Name: 神经血管保护定量继在小鼠重复缺氧预处理和瞬态大脑中动脉闭塞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 了解重复缺氧预处理对小鼠脑缺血性卒中的神经保护作用，通过伊文思蓝染色和TTC染色同时定量测量血脑屏障完整性和梗死体积。该方法为卒中研究提供双重定量评估手段。

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特别感谢Gidday实验室在开发RHP方案方面所做的工作，以及德克萨斯大学西南医学中心神经模型设施（UTSW）在tMCAo手术中提供的帮助。本研究得到了美国心脏协会（AMS）、德克萨斯大学西南医学中心脑损伤与修复哈格蒂中心（UTSW；AMS）以及国际基瓦尼斯组织伊利诺伊—东爱荷华地区痉挛性麻痹研究基金会（JMG）的资助。

注意：本方案已获德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物使用的政策。
1. 重复性缺氧预处理
<ol>
	<li>在气体调节器上定制设计四个流量计，并使用聚氯乙烯管将其连接至标准的15 L诱导室，以允许来自氧气（O₂）的压缩气体2）储液罐中的液体通过入口端口流入腔室。有关定制设计的更多细节，请参见“设备与材料”部分。</li>
	<li>将小鼠分为2组：重复性低氧预处理（RHP）组，接受8%和11% O₂交替暴露；对照组，不进行低氧暴露。2，以及对照组，接受21% O₂暴露2 （室温空气）同时进行。参见 表1 对于频率以及强度（8% 和 11% O₂）的变化，2 或 21% O₂2），以及RHP处理的持续时间（2或4小时）。</li>
	<li>移除每个笼子的顶部滤网盖，将笼子连同完整的食物和水瓶一起放入与其对应的 O 连接的腔室中2 储液罐。关闭并固定好腔室的盖子。
	<ol>
		<li>打开气罐的主阀门，将每个诱导室的初始气体流量设为2升/分钟（LPM），持续暴露前5分钟；随后将流量调低至1 LPM，维持此流速完成后续暴露过程。</li>
		<li>暴露结束后，将流量降至 0 LPM 并关闭气罐的气体阀门。</li>
		<li>打开舱盖，更换每只笼子的滤膜上盖。将笼子放回标准饲养环境中，直至下一次低氧暴露。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次使用后，用NPD（Steris）或同等效力的消毒剂/除臭剂喷洒每个诱导室。</li>
	<li>在两周内，于每天同一时间，同时暴露21%组和RHP组小鼠，具体操作如前所述。 表1.</li>
</ol>
2. 短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）
<ol>
	<li>有关末次RHP暴露后卒中发生时间的更多细节，请参见讨论部分。</li>
	<li>准备无菌手术工作区。使用70%乙醇或等效消毒剂清洁周围工作区域，并对所有手术器械进行高压灭菌。
	<ol>
		<li>设置激光多普勒血流仪（LDF）以测量脑血流量（CBF）的相对变化。将加热垫调至37 °C。将培养箱调至34 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用4%异氟烷/70%一氧化二氮混合气体短暂暴露以麻醉小鼠230% O2 在小型诱导室中进行麻醉。通过轻捏小鼠足爪确认麻醉效果。若小鼠出现缩足反应，应将小鼠放回诱导室并继续异氟烷暴露。</li>
	<li>将小鼠从麻醉诱导室中取出，迅速将小鼠的鼻子插入鼻罩中。打开通往鼻罩的气体流量，同时关闭通往麻醉诱导室的气流。
	<ol>
		<li>不改变70% NO230% O2 气体混合物，以1.8%异氟烷作为维持剂量用于后续操作。整个过程中呼吸应保持缓慢而规律；若呼吸变得急促且浅表，应增加异氟烷剂量。维持剂量可能因实验所用设备制造商及动物个体差异而有所不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微型剃刀剃除眼外角至耳部之间的颞区以及颈部腹侧中线的毛发。清除多余毛发后，用无菌棉签涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。用酒精棉片擦拭切口区域，再用无菌棉签涂抹聚维酮碘，以维持无菌条件。</li>
	<li>根据啮齿类动物手术指南给予镇痛剂。</li>
	<li>在眼与耳之间的颞部皮肤上做一切口，暴露颞肌。使用外科显微剪，在白色肌纤维条纹区域内的颞嵴处剪断颞肌韧带。
	<ol>
		<li>用镊子轻轻将肌肉组织向外侧推开，透过颅骨观察大脑中动脉（MCA）。切开颞肌后，该区域可能会出血，可用棉签轻轻擦拭以止住潜在出血。</li>
		<li>将LDF探头尖端对准MCA区域。记录所选择的血管，因为该区域在不同小鼠之间存在差异。</li>
		<li>固定激光多普勒探头位置，并用生理盐水冲洗颅骨表面，直至读数显示稳定的红细胞流量，将该值记录为基线脑血流量（CBF）。理想的基线脑血流量在激光多普勒血流仪上的读数为 &#62;600 流量，但具体数值可能因制造商而异。如果基础 CBF 为 &#60;400 流量时，记录到的血流信号很可能来自邻近静脉，或探头未完全对准目标血管所致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在建立基线 CBF 后，重新调整小鼠体位以暴露颈部。固定其头部，并通过鼻罩持续维持麻醉状态。</li>
	<li>从下颌下方沿腹侧正中线切至锁骨。
	<ol>
		<li>用镊子钝性分离所有浅筋膜，暴露左侧颈总动脉（CCA）。将 CCA 与结缔组织和迷走神经分离。</li>
		<li>用6.0丝线永久结扎CCA。结扎线应尽可能靠近近端，以留出足够空间用于放置阻塞丝线。</li>
		<li>在颈总动脉（CCA）上，于阻断缝线的远端用另一根6.0丝线绕圈并松松打结。注意勿压迫阻断血管，因后续将通过颈动脉插入阻断尼龙线。</li>
		<li>使用一个 8 x 2 mm 的微型光面动脉夹，在颈总动脉（CCA）上结扎丝线的远端夹闭血管。用镊子轻轻提起颈总动脉，用 3 mm 眼科剪在尽可能靠近结扎线的近端位置做一小纵向切口。</li>
		<li>将一根12 mm长、硅胶包被的6.0规格尼龙阻断丝线经切口插入动脉管腔，随后推进数毫米。用第二根松绕的丝线在阻断丝线末端处轻轻结扎，以防止血流将丝线推出颈总动脉，随后移除动脉夹。</li>
		<li>在颈总动脉（CCA）分叉为颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）的第一个分叉处，将阻塞丝经右侧分支插入，进入颈内动脉（ICA）。将阻塞丝向前推进9至10.5 mm，越过第二道丝线结扎处，进入左侧颈内动脉（ICA）。</li>
		<li>进入颈内动脉（ICA）后不久，将阻塞丝推进至ICA与翼腭动脉（PPA）之间的第二分叉处的左支。由于PPA通常难以观察，操作时可继续推进阻塞丝直至感受到轻微阻力，表明阻塞丝已完全到位。使用镊子轻轻提起ICA可能有助于阻塞丝更顺利地进入第二分叉的左支。随后收紧第二根丝线结。</li>
		<li>将小鼠调整至大脑中动脉（MCA）上方切口可见的位置。使用激光多普勒血流仪（LDF）设备，通过LDF读数确认脑血流（CBF）已被阻断。成功的阻塞表现为 &#62;基线 CBF 下降 80%。</li>
		<li>当达到理想位置后，用第二根丝线将阻塞丝线完全扎紧并打双结。如有必要，可轻微推进或拉出阻塞丝线，以达到成功阻塞所需的脑血流（CBF）标准例如 &#62;基线 CBF 下降 80%）。</li>
		<li>用6.0尼龙缝线闭合颈部和头部切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠置于34 °C培养箱中，持续进行缺血处理。推荐的缺血时长为60分钟，但根据年龄及品系相关的脑血管解剖学差异，该时间可有所调整。25 以及所需损伤程度（轻度、中度、重度）。确保动物在停止麻醉后几分钟内恢复意识。</li>
	<li>用异氟烷重新麻醉动物，操作步骤如2.3所述，在预定的闭塞期结束前5分钟打开头皮切口，并通过经颅激光多普勒血流仪（LDF）检测确认大脑中动脉（MCA）灌注仍处于降低状态。如果脑血流量（CBF）未充分降低（例如 &#60;如果脑血流量（CBF）恢复到基线水平的20%以上，则表明大脑中动脉（MCA）在阻塞期间已有再灌注，该小鼠应被排除在后续实验之外。</li>
	<li>打开颈部正中切口，在第二根丝线缝合位置远端、颈总动脉（CCA）分叉近端处，用第三根丝线 loosely 结扎 CCA，以确保在撤出线栓后，颈外动脉（ECA）仍保持通畅。
	<ol>
		<li>剪断或解开固定阻塞丝的结（即， 用第二根丝线结扎后，缓慢撤出阻塞丝线。一旦撤出，迅速用第三根丝线结扎颈总动脉（CCA）以尽量减少颈内动脉（ICA）的血液反流。将此丝线打双结，并用6.0尼龙线缝合切口。</li>
		<li>将小鼠重新定位，以量化再灌注5分钟后CBF水平。成功的再灌注通常定义为CBF达到 &#62;基线CBF的50%，但与阻塞血流情况相同，研究者可自行设定判定标准。若动物的CBF低于其基线值的50%，则提示大脑中动脉（MCA）可能已“永久性”阻塞，此亦可作为另一项研究排除标准。</li>
		<li>用6.0尼龙缝线关闭两处切口。根据啮齿类动物实验指南给予生理盐水、麻醉剂（利多卡因）和抗生素。然而，有研究发现，卒中后给予小剂量抗生素（米诺环素3 mg/kg）具有神经保护作用。26</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术后小鼠在加温培养箱中恢复意识后，将其转移至清洁无菌的笼具中。提供湿润食物或营养补水凝胶饲料补充剂，并放置一个培养皿盛水，因为小鼠在脑卒中后活动能力受限。&#160;密切监测动物术后恢复情况，注意是否存在过度疼痛及死亡。</li>
</ol>
3. 伊文思蓝（EB）注射
<ol>
	<li>在再灌注后22小时注射伊文思蓝（EB），并在处死小鼠及进行TTC染色前使其在血液中循环2小时。</li>
	<li>配制用于注射的伊文思蓝溶液（2% EB生理盐水溶液），室温下轻轻混匀。通过滤纸过滤或使用连接小注射器的0.2 µm滤器过滤溶液，以去除未溶解的EB颗粒，室温保存。</li>
	<li>准备所需剂量的EB溶液用于注射（剂量为4 ml/kg体重）。用29号针头的0.3 cc胰岛素注射器吸取所需量的染料，并确保溶液处于室温。
	<ol>
		<li>使用平底固定器固定小鼠，握住尾巴使侧静脉位于上方。侧静脉位于尾巴中线两侧。固定尾尖以保持小鼠稳定，便于注射。</li>
		<li>将针头插入静脉约3.5 mm，注意避免刺穿静脉。回抽注射器观察是否有血液回流，以确认针头位于静脉内。</li>
		<li>在1分钟内缓慢注射全部染料。若针头在静脉内，推动注射器时阻力应极小。若小鼠尾巴、四肢和眼睛迅速出现颜色变化，则表明EB已成功进入体循环静脉系统。</li>
		<li>拔出针头后，用干净纱布轻压穿刺部位以止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当小鼠皮肤变为蓝色时开始计时。让EB循环2小时，以使其穿透受损的血脑屏障（BBB）。</li>
</ol>
4. 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色
<ol>
	<li>灌注和 TTC 染色应在再灌注后 24 小时进行。</li>
	<li>在预定处死动物时间前，配制 2% 的 TTC 溶液。将 10 g TTC 粉末加入 500 ml 的 0.01 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中。将溶液置于 37 °C 水浴中加热，以促进 TTC 溶解。 注意：TTC 粉末及溶液对皮肤、肺部和眼睛具有刺激性。操作时应穿戴适当的个人防护装备。
	<ol>
		<li>待粉末完全溶解后，立即转移至瓶中，用铝箔包裹，并在 4 °C 下保存。TTC 及经 TTC 染色的组织对光敏感。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 tMCAo 后 24 小时及 EB 给药后 2 小时，使用过量异氟烷在小型诱导室中处死动物。处死后应立即开始灌注，以尽量减少因缺氧导致的自溶。</li>
	<li>将动物迅速固定在泡沫板上，前肢通过脚掌用针固定。从肋骨下方的中线处沿腹部侧方做切口。小心切开膈肌以暴露心脏。
	<ol>
		<li>使用装有冰冻 0.01 M PBS 的 60 ml 注射器连接 27 号蝶形输液针，启动灌注泵，流速设为 5 ml/min。将针尖插入左心室约 0.5 cm 深处，并剪开右心房。灌注过程中，静脉血应逐渐被稀释并从心房流出，直至静脉血变为无色。经心脏跨心灌注 30 ml 的 0.01 M 磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向透明的 20 ml 闪烁瓶中各加入 5 ml TTC 溶液。</li>
	<li>灌注完成后立即断头取脑，必要时使用小剪刀和刮勺分离脑组织。检查脑组织，排除因线栓置入导致大脑 Willis 环发生蛛网膜下腔出血的动物。确认闭塞侧大脑中动脉对侧半球呈苍白状，无明显 EB 渗漏或水肿。</li>
	<li>将 PBS 倒入专用于小鼠脑切片的丙烯酸脑切片模具中，该模具可制备厚度为 1.0 mm 的冠状切片。将脑组织背侧朝上放入模具中，并立即用 PBS 覆盖脑组织，保持湿润。
	<ol>
		<li>将厚度为 0.21 mm 的不锈钢刀片插入模具前端第二个槽位，切除嗅球。</li>
		<li>将刀片插入模具尾端第四个槽位，切除小脑。</li>
		<li>将刀片插入剩余槽位的中间位置，再将其他刀片均匀插入剩余组织之间，以确保切片时组织分布最均匀。</li>
		<li>所有刀片插入后，在脑组织上滴加 1–2 滴 PBS 以保持湿润。</li>
		<li>从颅前区域开始，依次逐个从模具中取出刀片。保留前 7 片用于 tMCAo 后的 TTC 分析。使用小刮勺小心地将切片从刀片转移至含 TTC 的小瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有切片转移至小瓶后，盖紧瓶盖并放入温水浴中，直至切片变为粉红色。必要时轻轻翻转小瓶，避免切片重叠导致染色不均。随后弃去 TTC 溶液，向小瓶中加入 4% 多聚甲醛溶液，完全覆盖脑切片，以终止 TTC 的化学反应。</li>
	<li>立即将切片整齐排列在洁净的 1&#34; × 3” 玻璃载玻片上，按从颅前到颅后方向排列。
	<ol>
		<li>切片在载玻片上排列完成后，使用普通扫描仪进行扫描。图像分辨率应至少设为 600 dpi 以供后续分析。扫描图像中必须包含动物编号和刻度尺。</li>
		<li>翻转载玻片，扫描背面以确保所有数据均被采集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 梗死体积定量分析
<ol>
	<li>使用标准图像分析软件量化梗死体积（例如， ImageJ</li>
	<li>以高分辨率扫描图像（例如 600 dpi）以进行充分分析。裁剪图像。使用扫描图像中包含的公制尺子对所有图像进行比例标准化。</li>
	<li>使用以下公式计算对侧半球的总体积。重复使用该公式计算同侧半球的总体积。 
	每片对侧半球总体积之和 × 切片厚度</li>
	<li>计算间接梗死体积。通过使用健康的对侧半球作为对照，校正中风引起的同侧脑水肿。27 使用以下公式计算间接梗死体积： 
	对侧半球总体积 - 
	（同侧半球总体积 – 梗死灶3次测量的平均体积）</li>
</ol>
6. 血脑屏障（BBB）完整性定量分析
<ol>
	<li>为进行伊文思蓝（EB）定量，首先称量2.5英寸称量舟。记录重量，并为每只动物标记两个称量舟：一个用于同侧半脑，另一个用于对侧半脑。</li>
	<li>TTC染色切片扫描完成后，使用一次性剃须刀片将每个切片沿中线分为同侧和对侧半脑。将7个切片的同侧半脑全部放入一个称量舟中并称重。对对侧半脑重复相同操作。</li>
	<li>立即将称量舟置于56 °C烘箱中干燥48小时。</li>
	<li>称量干燥后的组织。将两个半脑分别转移至两个独立的1.5 ml微量离心管中。
	<ol>
		<li>计算每个半脑所需甲酰胺的体积（每克干组织加8 ml），并分别加入对应的微量离心管中。甲酰胺对光敏感，从此时起需用铝箔包裹所有含甲酰胺处理的样品。</li>
		<li>将微量离心管置于56 °C恒温孵育器中继续孵育48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>48小时后，用移液器将蓝色上清液转移至另一组已标记的微量离心管中。轻压管底使组织沉降，以最大限度回收上清液。保留上清液管，弃去所有组织。</li>
	<li>用甲酰胺配制EB的指数级系列稀释液，用于绘制标准曲线。包括1个空白对照（仅甲酰胺），以及EB浓度从0.125 µg/ml至64 µg/ml的10个指数稀释浓度。
	<ol>
		<li>将标准曲线各稀释液各取300 µl加入96孔板中。相应孔中也加入300 µl待测上清液。</li>
		<li>使用分光光度计在620 nm波长处测定吸光度。</li>
		<li>将EB稀释液的标准曲线与上清液样品的吸光度进行比较。光密度值与血脑屏障（BBB）的完整性呈正相关。</li>
		<li>以对侧半脑的光密度值作为背景值，采用公式（同侧－对侧）/对侧计算变化倍数。有关统计分析的更多细节，请参见Martin et al., 201018。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

单次全身性缺氧暴露（即小鼠在11% O2环境中暴露2小时）可“短暂地”保护大脑免受tMCAo损伤29，这意味着缺氧预处理所引发的表观遗传反应持续时间较短，基础表型在数天内即恢复。重复施加缺氧预处理刺激可显著延长神经保护表型的持续时间6。大量研究表明，重复刺激的频率、强度和持续时间是决定该反应的关键因素。例如，在2周内每周3次（周一、周三、周五）重复相同强度和持续时间的缺氧处理（2小时，11%氧气），虽未能延长tMCAo所致神经血管损伤的治疗时间窗6，但足以诱导视网膜产生长期的缺血耐受30。有趣的是，尽管间隔6天进行5次全身性缺氧暴露（每次8% O2，持续5小时），可在最后一次缺氧暴露后第3天仍对tMCAo产生神经保护作用，但若将5次缺氧暴露的间隔缩短至3天，则神经保护效应消失31。这种差异的原因尚不明确，可能与该方案中严重缺氧的持续时间有关，和/或与如此严重程度的缺氧刺激之间缺乏足够的恢复时间有关。
简言之，在频...

中风是成人致残的首要原因，也是死亡的第四大原因，是美国成人群体面临的一种最具破坏性的疾病状态。1 中风的动物模型可用于实验性研究减少缺血性损伤和改善中风后恢复的新方法。此类转化研究的一个新方向是预处理。预处理是指有意施加一种无害的刺激，以减轻后续更严重损伤所造成的损害。2 研究表明，缺氧预处理可在大脑中引发多效性变化，在体内（in vivo）和体外（in vitro）研究中均对中风具有保护作用。3 然而，单次缺氧暴露仅能提供短期的神经保护作用，在成年小鼠中诱导的缺血耐受时间少于72小时。4 即使经过四周、每天14小时的低压性缺氧暴露，Lin等人发现神经保护作用也仅持续一周。5 重复性缺氧预处理（RHP）的特点是缺氧暴露的频率、持续时间和强度具有随机性变化。与单次预处理刺激相比，RHP可在小鼠中诱导出持续长达八周的脑保护表型。6 在最后一次缺氧暴露后数周内，RHP可减少梗死体积、血脑屏障（BBB）破坏、血管炎症以及白细胞穿出。RHP特异性地减轻了缺血脑组织中的炎症反应，表现为减少T细胞、单核细胞和巨噬细胞的数量，同时维持缺血半球中B细胞的数量。7 事实上，在任何中枢神经系统（CNS）损伤（包括中风）发生之前，RHP已在小鼠中诱导出一种免疫抑制表型。从经RHP处理的健康小鼠中分离出的B细胞表现出独特的抗炎表型，其抗原呈递和抗体生成均受到下调。总体上，促炎性适应性免疫机制的降低使RHP成为一种优异的方法，可用于诱导内源性免疫抑制，不仅适用于中枢神经系统特异性的炎症性疾病，也适用于包含促炎性病理过程的全身性损伤或疾病模型。
RHP 可减少短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）后的梗死体积和血脑屏障（BBB）破坏。中风的动物模型（如常用的 tMCAo）极大地促进了对中风病理生理机制的理解，并有助于设计更有效的神经治疗药物。tMCAo 方法最早由 Koizumi et al. 于 1986 年建立8，是诱导啮齿类动物中风的常用方法之一，也是研究再灌注后炎症反应的首选方法之一。随着 tMCAo 技术的不断改进，近年来使用硅胶包被的线栓进一步降低了与其他模型相比发生蛛网膜下腔出血的风险9,10，并提高了实验的可靠性，但遗憾的是，tMCAo 常导致梗死体积存在较大变异11-13。大多数研究通过 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色冠状脑切片来界定梗死区域，TTC 被视为梗死定量的金标准，因其操作简便、成本低廉，且能产生清晰、可重复的结果。TTC 作为线粒体中脱氢酶的底物，当脑切片与 TTC 溶液接触时，TTC 被选择性地摄入活细胞，在有活性的线粒体内被还原为不溶性的甲臜（formazan），呈现深红色沉淀。由于缺血组织中线粒体功能障碍，该区域无法发生还原反应而保持白色，从而可区分受损组织与健康组织14。
RHP 还可减少缺血半球血脑屏障（BBB）的破坏6。因此，在同一动物脑组织中同时进行基于 TTC 的梗死体积测定和 BBB 完整性的双重定量15，将有助于全面评估内源性保护作用的效果，并揭示未治疗和治疗动物中 BBB 破坏与脑梗死之间可能存在的因果关系。卒中后继发的血脑屏障破坏导致外周血液进入脑组织，从而增加缺血半球中的白细胞数量、促炎性细胞因子、氧化应激、血管源性脑水肿以及出血性转化，最终提高缺血性卒中患者的感染率和死亡率16,17。在动物模型中，测量血脑屏障破坏的常用方法是定量伊文思蓝（Evans blue, EB）染料向脑组织的渗漏15,18-21。EB 可特异性结合血清白蛋白——一种球状蛋白（分子量=65 kDa），在未受损动物中无法穿过血脑屏障22。缺血性卒中发生后，EB 渗入脑组织，并在 620 nm 处产生荧光，从而可通过测定灌注后损伤脑实质的光密度进行定量分析22。当通过心脏灌注将死亡后皮层血管内的 EB 彻底清除后，光密度与血脑屏障通透性呈正比。通过对注射 EB 后的动物立即处理 TTC 染色的脑组织，可有效同时定量梗死体积和血脑屏障破坏程度。然而需要注意的是，神经元损伤与血脑屏障破坏在卒中后的脑组织中并非同步发生的过程23,24，因此选择合适的处死时间点至关重要。
以下方案详细介绍了RHP方法、用于诱导暂时性动脉阻塞以模拟人类患者大脑中动脉闭塞的tMCAo方法，以及用于确定神经和血管卒中损伤终点的双重组织学方法。TTC用于检测细胞死亡和累积性组织损伤，可对总体梗死体积进行定量；而EB则用于对血脑屏障（BBB）损伤进行半脑定量分析。

<table><tbody><tr><td>流量计、调节器</td><td>VetEquip, Inc</td><td>特殊订购</td><td>四个流量计连接到6.0 mm的柔性PVC管，该管通过塑料母接头连接至每个诱导室的进气口。这些流量计用螺栓固定在一根6.5&quot; x 1&quot; x 1&quot;的金属条上。该金属条再用螺栓固定在带有DISS出口的MI-246-P压力表上。该压力表和流量计设备可用扳手连接至每个新气瓶。</td></tr><tr><td>21% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;气罐</td><td>AirGas</td><td>OX USP200</td><td></td></tr><tr><td>11% O&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;气罐</td><td>AirGas</td><td>特殊订购</td><td></td></tr><tr><td>8% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;气罐&amp;nbsp;</td><td>AirGas</td><td>特殊订购</td><td></td></tr><tr><td>15 L诱导室</td><td>VetEquip</td><td>941454</td><td></td></tr><tr><td>Moor Laber 多普勒血流仪&amp;nbsp;</td><td>Moor Instruments&amp;nbsp;</td><td>moorVMS-LDF1-HP</td><td>0.8 mm直径探头&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高强度照明器&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NI-150</td><td></td></tr><tr><td>变焦立体显微镜&amp;nbsp;</td><td>NIkon</td><td>SMZ800</td><td>也可使用其他手术显微镜。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kent Scientific Right Temperature CODA</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>已停产</td><td>推荐替代产品为PhysioSuite，配备RightTemp体温监测与恒温控制系统（Kent Scientific，货号#PS-RT）。</td></tr><tr><td>Hovabator孵育器</td><td>Stromberg's</td><td>2362-E</td><td>我们的型号为2362N。2362E为后续型号，配备电子恒温器。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>V010麻醉系统&amp;nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td>包括：十英尺高压氧气管、支架、流量计、氧气冲洗组件、挥发器、呼吸回路、诱导室、鼻罩、废气排放管及两个VapoGuard过滤器</td></tr><tr><td>250 ml 异氟烷&amp;nbsp;</td><td>Butler Schein</td><td>NDC-11695</td><td></td></tr><tr><td>D-6 Vet Trim动物无线修剪器&amp;nbsp;</td><td>Andis&amp;nbsp;</td><td>#23905</td><td>替换刀片可从Andis公司购买（#23995）</td></tr><tr><td>聚维酮碘&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-867&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>多家供应商&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>67622</td><td></td></tr><tr><td>手术巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>GM300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线&amp;nbsp;</td><td>Look/Div Surgical Specialties</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>尼龙缝合线</td><td>Look/Div Surgical Specialties</td><td>SP185</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5镊子（2把）&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11251-35</td><td>45&amp;deg;弯头</td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Vannas剪</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INS600177</td><td>直刃</td></tr><tr><td>Hartman止血钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>闭塞缝合丝</td><td>华盛顿大学</td><td>特殊订购</td><td>缝合丝由华盛顿大学进行硅胶涂层处理，并有偿提供给UTSW设施使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma Aldritch</td><td>E2129-10G</td><td></td></tr><tr><td>滤纸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldritch</td><td>WHA1001150</td><td>150 mm，圆形，1号滤纸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>称量舟</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-101</td><td>2.5&quot;直径</td></tr><tr><td>0.9%氯化钠注射液 USP&amp;nbsp;</td><td>Baxter Pharmaceutics&amp;nbsp;</td><td>2B1321</td><td></td></tr><tr><td>0.3 cc胰岛素注射器，带29号针头</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>平底固定器&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific&amp;nbsp;</td><td>FB&amp;nbsp;M</td><td>2.0&quot;直径</td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS，pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>多家供应商&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td>可手动将含TTC的闪烁管置于流动温水中，作为水浴锅的替代方法。</td></tr><tr><td>泡沫板</td><td>多家供应商&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>大容量注射器套件</td><td>PumpSystems Inc</td><td>P-SYRKIT-LG</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>PumpSystems Inc</td><td>NE-300&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>60 cc注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9203256</td><td></td></tr><tr><td>27号带翼输液器</td><td>Kawasumi Laboratories, Inc</td><td>D3K1-25G 1</td><td></td></tr><tr><td>20 ml闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-367-126</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢刮刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Alto丙烯酸1.0 mm小鼠脑，冠状切面</td><td>CellPoint Scientific&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.21 mm不锈钢刀片，25片/包</td><td>CellPoint Scientific&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td>可重复使用的冷冻切片刀片是一种经济的替代选择。</td></tr><tr><td>4%多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HP Scanjet G4050</td><td>多家供应商&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td>其他商用扫描仪也适用于本实验步骤。</td></tr><tr><td>ImageJ&amp;nbsp;</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo&amp;nbsp;</td><td>XSE 205U</td><td></td></tr><tr><td>精密紧凑型烘箱&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>PR305225M</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml微量离心管（Eppendorf）</td><td>Denville Scientific&amp;nbsp;</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-9</td><td></td></tr><tr><td>Epoch微孔板分光光度计&amp;nbsp;</td><td>BioTek&amp;nbsp;</td><td>无目录号&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

脑卒中实验动物模型是研究脑卒中病理机制并开发更有效治疗策略的重要工具。为期两周的重复性缺氧预处理（RHP）方案可在局灶性缺血性脑卒中小鼠模型中诱导对中枢神经系统（CNS）损伤的长期保护作用。RHP包括9次随机暴露于缺氧环境，其持续时间（2或4小时）和强度（8%和11% O2）均不相同。RHP可在最后一次缺氧暴露后数周内显著减小梗死体积，减轻血脑屏障（BBB）破坏，并抑制卒中后的炎症反应，提示其可长期诱导一种内源性的中枢神经系统保护表型。对梗死体积和血脑屏障破坏进行双重定量的方法，可用于有效评估接受RHP或其他潜在神经保护剂处理小鼠的神经血管保护效果。成年雄性Swiss Webster小鼠接受RHP预处理，或暴露于相同持续时间的21% O2（即 室内空气）作为对照。在最后一次缺氧暴露后2周，实施60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）。通过经颅激光多普勒血流仪确认闭塞和再灌注过程。再灌注22小时后，经尾静脉注射伊文思蓝（EB）。2小时后，采用异氟烷过量麻醉处死动物，脑组织切片用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，随后对梗死体积进行定量分析。随后，将EB从脑组织中提取48小时，以评估tMCAo后的血脑屏障破坏程度。综上所述，RHP是一种简单、低成本且可重复的实验方案，可在小鼠中诱导对脑卒中损伤的长期内源性神经血管保护作用，并具有向其他中枢神经系统相关及全身性促炎性疾病状态转化的应用潜力。

本研究纳入25只10周龄的雄性Swiss Webster小鼠，在随机分组时分为RHP组（n = 10）和21% O2组（n = 15）。在最后一次RHP暴露后两周进行手术操作，各组在不同实验日之间采用盲法并交叉平衡设计。在tMCAo术后，1只小鼠在术后恢复期间死亡，另有1只小鼠因未达到再灌注CBF标准而被排除出研究。这两只被排除的小鼠均来自21% O2组。根据ARRIVE指南28，表2列出了手术相关参数。间接梗死体积、半球肿胀（即水肿）以及伊文思蓝（EB）外渗结果见图2。所有数据均采用非配对t检验进行分析（显示均值和标准差），并通过错误发现率低于1%的方法（Graphpad Prism）检测异常值，共从EB数据集中剔除了4个异常值（21%组2个，RHP组2个）。
在该队列中，RHP使梗死体积减少了近一半（33.9 ± 23.0 mm3) 与21% O₂相比2-处理小鼠（62.6 ± 42.6 mm）3...

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。

用于研究中风的实验动物模型是理解中风病理机制和开发更有效治疗策略的重要工具。2周……

以下实验的总体目标是通过同时测量梗死体积和血脑屏障完整性，来量化重复性低氧预处理（RHP）后的神经保护作用。该目标通过使小鼠经历九次在持续时间和强度上均具有随机变化的低氧暴露来实现，从而为小鼠提供脑血管对中风的保护作用。随后在小鼠体内诱导中风，并注射伊文思蓝进行检测。伊文思蓝可选择性结合白蛋白，从而在动物注射后处死时用于量化血脑屏障的破坏程度。取出脑组织后，用TTC染色以定量梗死体积。结果表明，重复性缺氧预处理对缺血性脑卒中后的小鼠具有神经保护作用。与现有的单次暴露缺氧预处理等方法相比，该技术的主要优势在于，重复性缺氧预处理（RHP）可在小鼠中产生至少八周的神经保护作用。这种双重定量方法能够回答脑卒中研究中的关键问题，例如如何同时测量血脑屏障破坏情况下的梗死体积。尽管该方法可用于研究缺血性脑卒中，RHP 还可应用于其他中枢神经系统相关及全身性促炎性疾病状态。首先，将小鼠分为两组。接受8%和11%氧气暴露的RHP组以及同时接受21%氧气暴露的对照组，需取下每个笼子的顶部滤膜盖，将带有完整食物和水瓶的笼子放入与其相应氧气罐连接的暴露舱内。关闭并固定暴露舱的盖子。打开氧气罐的主气体阀门，并将每个诱导舱的初始气体流速设定为每分钟2升（LPM）。暴露5分钟后，将流速降低至1 LPM，并在剩余的暴露时间内保持该流速。暴露结束时，将流速降至0 LPM并关闭气体阀门。针对气罐的操作。打开舱盖，并更换每个笼子的滤膜顶盖。将笼子放回标准饲养环境中，直至下一次缺氧暴露。每次使用后，用消毒剂和除臭剂喷洒每个诱导舱。在实验方案的两周时间内，于每天同一时间同时暴露RHP小鼠和对照小鼠。随后按照文中所述方法进行短暂性大脑中动脉闭塞（A-T-M-C-A-O）。伊文思蓝（EB）注射应在再灌注后22小时进行，并在处死动物进行NTTC染色前在血液中循环2小时。准备注射所需的EB用量。然后用0.3 cc胰岛素注射器吸取所需体积的室温液体。使用29号针头，将小鼠置于平底固定器中进行固定。握住小鼠尾巴，使侧静脉位于最上方。侧静脉位于尾巴中线的两侧。固定尾巴尖端，以保持小鼠在注射过程中的稳定。将针头插入静脉约三到五毫米。注意避免穿破静脉，在一分钟内将所有染料完全注入。若溶液进入静脉，推动注射器时应感受到极小的阻力。通过观察小鼠尾部肢体和眼睛立即出现的颜色变化，确认伊文思蓝（EB）已成功进行系统性静脉注射。拔出针头，并用干净的纱布轻轻按压尾部以止血。开始计时。当小鼠皮肤变为蓝色后，让伊文思蓝（EB）循环两小时，以穿透受损的血脑屏障。在T-M-C-A-O术后24小时、EB给药后2小时，通过小型诱导室中过量异氟烷麻醉处死动物，随后在再灌注24小时时进行灌注及TTC染色。处死后应立即开始灌注，以尽量减少自溶作用，因为死亡后缺氧会立即引发自溶。将动物迅速固定在泡沫塑料平台上，前肢通过脚掌固定。从肋骨下方中线处开始，沿侧向切开腹壁。小心切开膈肌以暴露心脏。使用一个装有冰冻的0.01摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）的60毫升注射器，连接27号带翼输液针，以每分钟5毫升的流速启动灌注泵。将针尖插入心脏左心室约0.5厘米深处，并剪开右心房。灌注过程中，应有逐渐稀释的静脉血从心房流出，直至流出液变为无色。随后，通过心脏灌注30毫升0.01摩尔的PBS，实现无色透明的心脏灌注。接下来，将五毫升TTC溶液加入透明的20个闪烁瓶中。灌注结束后立即处死动物，并在必要时使用小剪刀和刮匙取出脑组织。检查对侧大脑半球（即对侧大脑中动脉供血区）是否呈现苍白，且无明显伊文思蓝渗漏或水肿现象。将 PBS 缓慢加入专为小鼠脑组织制备 1.0 毫米厚冠状切片而设计的丙烯酸脑切片模具中。将脑组织背侧朝上放入模具内，并立即在脑组织上倒入 PBS，保持脑组织湿润。通过将不锈钢刀片（厚度为0.21毫米）从矩阵前端侧的第二个槽插入，以去除嗅球。然后从矩阵尾端侧的第四个槽插入刀片，以去除小脑。将刀片插入矩阵中剩余槽位的中间槽内。然后将剩余的刀片均匀插入，以均分剩余组织，确保切片过程中组织分布最为均匀。所有刀片插入后，在脑组织上滴加一至两滴 PBS 液体以使其湿润。接下来，从吻侧区域开始，依次逐个移除矩阵中的刀片。保留前七片用于TTC分析。在T-M-C-A-O之后，使用小刮铲小心地将切片从刀片转移到装有TTC的试管中。当所有切片都放入试管后，盖上盖子，并将其置于温水浴中，直至切片变为粉红色。如有必要，轻轻转动瓶子以避免切片重叠，否则可能导致染色不均。然后弃去TTC溶液，并向小瓶中加入4%多聚甲醛溶液以覆盖脑切片，从而终止TTC化学反应。立即将切片放置在干净的1英寸×3英寸玻璃载玻片上，并将切片按从头端到尾端的方向排列整齐。扫描载玻片。使用标准扫描仪，将分辨率设置为至少600 DPI，以进行图像分析。扫描图像时务必包含动物名称和公制标尺。最后，翻转载玻片并扫描背面，以确保收集到所有数据。与对照组小鼠相比，RHP 使梗死体积减少了 46%，但对同一动物 TTC 数据所计算的半球肿胀无影响。RHP 可减轻血脑屏障的破坏，该效应通过伊文思蓝渗漏量来评估，并将其标准化至对侧半脑。图中显示了经 RHP 处理和暴露于 21% 氧气的对照组具有代表性的 TTC 染色结果。每份样本下方列出了相应的小鼠脑梗死体积和伊文思蓝渗漏量。同侧指脑的缺血半球，对侧指脑的非受累半球。在进行该操作时，重要的是要记住在融合后22小时注射伊文思蓝，并在动物处死前让其循环2小时。该技术为临床前卒中研究领域的研究人员探索小鼠卒中内源性保护机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够清楚地理解如何通过双重定量血脑屏障完整性和梗死体积来评估RHP的神经保护作用。

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科研

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医学

神经血管保护定量继在小鼠重复缺氧预处理和瞬态大脑中动脉闭塞

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。...

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

来源：Zheng, Y., 等．研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型．J. Vis. Exp.

评估酸性后处理在脑缺血小鼠模型中的神经保护作用

来源：Poinsatte, K., et al., 小鼠重复性缺氧预处理及短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的定量分析。J. Vis. Exp.

小鼠神经元对重复性缺氧预处理的适应性

来源：Lee, S. E., 等。利用短暂性大脑中动脉闭塞小鼠模型评估甘草根及根茎提取物的神经保护作用。J. Vis. Exp.

评估测试化合物在小鼠大脑中动脉闭塞模型中的神经保护作用

为了理解脑卒中的病理生理学机制，使用可靠的模型至关重要。本文将介绍小鼠中最常用的脑卒中模型之一，即大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内丝线或缝线模型），并包含再灌注过程。...

小鼠大脑中动脉闭塞与再灌注诱导脑卒中的手术方法

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

我们描述了一种通过使用硅胶包被的缝合线阻塞大脑中动脉来诱导小鼠脑卒中的模型。该方案可用于诱导永久性阻塞，或诱导短暂性缺血后进行再灌注。...

采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO2 大脑中动脉闭塞后 体内.

研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。...

短暂性大脑中动脉闭塞卒中模型

本文介绍了一种通过经颅电凝法在C57BL/6J小鼠中建立远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型的实验方案，并对随后的神经行为学表现及组织病理学特征进行评估。...

采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

了解重复缺氧预处理对小鼠脑缺血性卒中的神经保护作用，通过伊文思蓝染色和TTC染色同时定量测量血脑屏障完整性和梗死体积。该方法为卒中研究提供双重定量评估手段。

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

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