射器针头至对应位置。靶向齿状回时使用以下坐标：M/L = ±1 mm，A/P = -1.82 mm。将针头降至颅骨上方，以观察钻孔位置。</li>
	<li>轻微抬高注射器，取钻头置于目标钻孔位置正上方，与颅骨呈约 45° 角。开始钻孔，持续钻至颅骨穿透，此时可感受到阻力下降。注意避免钻入脑组织，以防造成皮层损伤。</li>
	<li>取无菌棉签清除钻孔处的血液。</li>
	<li>降低注射器，使针尖刚好接触脑表面（而非颅骨），将 D/V 坐标（深度）设为 0，再根据脑图谱坐标将针头降至目标深度。靶向齿状回时，D/V 设为 -1.79 mm。</li>
	<li>以 0.2 µl/min 的速度开始注射。观察并确保注射器未继续下移超过目标深度；若发生偏移，应轻柔地将注射器重新提升至目标深度。</li>
	<li>注射完成后，等待约 2 分钟&#160;，以确保残留病毒被充分吸收。缓慢提起注射器，并用棉签清除注射部位的液体。</li>
	<li>对另一侧半球重复上述操作。</li>
</ol>
2.5）缝合
<ol>
	<li>从包装中取出无菌缝线和缝针，用持针器夹住缝针，使针尖朝向远离持针器的方向。将钝头镊子握在非优势手中，用于夹住小鼠皮肤。操作从优势手开始。</li>
	<li>轻轻将缝线穿过皮肤，并用钝头镊子夹住切口另一侧的皮肤。拉动缝线，直至留下约 0.75 英寸的线头。</li>
	<li>松开缝针，用钝头镊子将缝线在持针器上绕一圈，然后用持针器夹住剩余的 0.75 英寸缝线，拉动缝线，使缝针和持针器最终位于头部与初始位置相对的一侧。此时应形成一个结。</li>
	<li>重复此步骤三次，每次使持针器最终位于头部的另一侧，交替进行。</li>
	<li>剪断缝线，并重复步骤 2.5.1–2.5.3，直至切口完全闭合。</li>
</ol>
2.6）术后护理
<ol>
	<li>轻轻取出小鼠的耳杆，并将其下颌从前方夹具上取下。</li>
	<li>将小鼠保留在加热垫上，直至其苏醒并能自主活动。每天监测小鼠状况，密切观察是否存在疼痛迹象，例如不梳理毛发、不进食或不饮水。必要时给予额外的镇痛剂。</li>
</ol>
3. 开放旷场实验
3.1）设置
<ol>
	<li>准备一个空的方形塑料实验箱，尺寸为 50 cm × 50 cm，四周侧壁高 50 cm（也可略大）。实验开始前，使用 70% 乙醇彻底清洁实验箱内壁。确保乙醇完全挥发干燥后，再将小鼠放入实验箱中。</li>
	<li>将实验箱放置于地面，并尽量调整光照条件，以最大限度减少阴影和反光。</li>
	<li>若使用动物行为追踪软件，请将摄像机置于实验箱正上方，距离开放场约 1.5 英尺（高度需足以完整覆盖整个实验箱区域，同时足够近以清晰观察小鼠活动）。</li>
	<li>在实验箱中央区域设置一个观察区（面积约为 30 cm × 30 cm）16 。要设置该区域，请点击侧边栏中的“zone 1”标签。
	<ol>
		<li>在上方面板中选择一种形状轮廓，勾勒出中央区域的边界。点击“add zone”（添加区域），然后点击中央区域内部。根据软件提示，为该区域命名（本操作中该区域称为‘center’）。若行为实验将采用人工评分，请确保实验箱底部用胶带标记划分为 10 cm × 10 cm 的方格。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置软件参数，确保显示设置正确，小鼠在屏幕上清晰可见。通过调整设备的检测参数，使其与实验箱环境（光照条件）及小鼠毛色相匹配。 
	注意：当参数设置正确时，系统应仅追踪小鼠本身，而不追踪任何阴影或尿液/粪便残留物。具体软件参数设置取决于实验箱的光照条件和小鼠毛色。</li>
</ol>
3.2）适应与测试
<ol>
	<li>将实验小鼠移入行为学实验房间1小时&#160;在测试前让小鼠在笼子中适应环境以使其熟悉周围条件。</li>
	<li>打开摄像机以录制行为学任务，将小鼠置于旷场中央靠前位置，使其朝向墙壁。</li>
	<li>将计时器设定为5分钟，然后离开实验区域。如果可能，离开房间，以免意外影响小鼠。</li>
	<li>5 分钟后&#160;将小鼠取出并放回笼中。</li>
	<li>使用70%乙醇彻底清洁操作区域，然后再进行下一只小鼠的实验。确保乙醇已完全干燥。</li>
</ol>
3.3）评分
<ol>
	<li>当小鼠的四只脚均位于中央 30 cm × 30 cm 区域内时，视为其处于场地中心。</li>
	<li>量化小鼠在中心区域停留的时间。或者，使用追踪软件（如 Noldus EthoVision）确定该时间。
	<ol>
		<li>具体操作如下：进入分析选项卡，点击分析配置文件下的“运动”选项。删除当前设置的分类，然后在位置选项卡下选择“区域内”。选择中心区域。接着，在结果选项卡下选择“分析输出”以查看结果。此时应出现一个表格，列出每次试验中小鼠静止不动的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>否则，可人工评分进行开放场地试验（OFT）。开放场地底部应标出 25 个 10 cm × 10 cm 的方格（如步骤 3.1.3 所述）。除记录小鼠进入场地中心区域的次数外，还需量化其在中心区域停留的时间。16 
	注：中央 30 cm × 30 cm 区域被视为开放场地的中心区域。当小鼠四只脚均位于 30 cm × 30 cm 区域内时，视为其处于中心区域。</li>
</ol>
4. 强迫游泳实验
注意：行为任务之间至少应间隔五天。
4.1）设置
<ol>
	<li>取一个 2 L 的透明桶，装入 22 °C 的水。将桶放置在桌面上，并尽量调整光照条件以减少阴影和反光。</li>
	<li>如果使用追踪软件，将摄像头正对桶的上方放置。</li>
	<li>设置软件，确保小鼠在屏幕上清晰可见。</li>
</ol>
4.2）适应与测试
<ol>
	<li>实验前1小时将小鼠移入行为学实验房间，以适应环境。适应期间将小鼠保留在其笼内。</li>
	<li>开启摄像机以记录行为学任务。轻柔地将小鼠放置于盛水桶的中央，切勿直接将小鼠丢入水中。缓慢放下小鼠，使其前肢先接触水面，并注意避免其头部浸入水中。</li>
	<li>设定计时器为6分钟，随后离开行为学实验区域。</li>
	<li>6分钟&#160;结束后，将小鼠从桶中取出，在放回笼中前擦干多余水分。</li>
</ol>
4.3）评分
<ol>
	<li>若使用追踪软件，将静止百分比设为11%（Noldus建议值，通常为默认设置），以量化漂浮时间与游泳时间。</li>
	<li>要使用追踪系统进行量化，请转到分析选项卡，点击分析配置文件下的“运动”选项。删除当前设置的类别，然后在左侧面板（个体行为下）选择“运动状态”，并将静止状态设置为11%。</li>
	<li>在结果标签页中选择轨迹可视化。选择分析输出（位于结果标签页下）以查看结果。此时应出现一个表格，列出每次试验中静止不动的时间。</li>
	<li>若采用人工计分，需测量小鼠游泳或攀爬的时间、静止不动的总时长，以及首次进入静止状态的潜伏期。参见 图2 在结果部分.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

立体定位注射的成功依赖于三个因素：保持小鼠存活、设定正确的坐标零点（针尖位于前囟与耳间线的交点处），以及设定从零点到目标位置的正确深度（针尖刚好接触脑组织表面）。小鼠的存活至关重要。通过确保小鼠得到充分麻醉并接受足量镇痛剂，有助于提高术后存活率17。已知疼痛是术后恢复不良的主要原因之一。在整个手术过程中确保小鼠完全麻醉（对足部夹捏无反应），并根据小鼠体重给予正确剂量的镇痛剂，有助于提高存活率。此外，小鼠在整个手术过程中直至从麻醉中苏醒前，都应置于加热垫上。麻醉状态下小鼠无法调节体温，在手术期间体温会显著下降。即使立体定位手术时间相对较短，低体温仍可能严重损害小鼠的存活。正确的缝合技术对于成功完成手术也至关重要。小鼠可能会尝试撕扯缝线，因此必须确保缝线足够牢固以防止其自行拆除，但又不能过紧而对伤口造成过大张力。每个缝合结打四个结可确保小鼠无法拆除缝线。良好的缝合非常重要，因为开放性伤口会增加感染风险，从而对后续的行为学实验产生负面影响。
旷场实验（OFT）是一种用于评估小鼠运动能力和焦虑表型的行为学范式。在测试小鼠行为时，操作小鼠和设置实验场地需格外谨慎。OFT...

小鼠在神经生物学研究中被广泛使用，因为其基因操作较为简便。基因敲除技术使研究人员能够探究每个遗传因子如何影响小鼠的行为。此外，Cre-loxP 系统为小鼠中组织和细胞类型特异性的基因敲除提供了有力工具，使研究人员能够在不同组织中研究基因功能1。然而在实际应用中，Cre 启动子的表达模式难以精确控制，迄今为止许多已建立的 Cre 驱动小鼠品系尚未实现特定脑区的表达2,3。
或者，立体定位注射是一种针对成年小鼠特定脑区的方法。通过注射表达cDNA或shRNA的基因工程病毒，可实现特定脑区的基因表达调控。尽管每只小鼠的脑大小存在差异，但可利用小鼠颅骨上的解剖标志点所建立的立体定位坐标来确定特定脑区的位置。最常用的解剖标志点包括前囟（bregma）、后囟（lambda）和耳间线（interaural line）。根据脑图谱提供的坐标4，可通过从前囟/耳间线交点出发的前后（A/P）、内外侧（M/L）和背腹（D/V）三个轴向精确定位各个脑区。通常，注射到小鼠脑内的病毒会标记红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP），以便通过荧光显微镜确认注射位置。
对小鼠进行行为学评估对于精神疾病的基础研究尤为重要。患者的精神疾病症状通常表现为异常行为。其中一些人类行为在进化上具有保守性，可在小鼠中直接模拟并观察。例如，可通过测量小鼠的“行为绝望”来建立抑郁症模型。抑郁症患者常感到自己所做的一切均无济于事，这一症状最终可能导致自杀。在啮齿类动物中，可采用强迫游泳实验（Forced Swim Test, FST）对此进行建模，该实验通过测量小鼠在水中游泳与漂浮的时间（后者被视为放弃行为）来评估其状态。该范式已通过使用抗抑郁药物挽救表型得到验证7,8,9。接受抗抑郁药物处理的小鼠，其静止时间显著短于未治疗的对照组。另一种行为学实验——旷场实验（Open Field Test, OFT），旨在评估小鼠的运动能力，同时可用于分析小鼠的焦虑表型5,6。该实验基于以下假设：在陌生的开阔环境中，小鼠靠近墙壁时会感觉更安全。野生型小鼠作为具有探索天性的动物，最终会探索这一新环境。然而，若小鼠在旷场中心区域停留时间较短，则提示其存在焦虑状态，因其无法克服由新环境引发的初始恐惧。通过小鼠在旷场中心区域停留时间所量化的焦虑程度，可与人类临床焦虑相比较，后者广泛存在于多种精神疾病中。
立体定位注射与行为学范式相结合是一种在特定脑区调控特定基因表达的新方法。随后可确定基因表达改变对小鼠行为的影响。与全脑基因敲除相比，该方法的优势在于仅靶向特定脑区。此外，立体定位注射通常在成年野生型小鼠中进行，因此内源性基因表达在发育阶段得以完整保留。该方法可避免因基因在胚胎期或出生后发育阶段对生存至关重要而带来的混杂效应。主要局限性在于实验小鼠需接受侵入性手术，需打开小鼠颅骨。此外，基因调控的程度取决于病毒的滴度和感染效率。病毒必须通过立体定位坐标注入正确脑区，这需要特殊仪器。正确注射位点的验证只能在动物处死后完成。
该方法此前已被用于检测特定基因在多种神经系统疾病中的作用。例如，已有研究将靶向 Th 基因（该基因可促进多巴胺合成）的病毒介导RNA干扰载体注射至黑质致密部，并进行了运动行为分析10。另一项研究通过立体定位注射可沉默 DISC1 的慢病毒，评估小鼠与精神分裂症相关的行为表现，结果显示 DISC1 基因表达下调后，小鼠在新奇环境中的活动量增加（类似于精神分裂症的阳性症状），并在强迫游泳实验（FST）中表现出更高的静止时间11。类似地，另有研究发现，通过该方法实现 5-HT1B 过表达后，小鼠在开放场实验（OFT）中表现出更强的探索行为，呈现出抗焦虑表型特征12。立体定位注射还可递送 Cre 病毒，以在 Cre-loxP 小鼠中诱导基因重组。该技术曾被用于选择性敲除杏仁核及终纹床核中的 Y2 受体基因。行为学分析结果显示，当 Y2 受体基因在中央杏仁核中被敲除时，小鼠表现出抗抑郁表型；而在基底外侧杏仁核或终纹床核中敲除该基因时，则未观察到明显表型13。因此，该技术为研究基因对动物行为的影响提供了独特的工具。

<table><tbody><tr><td>立体定位仪 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential 立体定位泵&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>注射器，65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细外科工具</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>精细外科工具</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>持针器&amp;nbsp;</td><td>精细外科工具</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>钻机</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque 控制箱，Tech2000 手柄</td><td>带脚踏板</td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝线&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>可吸收，反向切割</td></tr><tr><td>棉签</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>一次性注射器</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>布巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin 或其他麻醉剂</td><td>参见配方引用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酮洛芬或其他镇痛剂</td><td>参见兽医&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>追踪软件</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>追踪摄像头</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

应用立体定位注射技术研究基因对动物行为的影响

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

立体定位注射是一种有用的技术，可用于将高滴度的慢病毒递送至小鼠脑内的特定区域。慢病毒可在相对局限的脑区实现基因的过表达或表达敲低，同时对脑组织造成较小损伤。注射后经恢复，可对小鼠进行多种行为学任务测试，例如开放旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）。开放旷场实验通过测量小鼠在新颖开放环境中央区域停留的时间，用于评估其运动能力及焦虑表型。相较于对照组，焦虑程度更高的小鼠在新颖环境中央区域停留的时间显著更短。强迫游泳实验则通过量化小鼠被置于水桶中时静止不动的时间，评估其抗抑郁表型。具有抗抑郁表型的小鼠相较于对照动物，其静止不动的时间显著减少。本实验方案的目标是结合慢病毒立体定位注射与行为学测试，探究遗传因素如何调控动物行为。

精确的立体定位注射在很大程度上依赖于正确设定坐标。用于注射病毒的针尖应准确置于前囟（bregma）与耳间线的交点处（图1）。使用体视显微镜有助于判断针尖是否放置到位。通过显微镜观察时，应调整针的位置，使得一旦注射病毒，其注射点恰好位于前囟与耳间线的交点处，即注射针头的开口应正对准该交点上方。本研究中，将一种表达针对外显子连接复合体核心因子 RBM8a 的 shRNA 的慢病毒注射至齿状回。该慢病毒同时表达红色荧光蛋白（RFP），以标记被感染的神经元。图2 显示病毒已成功注射至目标区域，红色信号清晰指示了注射位置（图3）。
为了在行为学任务中达到显著性，每组小鼠的数量应在12至15只之间。行为学任务可在立体定位注射后两周进行。在开放旷场实验（OFT）中，若小鼠在开放场中心区域停留的时间显著少于对照组，则表现为焦虑表型。结果表明，在成年小鼠齿状回中敲低RBM8a会导致焦虑样行为（p &lt;0.05，图4）。在强迫游泳实验（FST）中...

通过立体定位注射表达 cDNA 或 shRNA 的慢病毒，可调控小鼠特定脑区的基因表达。本文中，我们介绍了一种将立体定位注射与行为学实验（如旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST））相结合的实验方案。

立体定向注射是一种有用的技术，可用于将高滴度的慢病毒递送至小鼠的特定脑区。慢病毒可实现目的基因的过表达或...

本实验的总体目标是评估调控特定目标区域基因表达对动物行为的影响。首先，构建慢病毒以调控目标基因的表达；其次，通过立体定位注射将慢病毒注入雌激素受体（ER）啮齿类动物脑内的特定区域。随后，可以使用已建立的行为范式对焦虑和抑郁等行为进行定量测量。最后一步是进行组织学分析，以确认注射位点的准确性。最终，立体定位注射结合行为学评估可以揭示目标区域内的特定基因如何影响小鼠的行为。与现有方法相比，该技术的主要优势在于科学家能够改变小范围内特定区域中单个基因的表达，然后评估小鼠的行为变化。开始此操作时，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中，将其门齿卡入前部夹具并固定下颌。然后将耳棒插入耳道，以完全稳定头部。接下来，在小鼠身下放置加热垫以调节其体温。在整个操作过程中，需在啮齿类动物的眼睛上涂抹人工泪液，以防止角膜干燥。随后，彻底清洁手术区域，首先用棉签蘸取10%聚维酮碘溶液，以环形动作擦拭。随后以相同方式在小鼠手术部位擦拭70%乙醇。重复此清洁步骤两次。小鼠准备完毕后，打开无菌器械袋。在接触器械前更换手套。然后取出无菌布，将器械放置在无菌布上。现在用有齿镊轻轻夹住小鼠的皮肤，并用手术刀进行切口。从耳部上方约1.5厘米处开始切口，延伸至耳部下方约0.5厘米处，以暴露bgma。一旦观察到bgma，使用无菌棉签轻轻清除覆盖在颅骨表面的任何血液。然后使用两根棉签将皮肤向头部两侧推开。接下来，在通风橱中，用待注射的病毒填充注射器，确保内部无气泡残留。然后将注射器安装到立体定位仪上，确保其完全固定。此后，缓慢降低注射器，使其恰好位于颅骨表面的上方。然后将无菌注射器针头的尖端移至 B bgma 与左右中线交点处。将此点设为零点。随后设定感兴趣区域的坐标。将注射器针头移至目标钻孔位置。然后将钻头置于目标位置正上方，与颅骨呈45度角，开始钻孔。注意避免钻入脑组织，以防止皮层损伤。随后，用无菌棉签清除孔洞中的血液。将注射器下放，使针尖恰好接触脑表面。将DV坐标设为零，然后将注射器降至所需深度。现在以每分钟0.2微升的速度开始注射。注射完成后，等待约两分钟，以确保任何残留的病毒已被充分吸收。然后缓慢抬起注射器。使用棉签清洁注射部位的任何液体。之后缝合皮肤，并将动物从立体定位仪中取出。将小鼠保留在加热垫上直至其苏醒，并在需要时给予额外镇痛剂。在此步骤中，准备一个塑料方形实验区域。实验前用70%乙醇清洁实验区域。然后将实验装置放在地面上，并确保照明条件已调整至最小化阴影和反光。接着，调节检测设置，使小鼠在屏幕上清晰可见。随后，打开摄像机以记录行为学任务，并将小鼠放置在实验装置前部中央位置，使其面朝墙壁。设置计时器为五分钟，离开实验区域或离开房间。五分钟后，将小鼠转移回笼中。在进行下一只动物实验前，使用70%乙醇彻底清洁实验区域。现在，用22摄氏度的水装满一个2升的透明桶。将水桶放在地面上，并确保照明条件能够最大限度减少阴影和反光。如果使用追踪软件，请将摄像头正对水桶上方放置。调整软件设置，使小鼠在屏幕上清晰可见。然后打开摄像头以记录行为学任务。将小鼠轻轻放置于水桶中央，使其前肢。先接触水面，防止其头部完全浸入水中。随后，设置计时器为六分钟，然后离开行为学实验区域。六分钟后，将小鼠从桶中取出，擦去多余的水分，再放回笼中。这是一张具有代表性的脑切片图像，显示了病毒成功注射到齿状回。该图展示了对照组和实验组小鼠在新型开放场地中心区域停留的时间。实验组小鼠在场地中心停留的时间显著减少，表明其具有焦虑表型；该图还显示了对照组和实验组小鼠在强迫游泳实验中的静止时间。实验小鼠在静止状态所花费的时间与对照组相比无显著差异。观看本视频后，观众应能较好地掌握如何利用立体定位注射技术来评估啮齿类动物的行为。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

应用立体定向注射技术在研究动物行为的遗传效应

来源：Porlan, E., 等．用于分析成年小鼠V-SVZ神经干细胞自主性与非自主性效应的稳定高效遗传修饰细胞方法．J. Vis. Exp.

小鼠模型中用于稳定遗传修饰的病毒立体定位注射

来源：Fricano-Kugler, C. J., et al. 通过立体定位注射设计、包装和递送高滴度 CRISPR 逆转录病毒和慢病毒。J. Vis. Exp.

小鼠脑内靶向神经元基因编辑的立体定位病毒注射

本文介绍了如何将病毒载体微量注射到小鼠脑内，随后在条件性位置偏爱范式中进行测试，该范式包括获得、消退和复燃三个阶段。...

立体定位微量注射表达Cre重组酶的病毒载体以研究靶基因在可卡因条件性位置偏爱中的作用

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本文介绍了如何将病毒载体注射到小鼠前额叶皮层，以检测需要G蛋白偶联受体异源多聚体形成的动物行为学实验。...

通过HSV介导的嵌合构建体转基因表达研究小鼠GPCR异源寡聚体的行为功能

我们描述了一种使用自制固定装置进行立体定位手术的方案，用于将试剂微量注射到新生小鼠脑的纹状体中。该技术可实现对新生小鼠脑特定区域神经元细胞的遗传操作。...

新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

本方案描述了一组利用离体脑片中的光遗传学刺激，鉴定来自远端脑区的长程输入的细胞类型特异性功能连接的方法。...

在体小鼠脑切片中长程投射通路的光遗传学刺激：颅内立体定位注射方法

新近发现的疾病相关基因在神经精神障碍发病机制中的作用仍不明确。一种改良的双侧子宫内电穿孔技术可实现将基因转入大量神经元群体中，并可用于研究基因表达变化对社交行为的因果影响。...

利用双侧子宫内电穿孔技术研究基因对啮齿类动物行为影响的实验流程

本方案描述了一种实用策略，可在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪前，加快立体定位注射坐标的验证步骤。...

通过冰冻切片法对立体定位注射坐标的初步验证

microRNA 在脑结构和功能中具有重要作用。本文介绍一种通过立体定位注射表达 microRNA 的慢病毒载体以实现海马区 microRNA 过表达的方法。该方法可作为相对快速评估 microRNA 功能的手段 体内...

向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

学习使用立体定向注射技术在小鼠特定脑区调控基因表达，结合旷场实验和强迫游泳实验定量评估焦虑与抑郁相关行为变化，并通过组织学验证注射位点准确性，为神经科学研究提供基因与行为关系的可靠方法。

应用立体定位注射技术研究基因对动物行为的影响

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