三维（3D）肿瘤球体侵袭试验

该程序的总体目标是提供肿瘤细胞侵袭的体外、半自动、三维微孔板测定。这是通过首先在超低附着圆底 96 孔板中的悬浮液中生成可重现大小的肿瘤类固醇来实现的，每个孔中同时在每孔中生成类固醇。第二步是去除部分培养基，并将基底膜（如基质或 BMM）直接添加到每个孔中，以提供肿瘤细胞从类固醇体侵入的半固体基质。

接下来，在 72 至 96 小时内每隔一段时间监测肿瘤类固醇侵袭，在此期间在细胞仪上自动或在显微镜上手动进行图像采集。最后一步是通过自动细胞仪或成像软件分析肿瘤细胞侵袭。最终，3D 肿瘤类固醇侵袭检测用于以更具生理相关性且适合靶向验证和药物筛选研究的形式在体外模拟癌症侵袭。

我们相信，这项技术是对癌症研究中通常用于靶点验证和药物筛选的简单二维细胞增殖测定的补充，因为它还使我们能够研究侵袭，这是以生理相关的三维格式进行癌症进展的一个关键方面。当我优化 3D 肿瘤 phe（微孔板上的生长）时，我第一次有了这种方法的想法。我认为使用相同的设置和观察侵袭情况会很好，结果很容易，只需从每个孔中取出一部分培养基，然后用类似基底膜的基质替换即可。

这种方法的视觉演示是必不可少的，因为在 BMM 的传统之后，将类固醇保持在每个孔的中心位置在开始时可能很困难。由于类固醇位于不同的焦平面上，这可能会导致图像分析不理想。凭经验。

这种情况很少发生，但如有必要，可以通过对板进行温和离心来促进该过程。要在 ICE 上开始过夜的所有 BMM，请保留一组用于 P 10 E 200 和 P 1000 移液器的无菌过滤嘴，无菌管的温度为零下 20 摄氏度。还将含有 4 天龄类固醇的超低附着 96 孔板置于冰上。

使用多通道移液器，从麻雀板中轻轻去除每孔 100 微升的生长培养基。对于该步长，将尖端朝向 U 形底部的内壁。避免接触井底和球体的位置。

为了尽量减少使用冰冷尖端对类固醇的干扰，请将 BMM 转移到冰冷的管中。对于细胞因子诱导的侵袭或药物评估研究，使用冰冷的尖端向 BMM 中添加试剂。例如，使用表皮生长因子或 EGF 刺激 Cal S 和 cal r 鳞状癌细胞的侵袭。

然后将 100 微升 BMM 轻轻分配到 ubo 中。将尖端对准井的内壁。这一步是最关键的。

至于光学图像分析，类固醇必须保持在 Well 的中心。对所有需要的孔重复此步骤，每个条件允许 5 到 6 次重复。如有必要，使用无菌针头更换为新鲜冷却的尖端。

如果存在气泡，请去除气泡。使用显微镜目视检查类固醇是否处于中心位置，如果它们没有以 300 倍 G 离心板，在 4 摄氏度下离心 3 分钟。这将确保类固醇位于每个孔的中心。

接下来，将板转移到 37 摄氏度的培养箱中，让 BMM 在一小时后凝固。使用多通道移液器轻轻添加 100 μL 的完全生长的每孔。培养基或细胞因子诱导的侵袭或药物评估研究。

在培养基中加入细胞因子或抑制剂，用于自动图像采集。每隔一段时间在细胞仪上扫描板。从时间 0 开始，选择 Confluence 应用程序。

然后检查类固醇是否在焦点上。如果需要，请手动调整焦距并固定焦距偏移。在 sampling settings （采样设置） 下。

选择器扫描一个中央视野。添加 BMM 后，肿瘤类固醇应保持在中心位置。因此，无需在软件中扫描整个孔。

通过在板图上突出显示要扫描的孔来定义它们。然后点击开始扫描。对于自动图像分析，请选择 Confluence 应用程序。

在分析选项卡中，调整应用程序设置以围绕类固醇生成精确分割，包括细胞过程和延伸到 BMM 的入侵者足。调整每个肿瘤细胞系和/或不同时间点的设置。通过单击几个不同的孔，检查分析设置是否适用于板中的其他类固醇。

如果分割不能准确勾勒出类固醇，请进一步调整应用程序设置。单击 results （结果） 选项卡上的 Start analysis （开始分析）。在将孔位数据导出到电子表格程序之前，检查多个孔以验证分析质量。

对所有时间点重复分析，然后在条形图中计算重复孔的平均汇合百分比和随时间变化的侵袭。使用选择的科学绘图和统计软件进行手动图像采集，使用配备 10 倍物镜的倒置显微镜间隔记录每种肿瘤类固醇的图像。从 T 开始等于零，T 等于 72 到 96 小时之间。

根据相关细胞衬里的侵入速度，当侵入区域太大而无法在 10 x 视野内完全捕获时，使用外汇物镜。保存采集的每张图像以进行手动图像分析。将舞台图形图像打开到成像分析中。

校准的首选软件是阶段图形采集的图像。同时使用 10 x 和 4 x 物镜。输入图形测量值、单位和使用的物镜，然后执行校准。

后续图像分析只需要此步骤一次。只需重新加载所需的校准设置即可。接下来，打开侵袭分析图像并根据用于获取图像的显微镜物镜选择校准设置。

在此处使用的软件中测量类固醇覆盖的区域。转到 measure 并选择 count size。选择同时然后加载设置并选择预定的分析设置。

然后选择 count （计数）。然后应准确分割类固醇。将测量值是不同的参数导出到电子表格，并在电子表格上记录相关的图像信息。

最后，使用科学绘图和统计软件绘制复制类固醇或侵袭的平均面积与时间的关系。此处显示为在 U 87 MG 胶质母细胞瘤细胞系中观察到的癌细胞侵袭的实例，可用于例证脑肿瘤侵袭。一旦嵌入以典型的星爆侵袭模式扩散的 BMM 细胞中，该过程将在 72 小时内进行跟踪。

全自动图像分析。使用图像细胞仪可在细胞突起周围产生分割，并能够精确定量肿瘤细胞侵袭。请注意，对于该细胞系，类固醇体被排除在侵袭区域的测量之外。

全自动图像分析易于执行，并提供肿瘤细胞侵袭随时间变化的量化。人类鳞状细胞、头颈部等源性细胞侵袭表现出不同的模式。癌细胞系 Cal S 对 EG FFR 酪氨酸激酶抑制剂敏感，CAL R 对 EG FFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药。

在没有 EGF 的情况下，在 EGF 指状突起存在的情况下，两种细胞系都没有侵入 BMM，这些突起是从 Cal ars 类固醇的主体挤出的。虽然 Cal s 细胞在 72 小时后侵入性较小，但在这种情况下，使用图像细胞仪快速获取图像，为了举例说明另一种方法，使用独立的图像分析软件手动量化侵袭程度在尝试此程序时，重要的是要记住，每个细胞系都需要优化其形成类固醇的能力， 细胞接种密度、基质组成以及图像和分析设置遵循此过程。同样的方法也可以适用于评估 3D 组织侵袭，例如，使用与胚胎体共培养的肿瘤类似于复杂组织或其他类器官，如用于神经胶质瘤的星形胶质细胞或胃肠道癌症的隐窝培养物，或肝细胞癌和结肠癌转移的肝脏。