Name: 建立一个人类多发性骨髓瘤异种移植模型中的鸡，研究肿瘤的生长，侵袭和血管生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 了解如何在鸡胚异种移植模型中研究人多发性骨髓瘤细胞的肿瘤生长、侵袭和血管生成。该方法利用GFP标记和三维培养技术，为抗癌药物的大规模筛选提供了有效的临床前研究平台。

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作者感谢 Cornelia Heis 女士在免疫组织化学及鸡胚制备方面提供的出色技术协助。本研究工作由奥地利科学基金（FWF 资助号：P19552）和欧洲联盟（欧盟第七框架计划项目 Optatio，编号：278570）资助。

根据奥地利法律以及美国公共卫生服务部实验室动物福利办公室的规定，鸟类胚胎在孵化之前不被视为活体脊椎动物。美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室已就此领域提供了书面指导（http://www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 和 NIH 出版物编号：06-4515）。
1. 细胞培养与慢病毒转染
<ol>
	<li>在37°C、5% CO2条件下，使用添加10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基培养骨髓来源的MM细胞系OPM-2、RPMI-8226及人间充质干细胞。</li>
	<li>使用30 µl脂质体转染试剂和10 ml转染培养基，将9 µg病毒包装混合DNA和3 µg pLenti6/V5 dest eGFP载体共转染5 × 106个HEK 293FT细胞。12小时后移除转染培养基，加入含10%胎牛血清和1%非必需氨基酸（NEAA）的10 ml DMEM培养基。</li>
	<li>5天后，收集HEK293FT细胞的上清液，通过离心去除悬浮细胞（1,000 × g，5分钟）。按文献所述方法28采用实时PCR测定病毒滴度。</li>
	<li>在24孔板中，使用含eGFP慢病毒颗粒（1 × 105个颗粒）的完全生长培养基转染1 × 106个MM细胞。3天后，向培养基中加入2 µg/ml杀稻瘟菌素开始筛选；若使用市售eGFP慢病毒，则使用500 µg/ml新霉素进行筛选。</li>
	<li>经过2周筛选后，可见表达eGFP的MM细胞克隆集落；通过离心（1,000 × g，5分钟）收集细胞，并扩增为用于实验的OPM-2eGFP和RPMI-8226eGFP亚系（第2和第3节）。</li>
</ol>
2. 3D-多发性骨髓瘤球体模型
<ol>
	<li>将 I 型胶原溶液和 10 倍浓度 DMEM 置于冰上冷却。</li>
	<li>将 1/10 体积的 10 倍浓度 DMEM 培养基加入胶原基质中；加入 NaOH（0.2 N）将酸性胶原溶液中和至 pH 7.4；将胶原/培养基混合液置于冰上保存。</li>
	<li>将转基因多发性骨髓瘤细胞系（OPM-2eGFP 或 RPMI-8226 eGFP；每球体 250,000 个细胞）与人源间充质细胞（每球体 50,000 个细胞，即 30 µl 液滴）混合。</li>
	<li>将细胞混合物在 15 ml 离心管中离心（1000 × g，5 分钟），加入预冷的胶原混合液（1 mL）至细胞沉淀中，并用 1000 µl 枪头充分混匀。</li>
	<li>立即用 100 µl 枪头吸取 30 µl 胶原/细胞混合液，滴加至 24 孔板中的无菌石蜡膜上，于 37°C 下静置 30 分钟使细胞/胶原混合物聚合（见 图 1A）。</li>
	<li>在多发性骨髓瘤球体上覆盖 1 mL 含 1、10 和 100 nM 硼替佐米的培养基（见 图 1B）。</li>
	<li>在 37°C 培养 72 小时后，通过荧光体视显微镜记录球体图像（见 图 1C）。</li>
	<li>使用宽平口镊子将每个球体转移至反应管中，用于检测 GFP 表达（见 图 1D）。</li>
</ol>
3. CAM 中的 3D 多发性骨髓瘤异种移植模型
<ol>
	<li>将鸡卵置于专用于禽类卵的孵化器中，在37°C、70%湿度条件下孵育三天。</li>
	<li>随后打开卵壳，将胚胎转移至经乙醇消毒的10 cm方形塑料称量皿中，皿内加细胞培养板盖以支撑，于体外（ex ovo）继续孵育六天，使绒毛尿囊膜（CAM）得以发育（见图2A）。</li>
	<li>将I型胶原蛋白溶液和10倍浓度DMEM置于冰上预冷，按体积比1:10将10倍浓度DMEM加入胶原基质中；加入NaOH（0.2 N）将酸性胶原溶液中和至pH 7.4；将胶原/培养基混合液保存在冰上。</li>
	<li>将转基因多发性骨髓瘤细胞系（OPM-2eGFP 或 RPMI-8226eGFP；每球状体250,000个细胞）与人源间充质细胞（50,000个细胞/球状体）混合。</li>
	<li>将细胞在15 mL离心管中离心（1,000 × g，5分钟；每种测试化合物使用1个样品管），向细胞沉淀中加入1 mL含药物（工作浓度按需设定）的预冷胶原混合液，并充分混匀（使用1,000 µL枪头）。</li>
	<li>在6孔板内的Parafilm膜上滴加胶原液滴（每滴30 µL），于37°C放置30分钟，使细胞外基质发生聚合。</li>
	<li>使用镊子将第3.6步制备的“onplants”转移至9日龄鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）未处理区域（距胚胎2 cm处，每个鸡胚放置4个onplants，见图2B）。</li>
	<li>在37°C、70%湿度的卵孵化器中进行5天体内（in vivo）生长后，通过荧光体视显微镜记录异种移植瘤的生长情况（见图2C）。将鸡胚置于冰箱4°C环境中低温处理5小时，实施安乐死。</li>
	<li>使用眼科剪刀和宽口平头镊子切除异种移植瘤及其下方的CAM组织。可用于绿色荧光蛋白（GFP）检测（第4节，见图2D），或用于血管和/或侵袭性肿瘤细胞的免疫组织化学分析（第5节）。</li>
</ol>
4. 通过 ELISA 定量检测 eGFP 蛋白
<ol>
	<li>将每个 MM 类球体或切除的异种移植组织转移至含有 200 µg/ml 蛋白酶抑制剂的 0.5 ml RIPA 缓冲液中。</li>
	<li>在冰上使用组织匀浆器对类球体/异种移植组织进行匀浆处理。</li>
	<li>在液氮和 37°C 水浴中进行三次冻融循环。</li>
	<li>将匀浆液在 4°C 下以 12,000 g 离心 20 分钟，并收集上清液保存。</li>
	<li>用 ELISA 试剂盒的检测缓冲液（200 µl）将样品按 1:20 稀释。根据生产商说明书，使用商品化的 GFP ELISA 试剂盒及生物素标记的抗 GFP 抗体测定 GFP 水平。</li>
</ol>
5. 血管及侵袭性肿瘤细胞的免疫组织化学分析
<ol>
	<li>将带有 CAM 区域的移植瘤组织在 4% 多聚甲醛中 4°C 过夜固定。</li>
	<li>将固定后的移植瘤组织放入包埋盒中，并转移至组织包埋机，依次经过梯度酒精系列（50%、70%、80%、95% 乙醇、二甲苯和石蜡；每步 60 分钟）。</li>
	<li>使用台式旋转式切片机对移植瘤组织进行切片（5 µm），将石蜡切片置于载玻片上，56°C 烘箱中过夜烘烤。</li>
	<li>通过递减梯度酒精系列将切片脱蜡至双蒸水（二甲苯、95%、80%、70%、50% 乙醇、双蒸水；每步 10 分钟）。</li>
	<li>在水浴中（95°C，20 分钟）使用抗原修复液（柠檬酸缓冲液；pH 7.0；体积 100 µl）进行抗原修复。</li>
	<li>用 100 µl 含 3% H2O2/甲醇溶液室温孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>在含 10% 胎牛血清的 PBS 中封闭切片 45 分钟（体积 100 µl）。</li>
	<li>室温下用含 1% 胎牛血清的 PBS 稀释的一抗（1 µg/ml）100 µl&#160;孵育 1 小时进行染色。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 3 次后，室温下用含 1% 胎牛血清的 PBS 稀释的生物素化二抗（0.1 µg/ml）100 µl 孵育 1 小时。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 3 次后，根据制造商说明书使用亲和素/生物素复合物（ABC）和二氨基联苯胺（DAB）底物溶液进行显色反应。</li>
	<li>将切片转移至双蒸水中终止反应，苏木素复染，然后用合成封片剂封片。</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争性财务利益

开发针对难治性多发性骨髓瘤（MM）的新治疗药物，需要耗时更短、成本更低的体内系统来评估人源MM细胞对药物的敏感性。迄今为止，可用于新型抗骨髓瘤疗法临床前评价的体内系统仍然有限，且均存在难以大规模筛选化合物文库的不足29.&#160; 
 
目前最理想的人源MM细胞模型为重度免疫缺陷小鼠7,13,30和火鸡胚胎29。SCID小鼠和禽类胚胎异种移植模型均可用于研究MM的生物学特性以及测试新型治疗化合物。然而，小鼠模型存在多种局限性，包括近交系基因型、技术操作复杂、观察周期长以及高成本。 
 
本研究提出了一种新型的三维（3D）类球体与禽类异种移植模型，用于研究人源MM细胞生物学，该模型包含人源间充质干细胞和细胞外基质作为支持性组分。MM细胞的存活与增殖高度依赖其特定的微环境，即基质来源的生长因子、细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的存在31-33。此外，当骨髓瘤细胞受到局部微环境的保护时，药物可能无效或活性发生改变31,34。 
 
与小鼠模型相比，本文所述的3D体外与体内...

多发性骨髓瘤（MM）的特征是骨髓中恶性浆细胞增殖、骨损害以及免疫缺陷1。尽管目前已有多项新的治疗手段，例如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）和免疫调节药物（泊马度胺和来那度胺），但MM仍是一种无法治愈的恶性肿瘤，预后极差2。不良预后可能归因于MM细胞克隆具有极高的异质性，这种异质性导致对治疗的反应各异，尤其是在长期治疗及MM克隆受到选择压力的情况下尤为明显3。
新药及其联合用药的临床前测试 体外 和 体内 是未来药物开发中一个关键且耗时的步骤。因此，有用的 体内 为了更好地理解多发性骨髓瘤（MM）的疾病生物学并推动新药研发，需要建立相应的MM模型。事实上，目前用于血液系统恶性肿瘤及其治疗研究的最佳异种移植模型是免疫缺陷小鼠，例如重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠。 4-7非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠 8,9 或 β-微球蛋白基因敲除的NOD/SCID小鼠 10,11.
尽管在某些方面，小鼠的人类多发性骨髓瘤（MM）模型可以模拟人类疾病的表型，但免疫缺陷小鼠为近交系，因此仅能模拟个体对药物的单一反应，且饲养成本非常高。由于需要免疫抑制，实验动物必须在特殊条件下维持培养，而将人类多发性骨髓瘤细胞移植到小鼠体内通常需要6周至2个月9,12；除非采用技术要求较高的直接骨髓移植方法，但该方法的动物存活率较低7,13。因此，目前已建立了若干新方法，包括基于干细胞的类器官模型14、组织工程技术15或复杂的三维细胞培养模型16。这些方法在不久的将来将与传统的动物实验在临床前药物筛选中形成竞争，但仍无法替代在活体生物中进行的系统性毒性测试。
鸡胚在孵化前缺乏适应性免疫反应，因此已被证实是进行人源细胞和组织异种移植的合适模型 organism 17-19此外，由于鸡群存在遗传多样性，每只鸡胚对所施加的药物或肿瘤细胞均表现出个体化的反应。绒毛尿囊膜（CAM）是研究肿瘤相关血管生成的成熟体系。 20-22当实体瘤被移植到绒毛尿囊膜（CAM）时，会表现出多种癌症的特征 体内，包括增殖、侵袭、血管生成和转移 23-27. 
基于我们研究团队在CAM异种移植模型方面的既往经验20,26,27，建立了一种人源多发性骨髓瘤模型，该模型结合了人源三维培养系统与模型的优势 体外 发育中的鸡胚。该多发性骨髓瘤模型系统可实现对多发性骨髓瘤生长进程的实时监测、细胞质量的定量分析以及临床前药物测试。

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226 细胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR 分型</td></tr><tr><td>OPM-2 细胞</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR 分型</td></tr><tr><td>人骨髓间充质干细胞&amp;nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT 细胞&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>转染培养基/Opti-MEM&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP 慢病毒颗粒</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>即用型病毒颗粒</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP 载体</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>由作者提供</td></tr><tr><td>ViralpowerTM 包装混合物&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂/Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素（Blasticidin）</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>新霉素（Neomycin）</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白&amp;nbsp; 大鼠尾来源</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 干粉</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsin</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼替佐米（bortezomib）</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF 级白壳鸡受精蛋</td><td>Charles River</td><td></td><td>受精&amp;nbsp; 白来航&amp;nbsp; 鸡蛋</td></tr><tr><td>塑料称量皿</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>用于离壳培养</td></tr><tr><td>方形培养皿（带盖）</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>用于离壳培养</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液（10×）</td><td>Cell Signaling</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini 无 EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA 试剂盒</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II 组织包埋盒</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol 透明剂</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 包埋蜡</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 显微镜载玻片</td><td>R. Langenbrinck&amp;nbsp;</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>实验室与医疗技术</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 洗涤缓冲液 10×</td><td>DakoCytomation</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原修复液（10×）&amp;nbsp; pH 6.1</td><td>DAKO</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人 ASMA 单克隆抗体，克隆号 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人 CD138 单克隆抗体，克隆号 MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体，克隆号 V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人结蛋白（Desmin）单克隆抗体，克隆号 D33</td><td>DAKO</td><td>&amp;nbsp;M0760</td><td></td></tr><tr><td>鼠抗人 Ki67&amp;nbsp; 单克隆抗体，克隆号 MIB-1&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&amp;nbsp;M7240</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗小鼠 IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 试剂盒</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB 显色试剂片剂套装</td><td>Sigma Biochemicals</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s 苏木精溶液</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt 封片剂</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>台式旋转切片机</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织包埋工作站</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>孵蛋器</td><td>Grumbach&amp;nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>配备数字相机（Olympus E410）和柔性冷光源的体视荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&amp;nbsp;</td><td>IKA T10</td><td></td><td>匀浆器</td></tr></tbody></table>

建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，目前仍无法治愈，亟需开发新型药物以改善患者的预后。由于缺乏骨髓微环境以及自身/旁分泌生长因子，人源多发性骨髓瘤细胞难以体外培养。因此，迫切需要建立合适的 体外 和 体内 用于研究新型治疗药物对人类多发性骨髓瘤细胞作用的培养系统。本文介绍了一种在复杂三维环境中培养人类多发性骨髓瘤细胞的模型 体外 和 体内人多发性骨髓瘤细胞系 OPM-2 和 RPMI-8226 被转染以表达外源基因 GFP，并在人源间充质细胞和 I 型胶原基质存在条件下培养，形成三维球状体。此外，将球状体移植至鸡胚尿囊膜（CAM）上，通过体视荧光显微镜监测肿瘤生长。这两种模型均能在复杂的三维环境中用于研究新型治疗药物，并可通过将移植物匀浆后进行 GFP 特异性 ELISA 检测，定量肿瘤细胞质量。同时，可每日利用体视显微镜观察宿主的血管生成反应及肿瘤细胞向下方宿主组织的侵袭情况，并通过免疫组织化学染色分析人源肿瘤细胞（Ki-67、CD138、波形蛋白）或覆盖血管的宿主壁细胞（desmin/ASMA）的表达。
综上所述，onplant 系统能够在复杂的三维环境中研究多发性骨髓瘤（MM）细胞的生长和血管生成，并可用于筛选靶向 MM 细胞存活与增殖的新型治疗化合物。

体外三维多发性骨髓瘤球体实验中靶向化合物的分析
由于原代人多发性骨髓瘤细胞培养的局限性 体外 我们建立了新的3D 体外 利用骨髓来源的原代人类间充质细胞和细胞外生长基质培养人类多发性骨髓瘤细胞系的培养模型图1A，B）。EGFP转基因多发性骨髓瘤（MM）细胞系可在三维球状体生长后实现MM肿瘤团块的可视化与定量分析。两种MM细胞系OPM-2eGFP 和RPMI-8226eGFP 在含有不同浓度（1–100 nM）硼替佐米的条件下培养3天，然后通过体视荧光显微镜观察GFP表达以可视化肿瘤图1C）。在将类球体均质化后，通过eGFP-ELISA检测eGFP含量，定量肿瘤细胞量。图1D).
体内分析鸡胚中多发...

人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，目前仍无法治愈，需要开发新型药物以改善患者的预后。由于……

以下实验的总体目标是建立一种体内鸡胚模型，该模型移植了人源骨髓瘤细胞和间充质细胞，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。该目标通过构建转基因人多发性骨髓瘤细胞来实现，以便在三维体外和体内模型中进行分析。这些细胞通过慢病毒转染，携带GFP以实现可视化，并携带嘌呤霉素抗性基因以筛选转染成功的细胞。第二步是构建三维类器官。通过转染的细胞可生成间充质细胞和细胞外基质，从而能够在复杂的三维体外环境中进行大规模抗癌药物筛选。接下来是构建三维肿瘤模型。可通过鸡胚体内培养PHE，以检测新药对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。最终可在动物安乐死后及实验期间每日记录肿瘤大小和血管生成反应。肿瘤可通过GFP、ELISA和免疫组织化学方法进行检测。与现有的异种移植模型等方法相比，该技术的主要优势在于能够更有效地处理和成像人类肿瘤。支持性的人类基质细胞及细胞外基质成分可与人类肿瘤细胞共同在体内生长，并可在仍缺乏适应性免疫应答的鸡胚中进行培养。该方法有助于开发新型疗法，并可实现对多发性骨髓瘤患者治疗方案的快速临床前筛选。该方法的可视化演示至关重要，因为人多发性骨髓瘤细胞在应激条件下容易发生凋亡，而鸡胚在操作不当或体外培养条件不适宜时也可能死亡。本实验操作及其所有关键步骤将由本实验室经验丰富的技术人员 Cornelia Hes 演示。在本方案中，准备多发性骨髓瘤细胞系 OPM-2、RPMI 8226 以及来源于骨髓的人间充质干细胞的培养物，在补充培养基中按照既定方案常规培养细胞，随后用 100,000 个慢病毒颗粒转染一百万个多发性骨髓瘤细胞。在含有完全培养基的24孔板中培养三天后，通过在每毫升培养基中加入两微克嘌呤霉素开始筛选转染细胞；对于商品化的EGFP慢病毒，可在筛选两周后，每毫升培养基中加入500微克新霉素。观察表达EGFP的细胞簇。小心地将漂浮或贴壁的细胞簇重悬，收集至离心管中，以1000 × g离心五分钟，沉淀D-E-G-F-P细胞，并将其作为亚克隆进行扩增培养。在筛选并扩增表达GFP的多发性骨髓瘤细胞后，每次用于后续实验前均需检测其表达能力。首先将一些I型胶原溶液和10倍浓度的D-MEM培养基置于冰上冷却。待冷却后，将1/10体积的10×D-MEM培养基加入胶原溶液中。然后逐滴加入0.2 N氢氧化钠，将溶液中和至pH 7.4。将溶液置于冰上，并用试纸确认pH值。接下来，将转基因多发性骨髓瘤细胞系与人源间充质细胞混合。现在将细胞混合物分装至15毫升离心管中，在1000 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液，然后使用P1000移液器将沉淀重悬于1毫升冰冷的胶原混合液中。使用 P 100 吸头立即将 30 微升（µL）该混合物等分转移至无菌石蜡上。在 24 孔培养板中，于 37 摄氏度（°C）孵育 30 分钟，使混合物聚合，从而形成类固醇。随后，向类固醇上层加入 1 毫升（mL）含有不同处理条件的预配培养基。例如，可将药物以不同浓度进行处理。在37摄氏度孵育72小时后，通过荧光体视显微镜记录PHE。然后使用宽平口镊子将每块类固醇转移至反应管中，以检测GFP表达水平。在进行此操作前，将鸡胚蛋置于37摄氏度、70%湿度的蛋孵箱中孵育三天。随后打开蛋壳，将胚胎转移至无菌的10厘米正方形塑料称量皿中，并加入细胞培养血小板，以提高鸡胚在体外培养中的存活率。为获得更高的存活率，请使用塑料称量皿而非10厘米组织培养皿。此外，使用前需对 PBS 长效孵育舟进行灭菌和预处理。继续将鸡蛋进行离体培养六天，期间绒毛尿囊膜（CAM）将发育形成。现在按照先前的步骤在六孔板中制备多发性骨髓瘤细胞和间充质细胞 PHE，然后用镊子将类固醇转移至 CAM 未处理的表面，位置距离九日龄鸡胚胚胎约两厘米处。将四个植块置于每个鸡胚上。将带有植块的鸡胚在体外培养条件下于孵卵器中继续培养五天。随后通过荧光体视显微镜记录异种移植情况。记录后，使用眼科剪刀和镊子切除异种移植瘤及部分邻近的正常组织。为检测GFP表达或进行免疫组织化学分析，首先将每份多发性骨髓瘤类固醇样本或切除的异种移植瘤组织转移至含有蛋白酶抑制剂的0.5毫升RIPA裂解液中。然后在冰上使用匀浆器对组织进行匀浆处理，匀浆完成后，使用液氮冻融一次，再置于37°C水浴中解冻。重复此操作三次，然后在 4 摄氏度、12,000 G 条件下离心匀浆液 20 分钟，并收集上清液。接着，用 ELISA 试剂盒的检测缓冲液将部分上清液按 1:20 的比例稀释。随后使用试剂盒中的生物素标记的抗 GFP 抗体检测 GFP 水平。首先将切除的异种移植组织在多聚甲醛中过夜固定。次日对固定后的异种移植组织进行脱水并包埋。第一步，将组织装入包埋盒中。然后将包埋盒依次通过梯度酒精系列进行处理。每一步浸泡持续一小时，最后以石蜡包埋结束该过程。接下来，使用台式旋转切片机切出五微米厚的异种移植组织切片，并将收集到的石蜡切片置于载玻片上，在56摄氏度下烘烤过夜。第二天，使用梯度递减的酒精系列将切片脱蜡至双蒸水中。每个处理步骤中，载玻片在每种溶液中浸泡时间均为10分钟。随后按照文本方案，依次与相应的一抗和二抗孵育，并在抗体染色后利用酶与底物进行比色检测，接着用苏木精复染，最后使用合成封片剂封片。两种表达EGFP的多发性骨髓瘤细胞系在含有药物的培养基中培养三天。随后通过体视荧光显微镜观察硼替佐米处理的肿瘤细胞和类固醇对GFP表达的影响。药物处理后，通过将PHE匀浆并采用GFP ELISA法测定EGFP含量，对肿瘤细胞数量进行定量。在另一项实验中，将三天龄的鸡胚胎在体外培养六天。在第九天时，将多发性骨髓瘤细胞的PHE移植到鸡胚胎上。每个胚胎上接合了四个植株。在五天后，于其中一个摩尔浓度下局部施用靶向物质硼替佐米，与对照组相比，植株上形成了肿瘤。通过荧光肿瘤团块的可视化观察，表明硼替佐米抑制了移植体中多发性骨髓瘤细胞的生长。分别从三只不同的动物中切除单个移植物，进行匀浆处理，随后通过GFP ELISA进行检测。与对照组相比，经硼替佐米处理的组织中骨髓瘤细胞质量显著减少。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用体外培养的鸡胚开展实验，以研究目标癌细胞的肿瘤生长、发生及其向宿主组织的侵袭过程。该技术为多发性骨髓瘤领域的研究人员探索新型化合物或药物提供了一条途径，使其能够在易于操作的模式生物中进行临床前药物测试所必需的研究。

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