Name: Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Verhaltensanalyse zur Messung von Ethanol-Sedierungsempfindlichkeit und schneller Toleranz bei Drosophila. Diese skalierbare Methode ermöglicht verlässliche Studien zur Suchtforschung.

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Diese Studien wurden durch Zuschüsse der National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse an M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537) unterstützt. Die Autoren danken Jill Bettinger für die hilfreichen Diskussionen und Jacqueline DeLoyht für die technische Unterstützung.

1. Tag vor dem Assay <ol><li> Sammeln Fliegen in frischen Lebensmitteln Fläschchen in Gruppen von 11 (gleichgeschlechtlichen) unter kurzen (1-5 min) CO 2. </li><li> Lassen Sie Fliegen auf O / N in der Lebensmittelfläschchen umwelt selbst kontrollierte Verkaufsflächen wiederherzustellen (in der Regel 25 ° C, 60% relative Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus). </li><li> Bereiten Ethanol-Lösung (en) durch Verdünnen reine (100%) in Ethanol gereinigt (≥18 MQ) Wasser auf eine Endkonzentration (n) für das geplante Experiment geeignet. Anschließend Lösung (en) auf RT O / N zurück. Hinweis: Die Verdünnung von Ethanol ist exotherm. </li></ol> 2. Tag der Assay <ol><li> Für jedes zu prüfende Ampulle von Fliegen, vorzubereiten (i) eine saubere, leere Konserven Fläschchen; dh Testfläschchen, (ii) ein neuer Celluloseacetat Stecker, (iii) ein Silicon-Stopfen und (iv) 1 ml Ethanollösung (siehe Tabelle 3). </li><li> Bereiten Testraum durch Einstellen der Temperatur auf 20-25 ° C und die relative Luftfeuchtigkeit um 55-65%. </li><li> Haben Sie eine andere Arbeitskraftvergeben Sie einen eindeutigen Code für jede Gruppe von Fläschchen und notieren Sie den Code für später. Zeigen codierten Röhrchen mit Fliegen im Testraum für ein paar Minuten akklimatisieren. </li><li> Beschriften Sie leere Testfläschchen bis hin zu Codes auf Fly Ampullen von 2,3 entsprechen. </li><li> Konstruieren Sie eine Hardcopy Testprotokoll in einer Tabellenkalkulation ähnlich Tabelle 1 Eingabe der Codes in Spalten (eine Spalte / Fläschchen). </li><li> Mit dem Testprotokoll als Leitfaden, ordnen codiert Essen Fläschchen mit Fliegen und leere Testfläschchen in entsprechende Felder in den Testraum. Hinweis: Eine sinnvolle maximale Anzahl der Fläschchen, um zu testen, ist 24 (dh, 6 Sätze von 4 Flaschen je). </li><li> Über fliegt aus der Nahrung in die Fläschchen abgestimmt / beschriftet leer Test Fläschchen und sofort legen Celluloseacetat Stecker in Testfläschchen bis Celluloseacetat Stecker sind 2 cm unterhalb der Flasche Tops. </li><li> Im Folgenden behandeln jede Zeile von vier Ampullen als Set zu gestaffelten 1-Minuten-Intervallen. </li><li> Für die Zeit 0 Beurteilung, fassen Jedes Fläschchen individuell with Daumen und Zeigefinger, und tippen Sie vorsichtig auf dem Tisch drei Mal, um Fliegen auf den Boden der Ampulle klopfen, warten Sie 30 Sekunden und dann zählen die Anzahl der Fliegen, die unbeweglich / tot sind. Notieren Sie sich die Anzahl der unbeweglich / tote Fliegen für jedes Fläschchen zum Zeitpunkt 0 min in dem gedruckten Testprotokoll. </li><li> Timer starten Zählen kontinuierlich zum Zeitpunkt 0 und beginnt sofort mit Zugabe von 1 ml Ethanol zu Celluloseacetat Stecker in die Fläschchen für die erste Zeile / Set von 4 Flaschen. Zugabe von 1 ml Ethanol zu der Celluloseacetat Topfen in die Fläschchen in 5 Sekunden-Intervallen in der Reihenfolge, wie sie getestet werden. Hinzufügen von Ethanol zu der Celluloseester-Stecker in einer kreisförmigen Bewegung, so daß das Ethanol gleichmäßig in der Celluloseacetat Topfen absorbiert. Wenn Ethanol wurde an alle 4 Testdurchstechflaschen in der Menge hinzugefügt wurde, legen Sie eine Silikonkappe in jedem Fläschchen, um sie zu versiegeln. </li><li> Zu Zeiten 1, 2, 3, 4 und 5 min, 1 ml Ethanol zu den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von 4 Flaschen sind. Weiter Einsetzen Silikonstopper nachZugabe von Ethanol zu jedem Satz von 4 Flaschen. </li><li> Zum Zeitpunkt 6 min, testen Sie den ersten Satz von 4 Durchstechflaschen durch Greifen einer Flasche mit Daumen und Zeigefinger, leichtes Klopfen auf den Tisch dreimal, um Fliegen auf den Boden der Ampulle klopfen, warten 30 Sekunden und dann Zählen und Aufzeichnen der Gesamtzahl der Fliegen, die sediert werden. Score fliegt wie betäubt, wenn sie (i) stehen auf dem Boden des Gefäßes, aber nicht zu Fuß oder (ii) liegen auf dem Rücken, mit oder ohne mit den Flügeln schlugen. </li><li> Fassen Sie das Fläschchen in der Höhe von 5 Sekunden-Intervallen mit dem Zeitplan in der Tabelle 2. </li><li> Zu Zeiten 7, 8, 9, 10 und 11 min, testen die zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von Fläschchen, die jeweils wie für den ersten Satz durchgeführt. </li><li> Zum Zeitpunkt 12 min, Testen des ersten Satzes von 4 Flaschen wiederum wie in 2.12 beschrieben, und weiterhin die Prüfung der zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von Röhrchen bei 13, 14, 15, 16 und 17 min, auf. </li><li> Weiter Testfliegen wie in 2.12 beschrieben, bis alle Fliegen sind sedated. </li><li> Geben Sie die Gesamtzahl der Fliegen in jeder Flasche in der Papiertestprotokoll. Zensieren unbeweglich / tote Fliegen zum Zeitpunkt 0 aus der Gesamtzahl der Fliegen. </li><li> Berechnen Sie die prozentuale aktive Fliegen an jedem Bewertungszeitpunkt und Plot-Daten als% aktive Fliegen (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse). Quantifizieren Ethanol Sedierung durch Interpolation Sedierung Zeit 50 Werte (ST50, Zeit zu 50% Sedierung) von Polynom dritter Ordnung oder S-förmigen Kurvenanpassungen oder Berechnung Fläche unter der Kurve. </li><li> Kompilieren von Daten aus decodiert Fläschchen und statistische Analysen durchführen (zB Einweg-ANOVA mit Bonferroni Mehrfachvergleichstest) gegebenenfalls für das experimentelle Design. </li></ol>

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<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li>
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<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ethanol+responses+in+Drosophila+are+sexually+dimorphic%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Einfache Tests, die reproduzierbar quantifizieren sinn Phänotypen sind von großem Wert für die Analyse des Verhaltens. Die hier beschriebenen Arbeiten werden mehrere praktische Aspekte eines Tests zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Drosophila. Obwohl nicht ein Schwerpunkt dieser Arbeit, sind Verhaltensanalysen durch die Erhaltung der Umwelt und genetischen Hintergrund Konstante für Probanden in einer Studie erleichtert. Ferner sollten Vergleiche typischerweise zwischen Gr...

Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein enormes Gesundheitsproblem weltweit (in 1 überprüft). Obwohl die Mechanismen, die der Entwicklung von AUD komplex sind, sind diese Erkrankungen einen wichtigen genetischen Komponente (zB 2). Die große Erblichkeit der AUD und der konservierten Verhaltensreaktionen auf auf viele Arten (in 3,4 prüft) haben starkes Interesse an der Verwendung von genetischen Modellorganismen, um die Beteiligung bestimmter Gene in Ethanol bezogene Verhaltensweisen gegenüber ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen der Untersuchung erzeugten Ethanol AUD. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, hat als einer der führenden Modellorganismus für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen der Ethanol-Verhalten (in 3,4 prüft) entstanden. Studium der Fliegen haben Rollen für mehrere Signalwege in Verhaltensreaktionen auf Ethanol (in 5 mit Beiträgen) hervorgehoben. Interessanterweise, die Verhaltens respons beeinflussen einige der Gene und Signalwegees zu Ethanol in Fliegen auch in Nagetier Ethanolrelevante Verhaltensweisen und / oder menschlichen AUD (zB 6-14) in Verbindung gebracht. Die Erhaltung der Mechanismen, die Ethanolrelevante Verhaltensweisen zwischen den Arten, zusammen mit der Suite von genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Drosophila-Modellsystem, unterstreichen den Nutzen der Fruchtfliege Modell zur Untersuchung der Genetik von Verhaltensreaktionen auf Ethanol. Empfindlichkeit 15,16 und der Toleranz (in 17 überprüft), um beim Menschen Ethanol wird zur Entwicklung von AUD verbunden. Beide Verhaltensreaktionen auf Ethanol in Fliegen über eine Vielzahl von Labortests (in 3,4 Bewertung) modelliert werden. Alle der Fliegen Assays den Autoren bekannt sind auf beiden zeitabhängigen Ethanol-induzierten Sedierung / Inkoordination oder zeitabhängigen Rückgewinnung aus Ethanol Sedierung basiert. In einem früheren Artikel aus unserer Gruppe über die Genetik der Ethanolsensitivität und rapid Toleranz in Drosophila, einem Verhaltenstest basierend auf Ethanoldampf-induzierten Sedierung von Fliegen wurde 18 verwendet. Testing in diesem Test wurde durch die Übertragung von Live-Erwachsenen initiiert fliegt ohne Betäubung, um Nahrung zu leeren Fläschchen, Trapping die Fliegen in den Fläschchen mit einer Celluloseacetat-Stecker, Zugabe von Ethanol zu der Spitze (dh nicht-fly-Seite) des Celluloseacetats Stecker, und Abdichten der Ampulle, die Fliegen, Celluloseacetat Stecker und Ethanol mit einem Silikonstopper (siehe schematische Abbildung S3 Referenz 18). Mehrere Fläschchen, die verschiedene Gruppen von Fliegen wurden parallel untersucht, der Durchsatz erhöht dieses Assays. Die Fläschchen wurden eine anonyme Code gegeben und Experimentatoren wurden Behandlungsgruppe geblendet, um unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Beurteilung der Sedierung zu vermeiden. In einer Standard-Experiment fliegt in Ampullen wurden sanft mit 6-Minuten-Intervallen abgegriffen und nach einer 30 Sekunden Erholung, wurde die Anzahl der sediert Fliegen in jedem Fläschchen gezählt und converted, um die prozentuale aktive Fliegen. Fliegen absorbiert Ethanoldampf aus dem Celluloseacetat-Plug in einem zeitabhängig, was zu einem progressiven Anstieg der internen Ethanol 18 und Sedierung (siehe Referenz 18 und 1A und 1B in diesem Bericht). Sedierung in diesem Test wurde operativ wie Fliegen (i) stehen in der Abwesenheit von Walking oder (ii) auf dem Rücken liegend mit oder ohne mit den Flügeln schlugen definiert. Hier wird diese Ethanol Sedierung Assay im Detail beschrieben, wird eine weitere Betriebsoptimierung relevant Verwendung vorgesehen, und der Assay wird verwendet, um den Beitrag der Nahrungsergänzung Optionen auf fly Sedierung Empfindlichkeit ansprechen.

<table><tbody><tr><td>Lebensmittelfläschchen</td><td>VWR</td><td>89092-772</td><td>schmal</td></tr><tr><td>Flugs</td><td>Genesee/flystuff.com</td><td>49-102</td><td>schmaler</td></tr><tr><td>Silikonstopfen</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-704-1l</td><td>#4</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Pharmaco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 polierte Platte</td></tr></tbody></table>

eine preiswerte, skalierbare behavioral assay zur messung von ethanol sedierung empfindlichkeit und rapid toleranz in<em&gt; drosophila</em

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein ernstes Gesundheitsproblem. Trotz einer großen erbliche Komponente auf AUD, wenige Gene wurden eindeutig in ihrer Ätiologie in Verbindung gebracht. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen, die alkoholbedingte Verhaltensweisen und hält daher ein großes Versprechen für die Identifizierung und das Verständnis der Funktion von Genen, die AUD beeinflussen. Die Verwendung der Drosophila-Modell für diese Art von Untersuchungen hängt von der Verfügbarkeit von Assays, die zuverlässig Verhaltensreaktionen auf Ethanol zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine für die Beurteilung Ethanol Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Fliegen-Assay. Ethanol Empfindlichkeit in diesem Test gemessen wird durch das Volumen und die Konzentration von Ethanol verwendet wird, eine Vielzahl von zuvor berichtet, genetische Manipulationen, und auch die Länge der Zeit beeinflusst die Fliegen ohne Nahrung unmittelbar vor der Prüfung untergebracht. Demgegenüber Ethanol sensitivity in diesem Test gemessen wird, nicht von der Kraft der Fliegen Handhabung, des Geschlechts der Fliegen, und Ergänzung des Wachstumsmediums mit Antibiotika oder lebende Hefe beeinflußt. Drei verschiedene Methoden zur Quantifizierung von Ethanol Empfindlichkeit beschrieben, die alle zu wesentlichen nicht unterscheidbar Ethanolsensitivität Ergebnisse. Durch die Skalierbarkeit dieses Tests, kombiniert mit seiner Gesamt Einfachheit zu Set-up und relativ niedrige Kosten, machen es für kleine und große genetische Analyse von Ethanolsensitivität und schnelle Toleranz in Drosophila geeignet.

Die Rohdaten dieser Ethanol Sedierung Assays ist die Zahl der Fliegen, die als Funktion der Ethanoldampf Einwirkzeit sediert. Rohdaten werden auf die prozentuale aktive Fliegen als eine Funktion der Zeit umgewandelt werden (Primärdaten, die 1A, B, D - F). Empfindlichkeit gegenüber Ethanol Sedierung von den primären Daten, wie Sedation Zeit 50 (ST50) quantifiziert werden, die Zeit für 50% der Fliegen erforderlich sedierten oder aea unter der Kurve (AUC) zu werden, durch Interpolation von...

Einfache Assays zur Messung der Ethanolsensitivität und schnellen Toleranz in Drosophila erleichtern die Verwendung dieses Modellorganismus zur Untersuchung dieser wichtigen ethanolbezogenen Verhaltensweisen. Hier wird ein relativ einfacher, skalierbarer Assay zur Messung der Ethanolsensitivität und der schnellen Toleranz bei Fliegen beschrieben.

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Empfindlichkeit gegenüber Alkoholbetäubung bei Fruchtfliegen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Fliegen in Röhrchen gegeben und Alkoholdampf ausgesetzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Anzahl der betäubten Fliegen in jedem Röhrchen zu wiederkehrenden Zeitpunkten zu bestimmen, bis alle Fliegen betäubt sind.Danach wird der Zeitpunkt interpoliert. Wenn 50 % der Fliegen in jedem Kolben sediert sind, zeigen die Ergebnisse einen Index der Zeit, die erforderlich ist, um Fruchtfliegen mit Ethanol zu sedieren. Diese Prozedur wird heute von Simran Sindu, einer Studentin in meinem Labor, demonstriert. Um das Experiment zu beginnen, sammeln Sie Fliegen in frischen Nährbodenkolben in Gruppen von 11 Tieren eines einzelnen Geschlechts innerhalb von bis zu fünf Minuten unter CO2-Beeinflussung und lassen Sie die Fliegen anschließend über Nacht in Nährbodenkolben in einem umweltkontrollierten Raum regenerieren.Stellen Sie eine Ethanol-Lösung her, indem Sie reines 100%iges Ethanol mit gereinigtem Wasser auf eine Endkonzentration von 85 % verdünnen. Lassen Sie die Lösung vor dem Test über Nacht auf Raumtemperatur zurückkehren. Bereiten Sie ein sauberes, leeres Probengefäß vor, das als Testgefäß dient. Verwenden Sie einen neuen Celluloseacetat-Stopfen, einen Silikonstopfen und ein Milliliter der Ethanol-Lösung für jedes Gefäß mit Fliegen, die getestet werden sollen. Stellen Sie die Raumtemperatur auf 20 bis 25 Grad Celsius und die relative Luftfeuchtigkeit auf 55 bis 65 % ein. Weisen Sie einer weiteren Person die Aufgabe zu, jeder Gruppe von Gefäßen einen eindeutigen Code zuzuweisen und diesen Code für spätere Zwecke zu dokumentieren. Stellen Sie die codierten Gefäße mit den Fliegen im Testraum einige Minuten lang zum Akklimatisieren bereit. Beschriften Sie anschließend die leeren Testgefäße entsprechend den Codes auf den Fliegengefäßen.Erstellen Sie ein physisches Testprotokoll, indem Sie die Codes in Spalten einer Tabelle eintragen, wobei jede Vial eine eigene Spalte erhält. Verwenden Sie das Testprotokoll als Leitfaden. Ordnen Sie die codierten Futtergefäße mit Fliegen und die leeren Testgefäße in entsprechenden Reihen im Testraum an und überführen Sie die Fliegen nacheinander aus den Futtergefäßen in die passenden, beschrifteten Testgefäße.Danach sofort Celluloseacetat-Stopfen in die Testfläschchen einführen, bis die Celluloseacetat-Stopfen zwei Zentimeter unterhalb der Fläschchenöffnungen liegen. Für die Zeit-Null-Bewertung. Jedes Fläschchen einzeln mit Daumen und Zeigefinger anfassen.Tippen Sie dreimal leicht auf den Tisch, um die Fliegen auf den Boden des Gefäßes zu befördern. Warten Sie 30 Sekunden und zählen Sie die Anzahl der bewegungsunfähigen und/oder toten Fliegen. Notieren Sie die Anzahl der bewegungsunfähigen toten Fliegen für jedes Gefäß zum jeweiligen Zeitpunkt.Null Minuten im handschriftlichen Prüfprotokoll. Starten Sie die Stoppuhr zum Zeitpunkt null und geben Sie sofort ein Milliliter Ethanol zum Celluloseacetat hinzu. Rühren Sie im kreisförmigen Bewegungsablauf in Abständen von fünf Sekunden für den ersten Satz von vier Gefäßen in der vorgegebenen Reihenfolge.Sie werden getestet, sobald Ethanol zu allen vier Testgefäßen des Satzes hinzugegeben wurde. Setzen Sie einen Silikonstopfen in jedes Gefäß, um es nach 1, 2, 3, 4 und fünf Minuten abzudichten. Geben Sie je einen Milliliter Ethanol in den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Satz mit jeweils vier Gefäßen.Setzen Sie das Einführen der Silikonstopfen fort, nachdem Ethanol zu jedem Satz von vier LS-Gefäßen nach sechs Minuten hinzugefügt wurde. Testen Sie den ersten Satz von vier Gefäßen, indem Sie jedes Gefäß mit Daumen und Zeigefinger festhalten und es dreimal vorsichtig auf den Tisch klopfen, um die Fliegen auf den Boden des Gefäßes zu befördern. Warten Sie 30 Sekunden, zählen Sie anschließend die Gesamtzahl der betäubten Fliegen und notieren Sie diese.Bewerten Sie die Fliegen als sediert, wenn sie entweder auf dem Boden des Röhrchens stehen, aber nicht laufen, oder auf dem Rücken liegen, mit oder ohne Flügelschlagen. Behandeln Sie jedes Röhrchen innerhalb der Serie im Abstand von fünf Sekunden gemäß diesem Zeitplan: 7, 8, 9, 0 und 11 Minuten.Testen Sie die zweite, dritte, vierte, fünfte und sechste Vial-Serie jeweils wie die erste Serie nach 12 Minuten. Testen Sie die erste Serie mit vier Vials erneut und setzen Sie die Tests mit der zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Vial-Serie nach 13, 14, 15, 16 bzw. 17 Minuten fort. Setzen Sie die Tests an den Fliegen fort, bis alle betäubt sind.Geben Sie die Gesamtanzahl der Fliegen in jedem Gefäß im harten Test ein. Notieren Sie sensorisch unbewegliche oder tote Fliegen zum Zeitpunkt null basierend auf der Gesamtanzahl der Fliegen. Die Rohdaten aus dem Ethanol-Sedierungstest wurden in den Prozentsatz aktiver Fliegen in Abhängigkeit von der Zeit umgewandelt.Die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung wurde anhand der Primärdaten als Sedierungszeit 50 oder ST 50 quantifiziert. Die Zeit, die benötigt wird, bis 50 % der Fliegen sediert sind, oder die Fläche unter der Kurve bzw. AUC. Der Test erfasst die Effekte von RNAi gegen Calnexin 14 D im Nervensystem, die im Vergleich zu Kontrollen die Ethanol-Empfindlichkeit abschwächten, sowie die Mutation von scab und rouser, die die Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung erhöhte, und die Mutation von happy hour. Die abgeschwächte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol-Sedierung im Vergleich zu Kontrollen, sobald beherrscht.Diese Technik kann in anderthalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

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