方法培养人股骨组织外植体，究其利基转移性乳腺癌细胞定居

协议描述为研究乳腺癌细胞的迁移，增殖和定植于人体骨组织外植体模型系统。

该程序的目标是研究人体骨组织解释模型系统中的乳腺癌细胞增殖、定植和迁移。这是通过从股骨头手术标本中分离骨小梁组织碎片并与表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞一起培养来实现的。生物发光成像用于测量细胞增殖并验证乳腺癌细胞在骨组织碎片中的定植。

通过荧光显微镜对乳腺癌细胞定植模式进行成像。可以从片段中冲洗骨髓室，以便通过发光和染色测定通过流式细胞术进行分析。在Transwell迁移室中通过生物发光成像测量乳腺癌细胞向组织培养物、上清液和骨组织碎片的迁移骨是乳腺癌转移最常见的部位，最终该模型为研究骨转移生态位内的乳腺癌细胞提供了一个新窗口。

该模型的一大优点是它可以直接访问人体骨组织碎片的微环境，使我们能够在短期共培养实验中轻松观察和分析乳腺癌细胞的行为。该方法可用于研究有关乳腺癌、转移到骨骼的潜在机制的关键问题，目的是确定有效预防和治疗其作用的治疗策略。虽然该模型可以提供对乳腺癌转移的见解，但它也可以用于研究其他寻找骨骼的恶性肿瘤，例如前列腺癌。

必须在每次测定的不同时间点收获骨组织碎片。首先在盐水中收集和运输股骨标本，并戴上手术手套在生物安全柜中准备工作站。一只手握住股骨头，用手术生骨提取小梁骨。

碎片的大小约为 2 到 5 毫米。镊子不适用于此步骤。你需要一个高质量的手术生。

在本实验中，制备每 50 微升 DMEM 含 100， 000 个细胞加 10% FBS 的乳腺癌细胞悬液。此外，准备骨蜡塞，以便使用微量移液器吸头的截止端移动骨碎片，将塞子存放在培养皿中。然后用镊子将塞子转移到六孔板中，并使用无菌手套将塞子压入 12 点钟位置。

50 微升细胞悬液移液到每个细胞的中心。将板置于组织培养箱中 45 分钟以促进细胞粘附，同时板孵育提取骨碎片和附着在板上的细胞。将骨组织碎片放在三个孔中的骨蜡上，并使用 GER 三个无碎片服务器控件将每个孔压下。

接下来，在每个孔的壁上缓慢添加 5 毫升 DMEM 和 10% FBS。骨蜡和骨碎片不能脱落。然后将培养物孵育 20 至 24 小时。

第二天首先对细胞进行成像。向每个孔中加入每毫升 300 微克 Lucifer，然后立即使用 Ivis 成像平台对板进行成像。该实验需要与上一个实验一样的乳腺癌细胞悬液。

提取骨碎片后，使用镊子将每个碎片转移到 24 孔板的空孔中，然后将 50 微升细胞悬液直接移液到每个骨碎片上，并将板转移到培养箱中 45 分钟以促进细胞附着。细胞附着后，轻轻地向每个孔中加入 1 到 2 毫升培养基，足以浸没骨碎片。然后将板放入组织培养箱中 20 至 24 小时。

在准备 Ivis 成像、荧光成像或收集骨髓细胞以进行 Ivis 成像分析时，将骨碎片转移到 24 孔板中，每孔加入 1 毫升新鲜培养基。向每个孔中加入每毫升 300 微克荧光素，并按照前面描述的荧光显微镜进行作。将 5 微升荧光二磷酸盐标记溶液移液移液到每个孔中，以标记骨碎片的骨针，并将板再孵育 24 小时。

24 小时后，使用镊子将片段转移到含有不含酚红的培养基的平板上。然后使用配置为在 485 纳米处成像的荧光显微镜观察板，以定位定植、表达 GFP 的乳腺癌细胞和 680 纳米。为了识别二磷酸标记的骨针，以冲洗骨髓隔室以分析细胞数量或特性。

片段转移到 50 ml chronicle 管上的 70 微米过滤器中。然后使用带有 25 号针头的 10 毫升注射器用 10 毫升 PBS 离心机强烈冲洗碎片。将悬浮液在 300 G 室温下放置 3 分钟，以沉淀细胞，吸出并丢弃旋后麦芽。

根据流式细胞术或活力检测，在 PBS 或其他所需溶液中弯曲骨髓细胞沉淀。首先生成骨组织 snet。将骨头碎片放入 12 的孔中。

孔板每孔含有 2.2 毫升 DMEM 10% FBS，并留下一些没有骨碎片的对照孔。将平板培养 24 小时。然后吸出并更换培养基并继续培养 24 小时，48 小时后，将 0.9 毫升旋突转移到接收板中，同时暂时孵育接收板。

将 transwell 插入物放入空的 24 孔板中。然后将 100， 000 个 350 微升的乳腺癌细胞 iPet 到每个插入物上。然后将板培养 45 分钟以促进细胞粘附 45 分钟后，使用镊子将插入片段转移到接收板上。

将嵌件放入接收器时，请务必调整嵌件的角度。嗯，旋压，这样就不会形成气泡。然后第二天将带有插入片段的板在 37 摄氏度下孵育 20 小时。

使用镊子取出插入物，并在每个插入物中加入每毫升 300 微克的 Lucifer。Well 在接收板上进行生物发光成像，以检测已迁移穿过膜并附着在接收板孔底部的乳腺癌细胞。首先，在接收板上加载培养基并将其放入组织培养箱中。

为插入物设定种子。将它们倒置在带盖的空微型熔融管盒中。然后将 100， 000 个 50 μL 的细胞添加到每个插入膜的外底面。

盖上盒子，让盖子破裂，并在组织培养箱中孵育插入片段 45 分钟。然后使用镊子将插入物、接收板的孔倒置并转移到每个插入杯中，加入 0.45 毫升含 10% FBS 的 DMEM。然后向每个插入物中加入 3 毫米的骨片或玻璃珠，并在板上切割 20 小时。

第二天，使用镊子将片段和珠子转移到装有一毫升新鲜培养基的孔中。每孔添加每毫升 300 微克 Lucifer，然后进行生物发光成像。MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

乳腺癌细胞在固定的骨碎片附近共培养以测量乳腺细胞增殖。培养 24 小时后的生物发光成像显示，与底部 3 个孔中没有骨碎片相比，顶部 3 个孔中存在骨碎片时乳腺癌细胞增殖增强。使用来自三个独立手术标本的碎片的实验结果表明，与没有骨骼相比，存在骨骼的增殖增强。

在所有 3 例中，24 小时后通过生物发光成像观察到位于骨组织碎片正下方的 MCF 7 F Luke EGFP 细胞的定植。信号减弱与 48 小时后接种密度下降有关。用双膦酸盐试剂标记的直接接种片段显示 GFP 阳性乳腺癌细胞在矿化和骨髓隔室内定植。

乳腺癌细胞穿过多孔迁移膜向骨组织培养物迁移，与迁移到对照相比，在前三个孔中看到的上清液是稳健的。在底部三个孔中可见中等。还观察到从给定的 THR 标本迁移到三个骨碎片中，而未观察到迁移到珠子上。

观看此视频后，您应该对如何从股骨头标本中提取人骨组织碎片并将其用于共培养检测以测量乳腺癌细胞行为（包括迁移、定植和增殖）有很好的了解。