重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

以下实验的总体目标是通过同时测量梗死体积和血脑屏障完整性，来量化重复性低氧预处理（RHP）后的神经保护作用。该目标通过使小鼠经历九次在持续时间和强度上均具有随机变化的低氧暴露来实现，从而为小鼠提供脑血管对中风的保护作用。随后在小鼠体内诱导中风，并注射伊文思蓝进行检测。

伊文思蓝可选择性结合白蛋白，从而在动物注射后处死时用于量化血脑屏障的破坏程度。取出脑组织后，用TTC染色以定量梗死体积。结果表明，重复性缺氧预处理对缺血性脑卒中后的小鼠具有神经保护作用。

与现有的单次暴露缺氧预处理等方法相比，该技术的主要优势在于，重复性缺氧预处理（RHP）可在小鼠中产生至少八周的神经保护作用。这种双重定量方法能够回答脑卒中研究中的关键问题，例如如何同时测量血脑屏障破坏情况下的梗死体积。尽管该方法可用于研究缺血性脑卒中，RHP 还可应用于其他中枢神经系统相关及全身性促炎性疾病状态。首先，将小鼠分为两组。

接受8%和11%氧气暴露的RHP组以及同时接受21%氧气暴露的对照组，需取下每个笼子的顶部滤膜盖，将带有完整食物和水瓶的笼子放入与其相应氧气罐连接的暴露舱内。关闭并固定暴露舱的盖子。打开氧气罐的主气体阀门，并将每个诱导舱的初始气体流速设定为每分钟2升（LPM）。

暴露5分钟后，将流速降低至1 LPM，并在剩余的暴露时间内保持该流速。暴露结束时，将流速降至0 LPM并关闭气体阀门。针对气罐的操作。

打开舱盖，并更换每个笼子的滤膜顶盖。将笼子放回标准饲养环境中，直至下一次缺氧暴露。每次使用后，用消毒剂和除臭剂喷洒每个诱导舱。

在实验方案的两周时间内，于每天同一时间同时暴露RHP小鼠和对照小鼠。随后按照文中所述方法进行短暂性大脑中动脉闭塞（A-T-M-C-A-O）。伊文思蓝（EB）注射应在再灌注后22小时进行，并在处死动物进行NTTC染色前在血液中循环2小时。

准备注射所需的EB用量。然后用0.3 cc胰岛素注射器吸取所需体积的室温液体。使用29号针头，将小鼠置于平底固定器中进行固定。

握住小鼠尾巴，使侧静脉位于最上方。侧静脉位于尾巴中线的两侧。固定尾巴尖端，以保持小鼠在注射过程中的稳定。

将针头插入静脉约三到五毫米。注意避免穿破静脉，在一分钟内将所有染料完全注入。若溶液进入静脉，推动注射器时应感受到极小的阻力。

通过观察小鼠尾部肢体和眼睛立即出现的颜色变化，确认伊文思蓝（EB）已成功进行系统性静脉注射。拔出针头，并用干净的纱布轻轻按压尾部以止血。开始计时。

当小鼠皮肤变为蓝色后，让伊文思蓝（EB）循环两小时，以穿透受损的血脑屏障。在T-M-C-A-O术后24小时、EB给药后2小时，通过小型诱导室中过量异氟烷麻醉处死动物，随后在再灌注24小时时进行灌注及TTC染色。处死后应立即开始灌注，以尽量减少自溶作用，因为死亡后缺氧会立即引发自溶。

将动物迅速固定在泡沫塑料平台上，前肢通过脚掌固定。从肋骨下方中线处开始，沿侧向切开腹壁。小心切开膈肌以暴露心脏。

使用一个装有冰冻的0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）的60毫升注射器，连接27号带翼输液针，以每分钟5毫升的流速启动灌注泵。将针尖插入心脏左心室约0.5厘米深处，并剪开右心房。灌注过程中，应有逐渐稀释的静脉血从心房流出，直至流出液变为无色。随后，通过心脏灌注30毫升0.01摩尔的PBS，实现无色透明的心脏灌注。

接下来，将五毫升TTC溶液加入透明的20个闪烁瓶中。灌注结束后立即处死动物，并在必要时使用小剪刀和刮匙取出脑组织。检查对侧大脑半球（即对侧大脑中动脉供血区）是否呈现苍白，且无明显伊文思蓝渗漏或水肿现象。

将 PBS 缓慢加入专为小鼠脑组织制备 1.0 毫米厚冠状切片而设计的丙烯酸脑切片模具中。将脑组织背侧朝上放入模具内，并立即在脑组织上倒入 PBS，保持脑组织湿润。

通过将不锈钢刀片（厚度为0.21毫米）从矩阵前端侧的第二个槽插入，以去除嗅球。然后从矩阵尾端侧的第四个槽插入刀片，以去除小脑。将刀片插入矩阵中剩余槽位的中间槽内。

然后将剩余的刀片均匀插入，以均分剩余组织，确保切片过程中组织分布最为均匀。所有刀片插入后，在脑组织上滴加一至两滴 PBS 液体以使其湿润。接下来，从吻侧区域开始，依次逐个移除矩阵中的刀片。

保留前七片用于TTC分析。在T-M-C-A-O之后，使用小刮铲小心地将切片从刀片转移到装有TTC的试管中。当所有切片都放入试管后，盖上盖子，并将其置于温水浴中，直至切片变为粉红色。

如有必要，轻轻转动瓶子以避免切片重叠，否则可能导致染色不均。然后弃去TTC溶液，并向小瓶中加入4%多聚甲醛溶液以覆盖脑切片，从而终止TTC化学反应。

立即将切片放置在干净的1英寸×3英寸玻璃载玻片上，并将切片按从头端到尾端的方向排列整齐。扫描载玻片。使用标准扫描仪，将分辨率设置为至少600 DPI，以进行图像分析。

扫描图像时务必包含动物名称和公制标尺。最后，翻转载玻片并扫描背面，以确保收集到所有数据。与对照组小鼠相比，RHP 使梗死体积减少了 46%，但对同一动物 TTC 数据所计算的半球肿胀无影响。

RHP 可减轻血脑屏障的破坏，该效应通过伊文思蓝渗漏量来评估，并将其标准化至对侧半脑。图中显示了经 RHP 处理和暴露于 21% 氧气的对照组具有代表性的 TTC 染色结果。每份样本下方列出了相应的小鼠脑梗死体积和伊文思蓝渗漏量。同侧指脑的缺血半球，对侧指脑的非受累半球。

在进行该操作时，重要的是要记住在融合后22小时注射伊文思蓝，并在动物处死前让其循环2小时。该技术为临床前卒中研究领域的研究人员探索小鼠卒中内源性保护机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够清楚地理解如何通过双重定量血脑屏障完整性和梗死体积来评估RHP的神经保护作用。