Name: 利用衣壳抗原掺入战略的腺病毒血清型5载体疫苗方法的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学习利用衣壳抗原掺入策略开发腺病毒血清型5二价载体疫苗的方法。该技术通过将抗原嵌入病毒衣壳，有效逃避免疫中和并增强免疫原性，为疫苗研发提供新思路。

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本研究部分由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 5T32AI7493-20 和&#160;5R01AI089337-03。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

根据批准的协议编号101109272，阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物使用与护理委员会已批准本研究中所述小鼠的使用。
1. 采用抗原衣壳整合策略构建修饰质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
<ol>
	<li>穿梭质粒 HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 的构建
	<ol>
		<li>订购一个质粒，其中包含在六邻体5基因（hexon5 gene）的 AgeI 至 AccI 限制性酶切位点之间的合成 DNA 序列 HVR1-KWAS。</li>
		<li>将 6 µg 合成片段（HVR1-KWAS）用 AgeI（6 单位）和 AccI（6 单位）酶在 37 °C 条件下消化 3 小时。通过电泳在 2% 琼脂糖凝胶中分离消化后的片段，并根据制造商说明书使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化该片段。</li>
		<li>根据插入片段与载体的摩尔比为 3 : 1，使用 T4 DNA 连接酶及其缓冲液，在 10 µl 体系中于室温（RT）连接 12 ng 片段（HVR1-KWAS）至 100 ng 已构建的穿梭质粒 HVR5-His6/pH5S17 中，连接时间为 2 小时，通过 AgeI 和 AccI 位点完成连接。</li>
		<li>取 10 µl 连接产物中的 1 µl，转入 50 µl 电转感受态 DH5α 细胞中，在电穿孔仪中（1800 V）进行转化。向转化后的 DH5α 细胞中加入 950 µl SOC 培养基，于 37 °C、300 rpm 条件下孵育 1 小时。取 1 ml 混合液中的 100–200 µl 涂布于含卡那霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，37 °C 过夜（O/N）培养。
		<ol>
			<li>通过针对 HVR1-KWAS 片段的 PCR 方法筛选约 10 个菌落：将正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）、反向引物（GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC）和单个 DH5α 菌落加入 PCR 预混液中（按制造商说明书配制）。参照 PCR 预混液提供的手册，在热循环仪上运行样品。</li>
			<li>使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）对 1.1.4.1 节中筛选出的克隆进行 HVR1-KWAS 片段的测序。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 的构建
	<ol>
		<li>将 6 µg HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 质粒用 EcoRI（6 单位）和 PmeI（6 单位）酶在 37 °C 条件下消化 3 小时，并如步骤 1.1.2 所述纯化含有同源重组臂及双修饰六邻体5基因的片段。用 SwaI 酶线性化骨架质粒 pAd5/∆H5（GL）16。</li>
		<li>将来自穿梭质粒的 100 ng 目标片段与 100 ng 线性化的 pAd5/∆H5（GL）骨架质粒共转化至 50 µl 电转感受态 BJ5183 细胞中，在电穿孔仪中（1800 V）进行同源重组。向转化后的细胞中加入 950 µl SOC 培养基，于 37 °C、300 rpm 条件下孵育 1 小时。取 1 ml 混合液中的 100–200 µl 涂布于含卡那霉素（终浓度 50 µg/ml）的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
		<ol>
			<li>挑取约 10 个微小菌落接种至含卡那霉素（终浓度 50 µg/ml）的 3 ml 液体 LB 培养基中，在摇床（250 rpm，37 °C）中过夜培养。从培养物中提取质粒。使用 PCR 分析针对 HVR1-KWAS 片段筛选这 10 个菌落，方法如步骤 1.1.4.1 所示。</li>
			<li>使用 PCR 分析针对骨架基因组的 pIX 片段对相同菌落进行筛选：将正向引物（AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT）、反向引物（CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT）和单个 BJ5183 菌落加入 PCR 预混液中（按制造商说明书配制）。参照 PCR 预混液提供的手册，在热循环仪上运行样品。</li>
			<li>将 PCR 双阳性菌落命名为 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将 100 ng 质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 转化至 DH5α 细胞中，操作如步骤 1.1.4 所示。
		<ol>
			<li>使用 PCR 分析针对 HVR1-KWAS 片段筛选约 10 个菌落，方法如步骤 1.1.4.1 所示。</li>
			<li>使用 PCR 分析针对骨架基因组的 pIX 片段对相同菌落进行筛选，方法如步骤 1.2.2.2 所示。</li>
			<li>使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）对 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 中的 HVR1-KWAS 片段进行测序。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 修饰型 Ad5 病毒载体 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 的制备
<ol>
	<li>通过向高糖DMEM中添加胎牛血清（FBS，终浓度10%）、100倍非必需氨基酸溶液（终浓度0.1 mM）、200 mM L-谷氨酰胺（终浓度2 mM）和青霉素/链霉素溶液（终浓度1%），配制完全培养基。在培养箱（37 °C，5% CO₂，85%湿度）中，用完全培养基培养人胚胎肾（HEK293）细胞。</li>
	<li>病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的拯救6
	<ol>
		<li>种子 3.0 × 106 在含5 ml完全培养基的一个T-25培养瓶中接种HEK293细胞，过夜培养至形成汇合度为80%的单层细胞。</li>
		<li>线性化15 µg的pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 在100 µl体系中，加入限制性内切酶PacI（15单位），37 °C反应3小时。
		<ol>
			<li>提取线性化的 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 在通风橱中，先加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25 : 24 : 1），离心两次（10,000 × g，1 min）；随后依次加入混合液（300 µl 100%乙醇和10 µl乙酸钠）离心（10,000 × g，10 min），再加入700 µl 70%乙醇离心（10,000 × g，10 min）。每次离心后弃去上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将纯化的质粒重悬于约 40 µl 的蒸馏水或 Tris-EDTA（TE）缓冲液中。通过测量 260 nm 处的光密度（OD）来定量质粒 DNA。</li>
		<li>在T-25培养瓶中，按照生产商说明书，使用商用脂质体转染试剂转染3 µg线性化质粒。转染后6小时，更换为完全培养基，并继续在培养箱中孵育。每两至三天更换一次完全培养基，维持转染细胞培养，直至形成单个病毒蚀斑。</li>
		<li>当噬斑出现完全的细胞病变效应（CPE）时，在无菌操作台中将剩余细胞从培养瓶上刮下，通过在4 °C下以300 × g离心10分钟收集细胞裂解液。将细胞沉淀重悬于约1 ml含2% FBS的培养基中，反复冻融四次以裂解细胞。在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，收集上清液，其中含有拯救出的病毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大规模扩增病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，用T-25培养瓶的1/3至全部裂解物感染含有HEK293细胞的T-75培养瓶以扩增病毒。将培养物置于细胞培养箱中孵育2至3天，直至完全出现细胞病变效应（CPE）。按步骤2.2.5所述方法收集裂解物上清液。</li>
		<li>在生物安全柜中，根据病毒增殖条件，使用T-75培养瓶的1/2至全量裂解物感染一至三个T-175培养瓶以扩增病毒。在培养箱中培养两至三天，直至完全细胞病变效应（CPE）出现。按照步骤2.2.5所述方法收集裂解物上清液。</li>
		<li>在无菌操作台中，使用前一批T-175培养瓶的½至全量裂解液感染一打或更多T-175培养瓶以扩增病毒。根据病毒扩增条件及所需病毒量确定培养瓶使用数量。当培养箱中培养物在两至三天内出现完全细胞病变效应（CPE）时，按照步骤2.2.5所述收集裂解上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 纯化6 通过氯化铯
	<ol>
		<li>在5 mM HEPES中配制两种密度的CsCl溶液：1.33 g/ml和1.45 g/ml，配制过程中避免接触CsCl。</li>
		<li>在无菌超速离心管中加入4 ml CsCl（1.33 g/ml），然后轻轻沿管底加入4 ml CsCl（1.45 g/ml）。在无菌操作台中，将4 ml裂解液上清缓慢加于梯度液上方。</li>
		<li>在4 °C条件下，以110,000 × g离心3小时，使成熟病毒（下层病毒带）与缺陷病毒（上层病毒带）分离。使用装有33 G针头的3 ml注射器收集下层病毒带，并在无菌操作台中用5 mM HEPES稀释至终体积4 ml。</li>
		<li>另取一根离心管，按步骤2.4.2所述加入两种密度的CsCl溶液及稀释后的病毒条带。在4 °C条件下，以110,000 x g离心过夜。按步骤2.4.3所述收集病毒条带。</li>
		<li>在超净工作台中，使用装有33 G针头的3 ml注射器将收集的病毒溶液注入透析盒中。</li>
		<li>将胶盒置于700 ml 1×透析缓冲液中（1 L&#160;配方：100 ml 10倍浓缩 PBS、100 ml 100% 甘油和 800 ml 蒸馏水；用 0.22 µm 滤膜过滤缓冲液，每 3 小时更换透析缓冲液一次，共更换 4 次。使用带针头的注射器吸出透析后的病毒溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 拯救病毒载体的验证
<ol>
	<li>病毒载体滴定
	<ol>
		<li>对于病毒物理滴度，将病毒和透析缓冲液（背景对照）分别用病毒裂解缓冲液（Tris-EDTA 中含 10% SDS）按 1 : 10 和 1 : 20 稀释至小管中，并将所有管在 56 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>打开生物分光光度计，将吸光度模式设置为 OD 260 nm。使用稀释后的透析缓冲液（1 : 10）点击“空白”按钮以平衡背景信号。在生物分光光度计屏幕上输入&#34;10 + 90&#34;，然后读取稀释病毒（1 : 10）的信号。</li>
		<li>按照步骤 3.1.2 的方法读取稀释病毒（1 : 20）的信号，但在生物分光光度计屏幕上输入&#34;5 + 95&#34;。将两次病毒读数乘以 1.1×1012，并根据两个稀释度所得的独立滴度计算平均滴度，单位为 VP/ml。</li>
		<li>对于病毒感染性滴度（IP/ml），采用 KARBER 统计学 TCID50 方法14 测定感染后 10 天（d.p.i.）HEK293 细胞上的感染程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估病毒载体表面抗原暴露情况
	<ol>
		<li>将病毒载体包被于 ELISA 板中，并按照标准 ELISA 方法14 进行后续步骤。使用人源抗 gp41（2F5）单克隆抗体（mAb）和鼠源抗 His 标签单克隆抗体（mAb）检测相应整合的抗原14。</li>
		<li>通过变性蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE）分离病毒载体，并按照标准 Western 印迹方法14 进行后续步骤。使用人源抗 gp41（2F5）单克隆抗体（mAb）和鼠源抗 His 标签单克隆抗体（mAb）检测相应整合的抗原14。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 评估载体逃避 Ad5 阳性血清的能力
	<ol>
		<li>在培养箱（37 °C、5% CO2、85% 湿度条件）中，使用完全培养基培养 HeLa 细胞。通过向 Eagle 最低必需培养基（MEME）中添加 FBS（终浓度 10%）、200 mM L-谷氨酰胺（终浓度 2 mM）和青霉素/链霉素溶液（终浓度 1%）配制完全培养基。</li>
		<li>以每孔 1×106 个细胞的密度将 HeLa 细胞接种至 6 孔板中，在培养箱（37 °C、5% CO2、85% 湿度条件）中孵育 2 小时。在加入含细胞的 6 孔板前，先将 Ad5 阳性血清（0.1 µl 或 0 µl）与每细胞 5 IP 的病毒载体（Ad5 或 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6）在培养箱中孵育 1 小时。</li>
		<li>感染后 24 小时（h.p.i.），用 PBS 洗涤细胞一次，加入 0.5 ml 裂解缓冲液裂解细胞。以 15,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。由于病毒含有荧光素酶基因，取 20 µl 上清液与 100 µl 荧光素酶底物混合，用于检测荧光素酶信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 拯救病毒载体的免疫学评估
<ol>
	<li>准备两个免疫组：Ad5 和 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。
	<ol>
		<li>以同源“初免-加强”免疫程序，对小鼠（每组 n = 8）进行肌肉注射，每只小鼠接种剂量为 1×1010 VP，两次免疫间隔 2 周。</li>
		<li>每次注射后 2 周，使用动物采血针（针尖长度 5 mm）通过脸颊采血法在无麻醉状态下采集小鼠血液，收集至 1.5 ml 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将采集的血液在离心管中上下颠倒混匀，室温孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟，吸取上层血清转移至新的 1.5 ml 离心管中。
	<ol>
		<li>将新离心管在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟，再次转移血清至新标记的 1.5 ml 离心管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过基于血清的 ELISA 评估抗原特异性体液免疫反应
	<ol>
		<li>分别将 His 肽段（储存浓度 1 mM）和 HIV-1 肽段（储存浓度 1 mM）用 100 mM 碳酸盐缓冲液（pH 9.5）稀释，使包被浓度达到 10 µM。</li>
		<li>向 ELISA 板每孔加入 100 µl 稀释后的肽段溶液，4 °C 过夜孵育以完成包被。</li>
		<li>用 PBST 每孔 200 µl 洗涤 4 次，加入含 5% BSA 的 PBST 封闭液封闭 1 小时。将小鼠血清用封闭液按 1:100 稀释，每孔加入 100 µl，室温孵育 2 小时。</li>
		<li>用 PBST 每孔 200 µl 洗涤 4 次。每孔加入 100 µl 封闭液，室温孵育 30 分钟进行再封闭&#160;。</li>
		<li>将辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体（用封闭液按 1:5000 稀释）分别加入至包被 His 肽段和 HIV-1 肽段的 ELISA 板中，每孔 100 µl，室温孵育 2 小时，随后用 PBST 洗涤。</li>
		<li>加入 HRP 底物孵育 30 分钟后，在 OD450 nm 波长下读取吸光度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突披露。

传统的转基因策略在Ad5修饰用于疫苗开发方面的应用已显著减少，主要原因是Ad5的PEI存在瓶颈4,6。这一瓶颈可通过采用替代性的抗原衣壳整合策略在一定程度上缓解（图1A），因为该策略可通过用目标抗原替换Ad5的中和表位，从而逃逸Ad5中和抗体（NAbs）的中和作用，并促进对整合的目标抗原产生强效免疫应答。本研究中，构建修饰型二价病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6被作为概念性示例予以介绍（图1B）。对应于方案第1.1.1节，订购质粒中合成的片段包含在六邻体5（hexon5）HVR1区域插入的HIV-1 gp41短基因片段。该部分gp41基因编码一个表位ELDKWAS，取代了hexon5氨基酸139至144位的部分HVR1序列14。ELDKWAS是HIV-1 gp41中的一个强效中和表位19。
在克隆过程中有两个关键步骤。其中一个步骤是在方案第1.1.1节中合成目的基因片段时选择两种限制性内切酶。这两种酶的...

人腺病毒（Ad）是一种中等大小、无包膜的病毒，具有二十面体核衣壳，内含双链DNA基因组。腺病毒属于腺病毒科（Adenoviridae），可分为七个组（A至G），每组包含不同血清型的病毒。其中，C组的人腺病毒血清型5（Ad5）是研究最深入、应用最广泛的类型，常用于基因治疗和疫苗开发等载体技术。
传统的转基因策略已开发并应用于Ad5的改造，其特点是用目的基因替换病毒的早期基因，并在宿主中实现目的基因的特异性表达。例如，通过用猴免疫缺陷病毒的rev基因替换早期基因3（E3）构建pENV9/Ad5hr∆E31，通过用人类免疫缺陷病毒（HIV）的gag基因替换早期基因1（E1）构建AdCMVGag2，以及通过用lacZ基因替换E1构建AdlacZ3。传统转基因策略在Ad5上的广泛应用依赖于以下优点：Ad5具有广泛的宿主范围、可行的病毒基因工程操作与病毒扩增能力、对外源基因插入较大的容纳能力以及良好的安全性4,5。然而，采用该策略的Ad5载体临床治疗效果有所降低，已成为主要瓶颈，这主要与Ad5的预存免疫（PEI）有关，因为Ad5在大多数儿童和成人中普遍存在4,6。
为了克服Ad5的主要瓶颈，首要目标是开发一种绕过Ad5预存免疫（PEI）的替代策略。已有研究表明，针对Ad5的先天免疫7、适应性免疫（如中和抗体（NAbs）8-10）以及CD8+ T细胞应答10均会促成Ad5的预存免疫，其中Ad5中和抗体在Ad5 PEI的形成中起主导作用10,11。此外，Ad5中和抗体所识别的表位位于衣壳蛋白上，包括主要蛋白六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）和五邻体基底蛋白（penton base）。其中，六邻体是Ad5中和抗体最主要的作用靶点8,11-13。基于这些发现，已提出一种创新性的抗原衣壳整合策略。该新策略强调将目的蛋白替换或整合至Ad5衣壳蛋白中，从而改变或屏蔽Ad5的中和表位，降低中和抗体的识别能力，实现高效的Ad5载体给药。值得注意的是，该策略具有竞争优势，因为它还能通过将目的抗原直接呈递给免疫系统，帮助宿主产生强烈的体液免疫和有效的细胞免疫4,14,15。基于该策略，分子克隆与重组腺病毒载体的拯救在结构上可分为四个主要步骤：（a）通过聚合酶链式反应（PCR）或基因合成方法制备目的基因片段；（b）将目的基因片段连接至穿梭质粒，该质粒包含目的基因片段及与腺病毒骨架同源的同源臂；（c）通过将含有目的基因片段的穿梭质粒与线性化的骨架质粒pAd5/∆H5（GL）16共转化，实现同源重组；（d）转染线性化的重组腺病毒质粒，以拯救整合了目的抗原的重组Ad载体。
我们的研究团队及其他一些团队已将这种替代性腺病毒（Ad）整合策略拓展应用于针对不同传染性病原体的腺病毒载体疫苗开发。我们报道了重组腺病毒载体Ad-HVR1-lgs-His的构建6通过将带有His标签的HIV-1抗原V3插入Ad5六邻体（hexon5）的HVR1区域，构建了V3嵌合载体。该载体可诱导针对V3表位的强烈体液免疫反应。4我们还报道了通过将HIV-1膜近端外结构域区（MPER）插入六邻体5的HVR2区域，开发出Ad5/HVR2-MPER-L15∆E1。2此外，周博士的团队已利用这种腺病毒载体整合策略的优势，开发出腺病毒3型（Ad3）载体疫苗， 即将肠道病毒71型的中和性表位SP70插入Ad3六邻体蛋白（hexon3）的HVR1区域，从而构建病毒载体R1SP70A3。R1SP70A3可诱导产生针对SP70表位的强效中和抗体和特异性IFN-γ，从而在肠道病毒71型攻击实验中提供高度保护作用15.
为提供技术参考，本研究采用了定性抗原衣壳整合策略，通过将一种HIV-1抗原插入六邻体蛋白（hexon5）的HVR1区，同时将His标签插入HVR5区，重点构建了一种二价腺病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。所构建的病毒载体亦进行了免疫学评价。该抗原衣壳整合策略可用于开发针对不同传染病的Ad5载体疫苗方法。

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30256.01</td><td>用于细胞传代&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30378.02</td><td>用于透析缓冲液配制</td></tr><tr><td>甘油</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>用于透析缓冲液配制</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0301</td><td>用于病毒裂解缓冲液配制</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30910.03</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>100x 非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30238.01</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液&amp;nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>高糖DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30081.01</td><td>用于HEK293细胞培养</td></tr><tr><td>最低必需培养基Eagle</td><td>SIGMA</td><td>M5650</td><td>用于HeLa细胞培养</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3803-100ML</td><td>用于大量DNA纯化</td></tr><tr><td>氯化铯&amp;nbsp;</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C68050</td><td>用于病毒纯化</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td>用于CsCl溶液配制</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>51-0036</td><td>用于病毒拯救与扩增</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>用于中和试验</td></tr><tr><td>T-25培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>用于细胞培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T-75培养瓶</td><td>CORNING</td><td>430641</td><td>用于细胞培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T-175培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910</td><td>用于细胞培养&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>BECKMAN</td><td>NA</td><td>用于病毒纯化</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>BECKMAN</td><td>344059</td><td>用于病毒纯化</td></tr><tr><td>透析夹&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>用于病毒透析</td></tr><tr><td>ELISA板</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>用于ELISA</td></tr><tr><td>人抗gp41（2F5）单克隆抗体</td><td>NIH AIDS试剂计划</td><td>1475</td><td>用于免疫学检测</td></tr><tr><td>小鼠抗His标签单克隆抗体</td><td>GenScript</td><td>A00186</td><td>用于免疫学检测</td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>CORNING</td><td>46-003-CR</td><td>用于转化</td></tr><tr><td>PCR预混液</td><td>QIAGEN</td><td>201445</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>动物采血针（针尖长度5 mm）</td><td>MEDIpoint</td><td></td><td>用于小鼠采血&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>生物分光光度计</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>用于病毒物理滴度测定</td></tr></tbody></table>

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

5型腺病毒（Ad5）在疫苗开发中已通过传统转基因方法进行了广泛改造。这些传统改造的Ad5载体在临床试验中效果降低，主要与大多数人群中存在的Ad5预存免疫（PEI）相关。为解决Ad5预存免疫问题，推动Ad5载体疫苗的研发，研究人员采用了创新的抗原衣壳整合策略。基于该策略，我们首先构建了六邻体穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-His6通过将六邻体蛋白（hexon）的高变区（HVR）1 克隆至先前构建的穿梭质粒 HVR5-His 中，获得 /pH5S6/pH5S，含有 His6 将带有HIV表位ELDKWAS的HVR1 DNA片段合成，并插入HVR5区域。HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 随后被线性化，并与线性化的骨架质粒 pAd5/∆H5 (GL) 共转化，以进行同源重组。该重组质粒为 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 转染至细胞中以生成病毒载体 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6该载体通过病毒物理滴度（VP/ml）、感染性滴度（IP/ml）及相应的VP/IP比值验证了其定性适配性。HIV表位和His6 标签在Ad5衣壳表面暴露，并保持了其表位特异性的抗原性。中和实验表明，这种双价载体能够逃避Ad5阳性血清的中和作用 体外小鼠免疫结果显示，针对HIV表位和His产生了强烈的特异性体液免疫反应6这项原理验证研究表明，通过修饰不同的衣壳蛋白，与抗原衣壳整合策略相关的方案可被可行地用于制备Ad5载体疫苗。该方案甚至可进一步改进，用于制备罕见血清型腺病毒载体疫苗。

抗原衣壳整合策略（图1A）被用于构建二价Ad5病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。首先，通过将HVR1-KWAS片段亚克隆至先前构建的穿梭质粒HVR5-His6/pH5S17中，构建穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S。其次，通过“EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI”片段与SwaI线性化的pAd5/∆H5 (GL)16之间的同源重组，构建质粒pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His614（图1B）。将PacI酶切的pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6转染至T-25培养瓶中，从而获得病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His614。随后，对该拯救出的病毒载体进行大规模扩增，并通过两次CsCl梯度超速离心进行纯化。
<p class=...

在此，我们介绍一种用于构建原理验证型二价腺病毒5型（Ad5）载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的实验方案。6 通过利用抗原衣壳整合策略，该载体被证明具有良好的适应性，并能够逃逸Ad5阳性血清的中和作用 体外以及所载抗原的抗原性和免疫原性。

5型腺病毒（Ad5）已通过传统的转基因方法在疫苗开发中进行了广泛改造。然而，这些……的效力有所降低。

本实验的总体目标是利用抗原衣壳整合策略，以重组双价腺病毒载体作为概念验证，开发基于5型腺病毒载体的疫苗方法。通过抗原衣壳整合策略，采用多步克隆技术构建修饰型质粒A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss，随后构建双价腺病毒载体R one K-HVR five。对Hiss进行拯救、扩增和纯化，随后表征病毒滴度以及病毒衣壳上整合抗原的抗原展示情况。最后，利用抗原衣壳整合策略评估双价腺病毒载体克服D五阳性血清中和作用的能力。通过多个克隆步骤构建修饰型质粒 A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss。今天我们将演示抗原衣壳整合策略。与转基因表达法等其他策略相比，该策略具有优势，因为它不仅能在腺病毒衣壳上以蛋白质形式展示目标抗原，还能诱导针对该抗原的强烈体液免疫反应。该方法的可视化演示至关重要，因为腺病毒帽修饰的构建步骤难以掌握，许多变量会影响推荐病毒载体的开发，例如限制性内切酶的选择、感兴趣能量范围的确定以及其他相关操作步骤的演示。今天参与实验的有两位博士后：Dr. Lin Lin Gu 和 Dr. Nitra Farrow，以及实验室研究助理 Alexandre Kren。为构建穿梭质粒，需将六单位的 GE one 和六单位的 CCC one 加入六微克的 HVR one KWA 片段中。将消化反应在 37 摄氏度孵育 3 小时。通过电泳在 2% 琼脂糖凝胶中分离消化片段，并根据制造商说明书使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化该片段。接着，将 12 纳克纯化片段连接至先前构建的穿梭质粒（100 纳克）的 AflII 和 AccI 酶切位点。在室温下，以5 µL pH 5.0的HVR缓冲液和10 µL反应体系进行连接反应，反应时间为2小时。然后取1 µL连接反应产物加入到50 µL电转感受态DH5α细胞中，电击转化后立即加入950 µL SOC培养基。将转化后的细胞在37°C、200 rpm条件下振荡培养1小时，随后将100至200 µL培养物涂布于LB氨苄青霉素平板上。在 37 摄氏度下孵育过夜。使用 Echo R one 和 PME one 各六单位，在 37 摄氏度下消化六微克纯化的穿梭质粒三小时。纯化含有同源重组臂和双修饰的外显子五基因的片段后，使用 SUA one 线性化骨架质粒 PAD five, delta H five，以进行同源重组。采用电穿孔法将各100纳克纯化的穿梭片段和骨架质粒共同转化至50微升电转感受态BJ51803细胞中。如本视频此前所示，次日挑取约10个菌落接种于3毫升含卡那霉素的液体LB培养基中，过夜培养后按照文本方案进行筛选。随后，将100纳克纯化的质粒转化至DH5α细胞中，操作方法如前所述，以拯救腺病毒载体。首先使用PAC I在100微升体系中酶切15微升载体，使其线性化。37摄氏度孵育3小时完成消化后，在通风橱中提取线性化的质粒。向反应物中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，于10,000 G离心1分钟，收集上清液，然后重复提取并离心至提取体积。加入300微升100%乙醇和10微升乙酸盐，于10,000 G离心10分钟。弃去上清液后，加入700微升70%乙醇，再次离心。在重悬沉淀并定量 DNA 后，按照生产商说明书，将三微克线性化质粒与商用脂质体转染试剂共同转染至已预先准备的、含有 80% 汇合度 HEK 293 细胞的 T25 培养瓶中。孵育六小时后，更换为完全培养基，并将培养瓶放回培养箱继续培养。当在无菌操作台内观察到细胞病变效应（CPE）完全形成时，用细胞刮将培养瓶中剩余的细胞刮下，并于 300 G、4°C 条件下离心培养物 10 分钟。然后用1 mL含2% FBS的培养基重悬细胞沉淀。接着，通过四次冻融循环裂解细胞，再将裂解液在4 °C下离心10分钟。收集含有拯救病毒的S上清液，用于在大规模培养中扩增病毒载体。将 T 25 培养瓶中三分之一至全部病毒裂解液转移至含有 HEK 293 细胞的 T 75 培养瓶中。待完全出现细胞病变效应（CPE）后，按前述方法收集上清液，并将其中一半病毒在一处或多处 T 175 培养瓶的 HEK 293 细胞中进行扩增，随后将从 T 175 培养瓶中分离的病毒在十二个或更多 T 175 培养瓶中继续扩增。在制备浓度为1.33克/毫升和1.45克/毫升的氯化铯溶液后，取T175培养瓶中的细胞。向超速离心管中加入4毫升1.33克/毫升的氯化铯溶液，再向同一管底部加入4毫升1.45克/毫升的氯化铯溶液。然后将4毫升病毒裂解液上清加至同一管顶部，于4°C、110,000 ×g条件下离心3小时。这将使成熟的下部病毒条带与有缺陷的上部病毒条带在通风橱中分离。使用连接在3毫升注射器上的33号针头收集下部条带。然后加入五 hippies 使溶液总体积达到4毫升。然后，再制备两份氯化铯梯度，将稀释后的病毒加在梯度顶部，在4°C条件下于110,000 G离心过夜。在通风橱内操作。按照刚刚演示的方法收集病毒条带。然后使用33号针头和3毫升注射器将病毒溶液注入透析盒中。将透析盒置于700毫升按文本方案配制的一倍透析缓冲液中，每3小时更换一次缓冲液，共更换4次。然后使用针头和注射器。收集盒式装置中的病毒溶液，以测定病毒的物理滴度。使用病毒裂解缓冲液将病毒以及用作背景对照的透析缓冲液分别按1:10和1:20稀释，并将所有试管在56摄氏度孵育10分钟。打开生物分光光度计，将吸光度模式设置为260纳米的光密度。通过点击空白按钮，使用稀释至1:10的透析缓冲液平衡背景信号。在生物光度计屏幕上输入10加90。将试管更换为稀释至1:10的病毒溶液管，读取稀释至1:10的病毒信号。为测定1:20稀释度，先使用1:20稀释的透析缓冲液平衡背景，在屏幕上显示5加95，然后将缓冲液管更换为1:20稀释的病毒管并读取信号。将两次病毒读数乘以1.1 × 10¹²，并根据两次稀释样本所得的独立滴度计算平均滴度，单位为每毫升病毒颗粒数（VP/mL）。按照文本方案在小鼠中评估病毒，以验证所拯救的病毒是否在病毒衣壳表面展示抗原性HIV抗原及组氨酸标签。主要蛋白Heon五。采用人源2F5单克隆抗体和小鼠抗His标签单克隆抗体分别进行ELISA检测，结果如图所示，人源2F5抗体和小鼠抗His抗体均可结合二价Ad5病毒颗粒，而阴性对照中无结合信号。通过A5载体的Western blot分析验证ELISA结果，人源2F5抗体和小鼠抗His抗体均仅检测到约117千道尔顿的特异性条带。在五型腺病毒中，其大小对应于五型纤维蛋白。为评估构建的五型腺病毒是否具有逃避五型阳性血清中和的能力，进行了中和实验。结果显示，当对照五型载体未用五型阳性血清处理时，相对发光单位（rlu）比使用血清处理时高出12倍，表明该病毒被有效中和。相比之下，处理与未处理样本在R利用方面对构建的二价AD五型病毒几乎没有差异，表明所构建的病毒逃逸了中和作用。观看本视频后，您应能更好地理解用于五型腺病毒载体疫苗开发的抗原衣壳整合策略。目前，我们正在将该策略与罕见血清型载体联合使用。您也可以这样做。

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在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内...

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通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

学习利用衣壳抗原掺入策略开发腺病毒血清型5二价载体疫苗的方法。该技术通过将抗原嵌入病毒衣壳，有效逃避免疫中和并增强免疫原性，为疫苗研发提供新思路。

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

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