三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

本实验的总体目标是提供一种体外、半自动化的三维微孔板检测方法，用于评估肿瘤细胞的侵袭能力。该方法首先在超低吸附圆底96孔板中悬浮培养肿瘤细胞，一次性在每个孔中形成大小可重复的肿瘤类球体。第二步是移除部分培养基，并向每个孔直接加入基底膜样基质（BMM），从而形成一种半固体基质，使肿瘤细胞能够从类球体结构中向基质内侵袭。

接下来，在72至96小时的时间段内定期监测肿瘤类固醇侵袭过程，期间可在细胞计数仪上自动或在显微镜下手动进行图像采集。最后一步是通过自动细胞计数仪或成像软件分析肿瘤细胞的侵袭情况。最终，该三维肿瘤类固醇侵袭实验可用于在体外建立更符合生理条件的癌症侵袭模型，并适用于靶点验证和药物筛选研究。

我们认为，该技术是对癌症研究中通常用于靶点验证和药物筛选的简单二维细胞增殖检测方法的有益补充，因为它还能使我们在具有生理相关性的三维环境中研究癌症进展的关键特征——侵袭。我最初产生这一方法的想法，是在优化微孔板上3D肿瘤表型生长条件时。当时我认为，若能在相同的实验体系中进一步观察细胞侵袭行为，将会很有价值；结果发现，只需从每个孔中移除部分培养基，并替换为类似基底膜的基质，即可轻松实现。

该方法的可视化演示至关重要，因为在BMM传统培养后，将类固醇保持在每个孔的中央位置在初期可能较为困难。这可能导致类固醇位于不同的焦平面，从而造成图像分析不理想。随着经验的积累，这一问题可得到改善。

这种情况很少发生，但如有必要，可通过轻轻离心培养板来促进该过程。为开始所有BMM在冰上过夜孵育，请准备一套用于P10、P200和P1000移液器的无菌滤芯吸头，以及无菌离心管，并将其置于-20摄氏度保存。同时，将含有四天龄类固醇的超低吸附96孔板置于冰上。

使用多通道移液器，从麻雀培养板的每个孔中轻轻吸出 100 微升生长培养基。此步骤中，将吸头倾斜朝向 U 形底孔的内壁，避免接触孔底以及类球体所在位置。

为尽量减少类固醇的干扰，使用预冷的枪头将BMM转移至预冷的离心管中。对于细胞因子诱导侵袭或药物评价研究，使用预冷的枪头向BMM中添加试剂。例如，可使用表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）刺激Cal S和cal r鳞状细胞癌细胞的侵袭。

然后轻轻将100微升BMM加入至ubо. 井中，将枪头对准井壁内侧。此步骤最为关键。

对于光学图像分析，类固醇必须保持在孔的中央。对所有需要的孔重复此步骤，每种条件设置五到六个重复。如有必要，使用无菌针头更换为新预冷的吸头。

如有气泡，请去除。使用显微镜观察类固醇是否位于中央位置；若不在中央，则在4°C条件下以300 × g离心3分钟。此步骤可确保类固醇位于每个孔的中央位置。

接着，将培养板转移至37摄氏度的培养箱中，静置1小时使BMM凝固。使用多通道移液器轻轻向每孔加入100 µL完全培养基，用于细胞生长、细胞因子诱导侵袭或药物评价实验。

在培养基中加入细胞因子或抑制剂以进行自动图像采集。以一定时间间隔在流式细胞仪上扫描培养板。从零时间点开始，选择汇合度分析应用。

然后检查类固醇是否处于焦点。如有需要，在采样设置下手动调整焦点并校正焦点偏移。

选择扫描一个中心视野。加入BMM后，肿瘤类固醇应保持在中心位置，因此无需在软件中扫描整个孔板。

通过在孔板图上高亮显示待扫描的孔来定义扫描区域，然后点击开始扫描。对于自动图像分析，请选择汇合度分析应用。

在分析选项卡中，调整应用程序设置，以在类固醇周围生成精确的分割，包括延伸至骨髓微环境（BMM）中的细胞突起和侵袭性伪足。针对每种肿瘤细胞系或不同时间点调整设置。通过点击若干不同的孔，检查分析设置是否适用于该孔板中的其他类固醇。

如果分割未能准确勾勒出类固醇的轮廓，请进一步调整应用程序设置。在结果选项卡上单击“开始分析”。在将孔级别的数据导出到电子表格程序之前，检查多个孔以确认分析质量。

对所有时间点重复上述分析，然后计算复孔的平均汇合百分比，并以柱状图形式绘制侵袭率随时间的变化。对于手动图像采集，使用您选择的科学绘图与统计分析软件，采用配备10倍物镜的倒置显微镜，在T=0开始，每隔一定时间点对每个肿瘤类固醇处理组记录一张图像，持续至T=72至96小时之间。

根据所研究细胞层侵袭速度的快慢，当侵袭区域过大而无法在10倍视野内完整捕获时，应使用Forex物镜。保存所获取的每一张单独图像，用于人工图像分析。将载物台扫描图像导入图像分析软件中进行分析。

校准所用的软件需获取载物台测微尺的图像。使用10倍和4倍物镜进行拍摄。输入图像中的测量值、单位以及所用物镜，并执行校准。

此步骤仅需在后续图像分析中执行一次。只需重新加载所需的校准设置即可。接下来，打开侵袭实验图像，并根据获取图像时所用的显微镜物镜选择相应的校准设置。

使用此处所用软件测量类固醇覆盖的面积。进入“测量”并选择“计数大小”。选择“同时”然后加载设置，并选择预先确定的检测设置。

然后选择计数。应准确分割类固醇区域。将测量结果的不同参数导出至电子表格，并在电子表格中记录相关的图像信息。

最后，使用科学作图和统计软件绘制重复类固醇或侵袭的平均面积随时间变化的曲线。此处以U 87 MG胶质母细胞瘤细胞系中观察到的癌细胞侵袭为例，可用于说明脑肿瘤的侵袭过程。一旦嵌入BMM中，细胞便以典型的星爆样侵袭模式扩散，并在72小时的时间段内持续观察该过程。

全自动图像分析。使用图像细胞仪可对细胞突起进行分割，并实现肿瘤细胞侵袭的精确量化。请注意，对于该细胞系，类固醇体不包含在侵袭面积的测量范围内。

完全自动化的图像分析可轻松完成，并能随时间定量评估肿瘤细胞的侵袭情况。人源鳞状细胞、头颈部同基因型癌细胞系表现出不同的细胞侵袭模式。Cal S细胞系对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感，而CAL R细胞系则具有耐药性。

在无 EGF 的情况下，两种细胞系均未侵入 BMM；而在含有 EGF 时，Cal ars 类固醇细胞主体伸出指状突起。尽管 Cal s 细胞在 72 小时后侵袭性较低，但本实验中图像通过成像细胞仪快速获取；为示例另一种方法，侵袭程度通过独立的图像分析软件进行手动量化。在执行该操作流程时，需注意每种细胞系均需优化其形成类固醇的能力、细胞接种密度、基质成分以及图像采集与分析参数。该方法亦可进一步调整，用于评估三维组织侵袭，例如将肿瘤细胞与类胚胎体共培养以模拟复杂组织，或使用星形胶质细胞类器官模拟胶质瘤、隐窝培养模拟胃肠道癌症，或利用肝脏模型研究肝细胞癌及结肠癌转移。