利用衣壳抗原掺入战略的腺病毒血清型5载体疫苗方法的发展

该程序的总体目标是利用抗原帽掺入策略开发腺病毒血清型五载体疫苗方法，使用重组二价腺病毒载体作为原理证明，通过使用抗原衣壳掺入策略，使用多个克隆步骤构建修饰的质粒，A D 5 R 1 K-W-S-H-V-R 5 嘶嘶声。接下来是二价腺苷酰病毒载体。R 1 K 是 HVR 5。

嘶嘶声被拯救、繁殖和净化。然后表征病毒滴度和掺入抗原在病毒衣壳上的抗原展示。最后，通过使用抗原衣壳掺入策略评估二价 Aden 病毒载体规避 D 5 阳性血清中和的潜力。

使用多个克隆步骤构建修饰的质粒，A D 5 R one K-W-A-S-H-V-R 5 嘶嘶声。今天，我们将演示抗原衣壳掺入策略。与转基因表达法等其他策略相比，这种策略是有益的，因为它不仅将目标抗原作为蛋白质显示在腺病毒捕获物上，而且还允许针对该抗原产生强烈的体液反应。

这种方法的视觉演示至关重要，因为有关生成帽修饰腺病毒的步骤很难学习，因为许多变量有助于推荐病毒载体的开发，例如限制性内切酶的选择、他人感兴趣能量的透镜演示程序。今天是我的两位博士后，Lin Lin Gu 博士和 Nitra Farrow 博士。还有实验室的研究助理 Alexandre Kren为了构建穿梭质粒，添加 GE one 和 CCC 1 各 6 个单位到 6 μg 的 HVR one KWA 片段。

将消化反应在 37 摄氏度下孵育 3 小时。通过电泳分离 2% agros 凝胶中的消化片段，并根据制造商的方案使用 DNA 凝胶提取试剂盒纯化片段。接下来，将 12 ng 纯化片段连接到先前构建的 100 ng 穿梭质粒的 G 1 和 ACC one 位点。

HVR 5 嘶嘶声、6 个 pH 值 5 秒和 10 μL 反应体积在室温下反应 2 小时。然后将 1 微升连接反应添加到 50 微升电感受态 DH 5 α 细胞中，即 8 电细胞，然后加入 950 微升 SOC 培养基。将转化的细胞在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育 1 小时，然后将 100 至 200 微升培养物涂布到 LB CANY 板上。

在 37 摄氏度下孵育过夜。使用 Echo R one 和 PME one 各 6 个单位在 37 摄氏度下消化 6 μg 纯化的穿梭质粒 3 小时。纯化含有同源重组臂和双修饰外显子 5 基因的片段后，使用 SUA 1 将骨架质粒线性化，PAD 5、delta H 5 进行同源重组。

使用电穿孔将每个纯化的穿梭片段和骨架质粒各 100 ng 共转化成 50 微升电感受态 BJ 5 180 3 细胞。如本视频前面部分所示，第二天，将大约 10 个菌落挑选到 3 毫升含有罐头霉素的液体 LB 中，并在根据文本方案进行筛选之前生长过夜。然后将 100 ng 纯化的质粒转化到 DH 5 α 细胞中，如前所述，以挽救添加的病毒载体。

首先使用 PAC one 在 100 μL 体积中线性化 15 μL 载体。消化后在 37 摄氏度下孵育 3 小时。在通风橱下提取线性化质粒。

向反应离心机中加入等体积的苯酚氯仿、异戊醇，浓度为 10， 000 G，反应 1 分钟，收集上清液，然后重复提取并旋转至提取体积。加入 300 微升 100% 乙醇和 10 微升乙酸盐，以 10， 000 G 离心 10 分钟。然后，弃去上清液后，加入 700 微升 70% 乙醇，然后再次旋转。

重悬沉淀物并定量 DNA 后，根据制造商的说明，将 3 μg 线性化质粒与市售脂质体转染试剂转染到先前制备的 80% 汇合 HEK 2 93 细胞的 T 25 培养瓶中。孵育 6 小时后，用完全培养基替换转染培养基，然后将培养瓶放回培养箱中。当斑块在无菌罩下产生完全的细胞病变效应或 CPE 时，从培养瓶上刮下剩余的细胞，并在 300 G 和 4 摄氏度下离心培养物 10 分钟。

然后使用 1 毫升含有 2% FBS 的培养基重悬细胞沉淀。接下来，通过进行四轮冻融来打破细胞，然后将裂解物在 4 摄氏度下离心 10 分钟。收集含有拯救病毒的 S 上清液，以在大规模培养物上繁殖病毒载体。

T 25 培养瓶中所有病毒裂解物的 1/3 放入含有 HEK 2 93 细胞的 T 75 培养瓶中。如前所述，在允许完整的 CPE 发育并收获旋后神经后，在一个或多个中传播所有病毒的一半。然后，HK 2 93 细胞的 T 1 75 培养瓶将从 T 1 75 培养瓶中分离的病毒繁殖到十几个或更多。

T 1 制备 1 75 瓶细胞后 33 克/毫升和 1.45 克/毫升。氯化铯溶液将 4 毫升（每毫升 1.33 克）氯化铯加入超速离心管中，并在同一管底部加入 4 毫升（每毫升 1.45 克）氯化铯。在同一管的顶部加入 4 毫升病毒裂解物旋后液，然后在 110， 000 G 和 4 摄氏度下离心管 3 小时。

这将在引擎盖下将成熟的较低病毒条带与有缺陷的高病毒条带分开。使用连接到 3 毫升注射器的 33 号针头收集下部带。然后用 5 个 hippies 将溶液增加到 4 毫升。

然后，在准备另外两个氯化铯梯度后，将稀释的病毒加载到顶部，并在 110， 000 G 和 4 摄氏度下离心梯度过夜。在引擎盖下。收集刚刚演示的病毒带。

然后使用 33 号针头和 3 毫升注射器将病毒溶液注射到透析盒中。将盒放入根据文本方案制备的 700 毫升 1 x 透析缓冲液中，每 3 小时更换缓冲液 4 次。然后使用针头和注射器。

从盒中收集病毒溶液以确定病毒物理滴度。使用病毒裂解缓冲液将病毒和用作背景对照的透析缓冲液稀释 1 到 10 和 1 到 20，并将所有试管在 56 摄氏度下孵育 10 分钟。打开生物光度计并将吸光度模式设置为 260 纳米的光密度。

单击空白按钮，使用稀释至 1 比 10 的透析缓冲液来平衡背景信号。在生物光度计屏幕上键入 10 加 90。用稀释至 1 比 10 的病毒管更换试管，并读取稀释至 1 比 10 的病毒信号。

要测量 1 比 20 的稀释度，请使用稀释至 1 比 20 的透析缓冲液来平衡背景，在屏幕上键入 5 加 95，然后用 1 比 20 稀释的病毒管替换缓冲管并读取信号。将两个病毒读数数乘以 1.1 乘以 10 到 12，然后根据两个稀释度的两个单独滴度，以每毫升 VP 为单位计算平均滴度。根据文本方案评估小鼠中的病毒，以证明拯救的病毒是否在病毒衣壳表面显示抗原 HIV 抗原和 hist 标签。

主要蛋白质 Heon 5.Eliza 分别用人二 F 五单克隆抗体和小鼠抗嘶嘶声标签单克隆抗体进行，如图所示，人二 F 五抗体和小鼠抗嘶嘶声抗体均与二价加五病毒颗粒结合，而与阴性对照没有结合。采用 5 载体蛋白质血分析确认 E iza 数据，因为人 2 个 F 5 抗体和小鼠抗嘶嘶声抗体均检测到 117 道尔顿左右的特异性条带。

在 DIVALENT 中加入 5 个病毒，它对应于 Heon 5 蛋白的大小。为了评估构建的 add five 病毒通过添加 5 个阳性来规避中和作用的潜力，进行了中和测定。结果表明，当对照添加 5 载体处理而不添加 5 阳性血清时，相对发光单位或 rlu 比用血清处理时高 12 倍，这表明病毒已被中和。

相比之下，处理和未处理的样品之间构建的二价 AD 5 病毒的 R 使用几乎没有差异，这表明构建的病毒逃避了中和。观看此视频后，您应该对 add five 载体疫苗开发的抗原衣壳掺入方法有了更深入的了解。目前，我们正在将这种策略与稀有血清型载体结合使用。

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