研究乳腺癌细胞定植转移微环境的人类股骨组织外植体培养方法

本实验的目的是在人骨组织外植体模型系统中研究乳腺癌细胞的增殖、定植和迁移。该目标通过分离股骨头手术标本中的骨小梁组织碎片，并将其与表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞共培养来实现。利用生物发光成像技术检测细胞增殖情况，并验证乳腺癌细胞在骨组织碎片中的定植。

通过荧光显微镜观察乳腺癌细胞定植的模式。可通过灌洗组织碎片获取骨髓成分，并利用流式细胞术、发光检测及染色分析进行检测。在Transwell迁移小室中测定乳腺癌细胞向组织培养物、上清液及骨组织碎片的迁移能力。生物发光成像显示，骨是乳腺癌转移最常见的部位。该模型最终为研究乳腺癌细胞在骨转移微环境中的行为提供了新的窗口。

该模型的一个显著优势在于，它能够直接接触人骨组织碎片的微环境，使我们能够在短期共培养实验中轻松观察和分析乳腺癌细胞的行为。该方法可用于研究乳腺癌向骨转移机制中的关键问题，旨在发现有效的治疗策略，以预防和治疗该疾病。尽管该模型可为乳腺癌转移提供深入见解，但它也可用于研究其他嗜骨性恶性肿瘤，例如前列腺癌。

在每次检测中的不同时间点必须采集骨组织碎片。首先，在生理盐水中收集并运输股骨样本，并在生物安全柜中穿戴外科手套准备工作站。用一只手握住股骨头，使用外科锯切取松质骨。

片段大小约为两到五毫米。此步骤中镊子无法使用，您需要一把高质量的外科刀片。

本实验中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基制备每50微升含100,000个乳腺癌细胞的细胞悬液。同时，使用剪断的微量移液器吸头末端制备骨蜡栓，将栓体置于培养皿中备用。然后用镊子将骨蜡栓转移至六孔板中，并借助无菌手套将其压入12点钟位置。

接下来，将50微升细胞悬液移液至每个孔的中央。将培养板放入组织培养孵育箱中孵育45分钟，以促进细胞贴壁。在培养板孵育的同时，将附着有细胞的骨碎片提取出来。将骨组织碎片置于三个孔中的骨蜡上，并使用GER轻轻按压使其固定；另设三个不含碎片的孔作为对照组。

接下来，沿每个孔的孔壁缓慢加入 5 毫升含 10% FBS 的 DMEM。骨蜡和骨碎片不得移位。然后将培养物在 20 至 24 小时内孵育。

第二天首先对细胞进行成像。向每孔加入 300 微克/毫升的 Lucifer，然后立即使用 Ivis 成像系统对培养板进行成像。本实验需要乳腺癌细胞悬液，其制备方法与之前相同。

取出骨碎片后，使用镊子将每一块骨碎片转移至24孔板的空孔中，然后用移液器将50微升细胞悬液直接加到每块骨碎片上，将培养板放入培养箱中孵育45分钟，以促进细胞贴附。待细胞贴壁后，轻柔地向每个孔中加入1至2毫升培养基，加至完全浸没骨碎片。随后将培养板置于组织培养箱中继续培养20至24小时。

为进行Ivis成像、荧光成像或收集骨髓细胞以进行Ivis成像分析，将骨碎片转移至24孔板中，每孔加入1毫升新鲜培养基。每孔加入300微克/毫升的Lucifer，并按照先前所述方法进行荧光显微镜操作。每孔加入5微升荧光双膦酸盐标记溶液，以标记骨碎片中的骨小梁结构，随后将培养板继续孵育24小时。

24小时后，使用镊子将组织碎片转移至含有酚红-free培养基的培养板中。然后使用荧光显微镜观察培养板，设置激发波长为485纳米，以定位表达GFP的定植乳腺癌细胞，以及680纳米波长，用于识别双膦酸盐标记的骨小梁。随后冲洗骨髓腔，以分析细胞数量或特性。

将组织碎片转移至置于50毫升离心管上的70微米细胞筛中。然后使用10毫升注射器配合25号针头，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）剧烈冲洗该碎片。将悬液在室温下以300 ×g离心3分钟，使细胞沉淀。吸除并弃去上清液。

根据流式细胞术或活率检测的要求，用 PBS 或其他所需溶液重悬骨髓细胞沉淀。首先制备骨组织匀浆，将骨组织碎片放入 12 孔板的孔中。

在每孔中加入含10%FBS的DMEM培养基2.2毫升，并留出部分对照孔不加入骨组织碎片。将培养板培养24小时。随后吸除培养基并更换新鲜培养基，继续培养24小时。培养48小时后，将0.9毫升上清液转移至接收板，同时对接收板进行暂时孵育。

将Transwell小室放入空的24孔板中。然后在每个小室中加入100,000个乳腺癌细胞，体积为350 µL。随后将培养板孵育45分钟，以促进细胞贴壁。45分钟后，使用镊子将小室转移至接收板中。

插入时务必倾斜插入物，使其进入接收器。充分旋后，以避免气泡形成。然后于次日将含插入物的培养板在37摄氏度下孵育20小时。

使用镊子取出插入物，并向每个孔中加入每毫升 300 微克的荧光素。随后对受体板进行生物发光成像，以检测已穿过膜并附着在受体板孔底部的乳腺癌细胞。首先，用培养基装载受体板，并将其放入组织培养箱中。

接种小室：将小室倒置放入一个带盖的空微量离心管盒中，然后向每个小室膜的外底表面加入50微升含100,000个细胞的悬液。

用盖子盖住盒子，留出缝隙，将插入物在组织培养孵箱中孵育45分钟。然后用镊子将插入物翻转，并将接收板的每个孔转移至插入杯中，每杯加入0.45毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基。随后向每个插入物中加入一个3毫米的骨碎片或玻璃珠，并继续培养20小时。

第二天，使用镊子将组织碎片和珠子转移至含有1毫升新鲜培养基的多孔板中。每孔加入300微克/毫升的Lucifer，随后进行生物发光成像。MDA MB 2 31 F.Luke EGFP。

将乳腺癌细胞与固定的骨碎片相邻共培养，以测量乳腺细胞的增殖情况。培养24小时后的生物发光成像显示，与底部三个孔中无骨碎片的情况相比，顶部三个孔中存在骨碎片时乳腺癌细胞增殖增强。利用三个独立手术标本获得的骨碎片进行的实验结果表明，在有骨碎片存在的情况下，乳腺癌细胞增殖显著增强。

在所有三种情况下，通过生物发光成像观察到，24小时后位于骨组织碎片正下方的MCF七F路克EGFP细胞已发生定植。48小时后，随着接种密度降低，信号减弱。使用双膦酸盐试剂直接标记的骨碎片显示，GFP阳性的乳腺癌细胞已定植于矿化组织及骨髓腔室中。

与对照组相比，乳腺癌细胞向骨组织培养物迁移穿过孔径迁移膜的现象在顶部三个孔中较为显著。底部三个孔中可见培养基。还观察到乳腺癌细胞向同一例全髋关节置换术（THR）标本获取的三个骨碎片迁移，但未观察到细胞向微珠迁移。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从股骨头标本中提取人类骨组织碎片，并将其用于共培养实验，以检测乳腺癌细胞的迁移、定植和增殖等行为。