一个 体外 骨髓中雌激素敏感性乳腺癌的休眠模型：分子机制研究与假设生成的工具

以下实验的总体目标是应用该体外休眠模型来研究分子和细胞机制，并为在更复杂的生物学体内模型中进行验证生成假设。该目标通过在纤维蛋白颈编码的组织培养板中，以同源密度培养雌激素受体阳性乳腺癌细胞来实现，此时细胞主要与基质相互作用，而非彼此之间相互作用。第二步，通过成纤维细胞生长因子2（FGF2）和纤维连接蛋白维持和支持部分雌激素受体阳性细胞进入休眠状态，模拟乳腺癌细胞在骨髓中的休眠情况。

接下来，通过添加抗体、抑制剂、多肽或核酸来扰动系统，以破坏休眠细胞的各种表型和分子特征，并确定这些因素在维持休眠状态中的作用。结果显示了在纤连蛋白包被的培养板上，经 FGF2 处理孵育细胞后，生长和休眠克隆的数量及形态特征。该方法有助于解答哪些信号通路、黏附分子或其他特定的分子机制负责骨髓微环境中雌激素依赖性乳腺癌细胞休眠状态的建立与维持。

首先，从培养皿中吸出培养基，这些培养皿中的 CF7 细胞系和 RIN 细胞融合度约为 50%，并用预热的 PBS 洗涤细胞。然后加入 1 毫升溶于高糖 DMEM 培养基（不含胎牛血清）中的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养皿在 37°C 条件下孵育 1 至 4 分钟，直至细胞开始脱落。

当细胞从培养板上脱落并开始形成单细胞悬液时，用2毫升移液器反复吹打数次，以分散残留的细胞团块。若在胰蛋白酶消化4分钟后仍有细胞团块存在，则弃去该细胞悬液，重新制备新的培养细胞；因为消化4分钟后仍相互黏附的细胞在计数克隆数目时可能引入误差。将胰蛋白酶消化后的细胞进行传代，并以每毫升1,500个细胞的密度重悬于培养基中。使用5毫升移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，然后用全自动细胞计数仪进行细胞计数，并确认细胞悬液主要由单细胞组成。

也可在相差显微镜下使用计数板手动完成。然后吸取3毫升细胞悬液，每次向24孔纤维连接蛋白包被板中的两个孔各加入1毫升细胞悬液。为优化细胞的空间分布，务必将悬液滴加至孔的中央，并在细胞沉降并贴壁前避免对培养板进行任何移动。

将剩余的细胞悬液重新返回至主细胞混合液中，再次混匀细胞，然后吸取另外3毫升。该操作可减少细胞数量的差异，因为细胞在管中会持续沉降，而移液操作需快速分配大量细胞悬液。若让细胞在室温及CO2浓度下静置，将影响其同源潜能，因此需在37摄氏度、5%CO2条件下培养细胞。此步骤记为第负一天。

在实验时间线上，测定的第零天，将培养基更换为一毫升新鲜培养基，或含有10纳克/毫升成纤维细胞生长因子的鲜培养基。六天后，孔中细胞数量较少，不会显著影响原始培养基中的营养成分、细胞因子组成或pH值。

第三天，在已含有1毫升培养基的孔中加入100微升含有终浓度10倍的干扰剂溶液，例如PI3激酶抑制剂LY294002、阴性对照LY303511或培养基对照，通过扩散使溶液自然混匀。将培养板放回培养箱继续培养三天。第六天，将0.1%结晶紫溶解于含2%乙醇和10毫摩尔硼酸钠的溶液中。

在 pH 为 9 时，吸出各孔中的培养基，每孔加入 1 毫升结晶紫溶液，孵育 20 分钟。设置清洗站：将冰桶置于水槽中，并持续向桶内注水；将培养板浸入水中进行洗涤，使孔口朝下并与水面呈锐角插入桶中。待培养板完全浸入水下后，将其倾斜至水平角度，使孔口垂直向下。

然后将培养板倾斜至锐角，以轻柔流畅的动作一次性取出。重复浸洗两到三次，直至孔底部的液体不再呈现蓝色为止。随后将培养板倒置放置于实验台的纸巾上，静置过夜晾干。

干燥后，将培养板置于倒置相差显微镜下，计数每个孔中生长和休眠的菌落数量。在40倍放大倍数下，将含有超过30个细胞的菌落计为生长菌落，将含有12个或更少细胞的菌落计为休眠菌落。图中显示了典型的生长菌落和休眠菌落的形态。

生长中的克隆包含超过30个细胞，而静息状态的克隆包含12个或更少的细胞，这些细胞体积显著大于生长中的细胞，且具有较大的细胞质与细胞核比例，且未向培养体系中添加FGF2。克隆群体主要由生长型克隆构成。而在存在FGF2的情况下，绝大多数克隆处于静息状态，该体系还可用于评估其他添加因子的作用。在此实验中，两种干扰因子以先前确定的浓度于同基因型检测的第3天加入孔中。

该图显示，PI3激酶抑制剂LY294002可优先抑制休眠克隆，而阴性对照LY303511则无此效应。这些实验可用于帮助理解调控休眠状态及治疗耐药性的关键因素。在此，经PI3激酶抑制剂处理后存活的休眠细胞失去了原有的铺展形态，变得细小、呈树突状，并表现出应激状态。

观看本视频后，您应充分了解如何建立这种同类系检测方法以培养休眠细胞，如何在建立休眠状态后通过添加特定抑制剂或干扰因子对细胞进行干预，以及如何量化这些干扰因子的作用效果。该检测方法既可用于定量评估，也可用于定性分析，可通过计数休眠克隆，或检测休眠及受干扰细胞中多种超微结构、免疫表型或分子事件来实现。感谢观看，祝您的实验顺利成功。