利用自动化凝胶片段筛选提高环境水样制备的下一代测序文库质量

本视频演示了如何使用自动凝胶大小选择仪器，以在下一代测序平台中获得更优的读长。首先采集环境水样，并使其通过一系列滤膜，以系统分离真核生物、细菌及病毒尺寸的颗粒。通过离心进一步浓缩截留的细菌。

然后提取细菌DNA。提取的DNA用于构建文库，将接头和索引序列连接到片段化的DNA上。随后通过PCR扩增DNA，并将样品加载至电泳工作站中。

随后会自动选择特定范围内的DNA片段。基于芯片的毛细管电泳图谱分析以及进一步的生物信息学分析表明，该方法能够获得适用于下游分析的足量DNA片段，同时将200个碱基对以下的非目标片段的富集程度降至最低。自动化电泳方阵工作站或基于磁珠的其他商业系统的最主要优势在于，其可实现更精确、更窄的片段选择范围，并且单次运行可处理多达96个样本。

尽管该方法可用于研究淡水样本中的微生物群落，但它也可应用于其他系统，例如海水、废水处理样本、植物样本、沉积土壤或微生物垫，实质上适用于任何需要进行特定片段长度筛选的DNA样本。我们最初是在MySEQ测序平台中观察到短片段时萌生了该方法的想法。我们尝试了多种片段筛选方法，包括不同类型的磁珠及其比例，以及手动凝胶片段筛选方法。

随后，我们开始与 Coastal Genomics 合作，这是一家位于加拿大不列颠哥伦比亚省的私营公司，提供 Ranger 技术并演示该操作流程。今天参与的人员包括：我实验室的研究技术员 Michael Chan、我实验室的博士后研究员 Miguel Yi，以及来自 Coastal Genomics 的工程师 Jared Sloan。在本视频中，我们将仅描述从 0.2 微米滤膜上回收的材料的纯化与分析过程，这些材料主要为自由生活的细菌。但请记住，类似的方法也可用于滤膜上回收的其他颗粒物。

从多个环境采样点采集40升淡水样品，使用经过消毒的20升塑料桶盛装。在采样现场使用孔径为105微米的聚丙烯筛网对样品进行预过滤。此处的样品来自受城市和农业活动影响的流域。

采集后，将样品放入冷藏箱中并运回实验室。将样品在4 °C下保存。第二天。

建立一个过滤系统，该系统由样品收集瓶通过蠕动泵连接至一个 enviro check 一微米采样胶囊。将采样胶囊连接至一个0.2微米的圆盘滤膜，再通过第二个蠕动泵连接至一个30千道尔顿的切向流滤器。开启蠕动泵，使样品依次通过一系列滤膜，真核细胞在通过采样胶囊时将被分离出来。

细菌组分将被截留在膜圆盘过滤器上，而病毒颗粒将被截留在切向流过滤器上。从水过滤系统中取出0.2微米的膜过滤器或多个过滤器，然后将过滤器对折，放入一个50毫升的离心管中。

将开口朝上。向管中加入 5 毫升含吐温的 PBS。如果过滤过程中使用了多个滤膜，则每个滤膜需使用不同的管。

随后可将滤膜在4°C下保存，或立即按如下步骤进行处理。接下来，使用无菌镊子从50毫升离心管中取出膜滤器，并用无菌镊子和无菌剪刀将其放置于培养皿上。在不同样品之间，将滤膜剪切成1厘米×1厘米的小片。

将器械浸入70%异丙醇中，用DNA表面去污剂擦拭，然后用一级超纯水冲洗，以进行消毒。用无菌镊子将滤膜放回原来的50毫升离心管中。加入10毫升含吐温的PBS，使缓冲液体积总量达到15毫升。

向每个50毫升离心管中加入六颗直径为3毫米的洁净钨珠。用封口膜封住管口，涡旋振荡20分钟。

将每个样品的悬浮液在涡旋振荡后合并至一个洁净的50毫升离心管中。在4°C条件下，以3,300 ×g离心15分钟。离心结束后，弃去上清液，并重新悬浮沉淀。

在 5 毫升 PBS 溶液中，将细菌细胞分装至 1.7 毫升微量离心管中，每管 1 毫升，然后在微量离心机中以 10,000 ×g 离心 10 分钟。离心结束后，使用移液器吸除上清液，仅保留 200 微升。将样品储存在 −80 °C 下，或使用市售的 DNA 提取试剂盒提取细菌 DNA。

在细菌DNA提取过程中，使用PBS或水作为阴性提取对照，大肠杆菌（e coli）作为阳性提取对照。完成DNA提取步骤后，将同一样本的等分试样汇集至一个2毫升离心管中，加入10毫摩尔/升的Tris缓冲液。随后通过加入含有10%的3摩尔醋酸钠溶液、两倍体积的100%乙醇以及5微升线性聚丙烯酰胺的混合液进行过夜沉淀。将样品储存于-80摄氏度环境中。

次日，在 4°C 条件下以 17,000 ×g 离心样品 30 分钟。离心结束后，用 1 毫升冰预冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，并在生物安全柜中晾干，晾干时间不得超过 5 分钟。

然后将DNA沉淀重悬于10毫摩尔的Tris中。最后通过高灵敏度荧光核酸定量检测，再结合微量分光光度法，测定DNA的含量和质量。在确定各样品中DNA的含量后，向每根试管中加入适量的水，使浓度调整至约0.2纳克/微升。

使用市售试剂盒，从一纳克细菌 DNA 中制备带有索引的 DNA 文库片段。此处采用一种基于转座子的、称为“mentation”的方法，可同时将 DNA 片段化并连接上接头序列。随后通过 PCR 同时扩增并标记 ED 样本，从而在每个片段上添加特定的条形码，并引入测序平台可读取的、用于簇生成所需的序列。

完成PCR后，跳过标准的PCR产物纯化步骤，向每个样本中加入3.5 µL上样缓冲液，使总体积达到28.5 µL。然后将样本转移至96孔板中，并将该96孔板放入电泳工作站，在Ranger软件用户界面中使用预制的1.5%琼脂糖胶盒进行电泳分析。

选择500至800个碱基对的片段进行大小筛选。将洗脱体积设置为300微升。启动运行。

电泳工作站将自动把样品加载到 aros 胶盒中。然后对胶盒施加电压，并在整个运行过程中，使用安装在龙门架上的成像系统来确定样品 DNA 在 aros 中的位置。

Ranger 软件通过捕获图像并利用内部标准，估算每个样本中选定尺寸目标物的位置。在目标物被识别后，Ranger 软件会进行调整，以调节施加在每个样本上的电压，从而使目标物同步到达胶盒提取孔。

最后，电泳工作站从提取孔中吸取TBE中的目标物，并将其转移至新的96孔板中，以浓缩原始产物，并使用乙酸钠和乙醇在线性丙烯酰胺存在下于-80°C过夜沉淀原始洗脱体积。将样品再次在17,000 ×g下离心30分钟。离心后，弃去上清液，随后用1毫升冰冻的70%乙醇洗涤DNA沉淀，并离心。

将样品在17,000 ×g下离心30分钟，弃去上清液，干燥样品，最后将DNA沉淀重悬于10毫摩尔/升Tris-Cl中，然后使用文库标准化磁珠（包含在转座酶建库试剂盒中）对样品进行标准化。最后使用下一代测序平台进行DNA测序，以在下一代测序平台中获得更具信息量的读长，从而提高测序文库的质量。

在八个不同的流域地点采集了水样，并从分离的细菌组分中制备了索引DNA文库，如本电泳图所示。这些DNA文库由淡水样品经PCR扩增后生成，但在自动片段大小选择之前，其片段大小范围从50个碱基对至3000个碱基对不等。使用高通量自动化平台进行片段大小选择后，样品中DNA片段的大小集中在500至800个碱基对的狭窄范围内。因此，采用该自动化凝胶片段大小选择平台可获得适宜的产量，并显著减少200个碱基对以下非目标片段的富集。

在MiSeq测序仪上对该文库进行DNA测序，产生的簇密度为每平方毫米1198 K。通过滤波器的簇百分比为84.2%，预计产出为9.2吉字节。此外，7.4吉字节（占读长的82.8%）的读长质量值大于或等于30。

这意味着，采用此改良方案并应用于环境水样测序时，大约83%的测序碱基达到了至少99.9%的碱基识别准确率。观看本视频后，您应能充分理解如何从测序文库中获得更具信息量的结果。在执行该实验流程时，需牢记目标微生物组分、文库构建方法的选择、目标片段长度以及测序平台。