Name: 三维（3D）肿瘤球体侵袭试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习三维肿瘤球体侵袭试验方法，利用超低吸附微孔板生成肿瘤球体，并加入基底膜样基质模拟生理环境，通过自动化成像监测72至96小时的癌细胞侵袭过程。该技术可用于药物筛选和靶点验证研究。

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本工作由英国动物实验替代、优化与减少国家中心（The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research，资助号：G1000121 ID no.94513）和Oracle癌症信托基金资助。SE由英国癌症研究所（The Institute of Cancer Research）和英国癌症研究组织（Cancer Research UK，资助号：C309/A8274）支持。我们感谢英国国家卫生服务体系（NHS）对国家卫生研究所生物医学研究中心（NIHR Biomedical Research Centre）的资助。

1. 生成大小可重复的肿瘤球体
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS；25 cm2 培养瓶使用 5 ml，75 cm2 培养瓶使用 8–10 ml）洗涤肿瘤细胞单层，加入细胞解离酶（25 cm2 培养瓶使用 1 ml，75 cm2 培养瓶使用 2 ml），于 37 °C 孵育 2–5 分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞脱落情况，并用完全培养基（25 cm2 培养瓶使用 5 ml，75 cm2 培养瓶使用 8 ml）中和细胞解离酶。</li>
	<li>将细胞悬液以 500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，轻弹离心管，使用 P1000 移液器将细胞沉淀重悬于 1 ml 完全培养基中，以获得无细胞团块的单细胞悬液。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞悬液稀释至 0.5–2 × 104 个细胞/ml（最佳细胞密度需根据每种细胞系优化，以确保接种后 4 天形成直径为 300–500 µm 的肿瘤球体12,13）。</li>
	<li>将细胞悬液转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将 200 µl/孔加入超低吸附（ULA）96 孔圆底板中12。</li>
	<li>将培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。4 天后，通过肉眼确认肿瘤球体形成，并继续进行三维侵袭实验。</li>
</ol>
2. 三维肿瘤球体侵袭实验
<ol>
	<li>将BMM置于冰上解冻。</li>
	<li>在-20 °C下保存一套用于P10、P200和P1000移液器的无菌滤芯吸头，以及无菌离心管（体积为1.5 ml或更大，根据所需总体积确定）。</li>
	<li>将含有4天龄类球体的ULA 96孔板置于冰上。</li>
	<li>使用多通道移液器，轻轻从类球体培养板的每孔中移除100 µl培养基。操作时将吸头倾斜朝向U型底孔的内壁，避免接触孔底及类球体所在位置，尽量减少对类球体的扰动。</li>
	<li>使用预冷的吸头，将BMM转移至预冷的离心管中。若进行细胞因子诱导侵袭实验或药物评价研究，使用预冷吸头向BMM中加入试剂（终浓度的2倍）。例如，使用表皮生长因子（EGF）刺激CALS和CALR鳞状细胞癌细胞的侵袭。轻轻旋转混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>轻轻将100 µl BMM加入U型底孔中，将吸头对准孔的内壁缓慢加入。此步骤最为关键，为获得最佳图像分析结果，类球体必须保持在孔的中央位置12。</li>
	<li>对所有需要的孔重复步骤2.6，每组条件设置5–6个重复。如有必要，更换为新预冷的吸头。 
	注意：当操作熟练后，可使用多通道移液器加入BMM。</li>
	<li>使用无菌针头去除可能出现的气泡。
	<ol>
		<li>在显微镜下观察，确认类球体位于孔中央。若未居中，将培养板在4 °C下以300 × g离心3分钟，以确保每个孔中的类球体均位于中央。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板转移至37 °C培养箱中，使BMM凝固。</li>
	<li>1小时后，使用多通道移液器轻轻向每孔加入100 µl完全培养基。对于细胞因子诱导侵袭或药物评价实验，培养基中应包含细胞因子或抑制剂（终浓度1倍）。或者，若在步骤2.5中未向BMM中添加试剂，则可在本步骤将试剂加入培养基中（终浓度3倍）。</li>
</ol>
3. 自动化图像采集
<ol>
	<li>在细胞仪上（仪器规格见设备与材料表）进行扫描，时间点从零时开始（t0 = 侵袭实验建立当天，即完成步骤2.10后立即开始），持续至72小时，或对于侵袭较慢的肿瘤细胞系可延长至96小时。</li>
	<li>选择“汇合度”应用。</li>
	<li>检查类球体是否处于焦点位置，如有需要，手动调整并固定“焦点偏移”。</li>
	<li>在“采样设置”下，选择扫描一个中央视野（FOV）。加入骨髓来源细胞（BMM）后，肿瘤类球体应仍位于孔中央位置，因此无需扫描整个孔。</li>
	<li>在软件中通过在孔板图上高亮标记待扫描的孔来定义扫描区域，点击“开始扫描”。 
	注：扫描结果将自动保存，后续可离线查看。</li>
</ol>
4. 自动化图像分析
<ol>
	<li>选择“Confluence”应用程序。</li>
	<li>在“Analysis”选项卡中，调整应用程序设置（例如，“precision”：低、正常、高；“intensity threshold”：1 - 15），以在类球体周围生成精确的分割，包括延伸至BMM中的细胞突起和侵袭伪足（见图1）。针对每种肿瘤细胞系和/或不同时间点调整设置。“Confluence”应用程序将测量所选视野（FOV）中侵袭细胞覆盖孔板区域的百分比。</li>
	<li>通过点击多个不同的孔，检查分析设置是否适用于该孔板中的其他类球体（即，分割是否准确）。如果分割未能准确勾勒出类球体轮廓，请进一步调整应用程序设置。</li>
	<li>点击“Start analysis”。</li>
	<li>在“Results”选项卡中，检查多个孔以验证分析质量。将“Well level data”导出至电子表格程序。</li>
	<li>对所有时间点重复分析。计算重复孔的平均%汇合度，并使用选定的科学绘图与统计软件，以柱状图形式绘制侵袭程度（%汇合度）随时间的变化。</li>
</ol>
5. 手动图像采集
<ol>
	<li>使用倒置显微镜，从 t = 0 开始，每隔一定时间记录每个肿瘤球体的图像，持续至 72–96 小时，具体时间取决于所用细胞系的侵袭速度（对于 96 孔板，此过程约需 20–30 分钟）。使用 10X 物镜；当侵袭区域过大，无法在 10X 视野中完整成像时，改用 4X 物镜。</li>
	<li>保存所获取的每幅单独图像。</li>
	<li>为进行校准，分别使用 10X 和 4X 物镜拍摄载物台测微尺（1 mm）的图像（并保存图像）。</li>
</ol>
6. 手动图像分析
<ol>
	<li>将载物台测微尺图像导入所选的图像分析软件中。</li>
	<li>输入测微尺的测量值、单位（µm）、所使用的物镜（10X 或 4X），并执行校准。此步骤仅需进行一次。后续进行图像分析时，只需重新加载所需的校准设置即可。</li>
	<li>打开侵袭实验图像，并根据获取图像时所使用的显微镜物镜（10X 或 4X）选择相应的校准设置。
	<ol>
		<li>或者，导入在成像细胞仪上获得的图像（步骤 3），并按照使用倒置显微镜获得图像的描述进行手动分析（参见 图 3 和 图 4 所示结果）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量类球体所覆盖的面积。
	<ol>
		<li>在本研究代表性结果中所使用的软件（设备与材料表中提供具体规格）中，进入 “测量” 并选择 “计数/尺寸”。选择 “文件”，然后选择 “加载设置”，并载入预先确定的实验设置。接着选择 “计数”，类球体将被准确分割。</li>
		<li>或者，进入 “编辑”，然后选择 “绘制/合并对象”，以打开 “魔棒/描迹” 窗口。使用魔棒光标点击类球体图像以实现分割。在 “魔棒” 窗口中选择 “描迹”，用鼠标手动勾勒类球体轮廓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将不同参数（面积、直径、周长 等）的测量结果导出至电子表格。在电子表格中记录相关图像信息（例如，孔号、相对时间点）。</li>
	<li>使用科学绘图与统计软件，绘制重复类球体的平均面积（侵袭）随时间变化的曲线。或者，计算每个时间点相对于 t = 0 时的类球体面积变化，然后绘制侵袭率（% t0）随时间变化的线性图。</li>
</ol>

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</ol>

开放获取费用由 Nexcelom Bioscience, LLC 支持。

此处描述的两种肿瘤模型（胶质母细胞瘤和头颈部鳞状细胞癌）被特别选定用于示范我们的三维检测方法，因为它们是临床上具有局部侵袭性的癌症，且目前尚缺乏有效的治疗手段。12药物处理后，进行评估 体外 药效学（PD）生物标志物的变化可通过以下方法轻松检测：使用特定的市售试剂处理后，通过裂解物的蛋白质印迹法或免疫分析法检测骨髓微环境（BMM）中细胞回收后的变化；或通过整体染色法对侵袭性肿瘤类球体进行免疫荧光分析。
该侵袭实验是一种用于快速、可重复地评估肿瘤细胞侵入半固体培养基的实用技术，因此特别适用于未来 体外 药物筛选。癌细胞从代表“微肿瘤”的肿瘤球体向外扩散，以三维方式侵袭基质，延伸至类似细胞外基质的环境。该检测方法的真正三维特性体现在细胞形态上，这与细胞在固体基底上迁移时所呈现的扁平、贴壁形态明显不同。侵袭程度可通过成像细胞仪进行量化，实现自动化读取；也可结合普通显微镜与成像软件进行评估。此外，该方法适用于荧光成像。13 （例如表达荧光蛋白的细胞系或经荧光染料预先标记的细胞）。
该方法操作简便，唯一关键的步骤是添加BMM时需谨慎，因为存在扰乱球状体在U型孔中中心位置的风险。这可能导致图像分析不理想，使球状体处于不同的焦平面。因此，必须小心且缓慢地向每个孔中添加BMM。添加BMM后，建议在显微镜下检查培养板；若发现定位不理想，可通过轻柔离心进行纠正。随着操作经验的积累，这种情况很少发生。尽管该方法稳定且重复性高，但不同批次的BMM仍可能引起实验间的变异。为避免此问题，建议从同一批次购买足够的BMM，以完成一系列研究。
该方法的一个局限性（与其他类似检测方法一样）在于难以区分肿瘤细胞在检测时间范围内可能同时发生的侵袭与增殖。尽管可以考虑细胞的倍增时间，或引入细胞周期抑制剂如细胞松弛素D，但仍难以有效控制或明确区分肿瘤进展中的这两个不同方面，尤其是对于生长迅速的肿瘤细胞，以及那些呈“扩张性”而非浸润性侵袭模式的细胞。因此，建议同时开展平行的三维生长检测，以评估任何抑制性或刺激性试剂的特异性效应。若进行严谨的剂量-反应研究，可能能够选择出对增殖影响最小的药物浓度。例如，我们已证明HSP90抑制剂17-AAG在24小时时即可抑制U-87 MG三维肿瘤球体的侵袭，且其有效浓度低于抑制三维生长50%（GI50）的浓度12。
另一方面，与其它标准侵袭实验（例如，基于滤膜的实验或单细胞侵入三维基质的实验1）相比，该实验的重要意义在于，肿瘤细胞从类球体结构侵入周围基质，而该类球体结构模拟了“微肿瘤”或“微转移灶”，因而能够反映肿瘤团块病理生理学中的重要特征。我们所介绍的方法不仅能够提供肿瘤细胞最初离开类球体时的集体行为信息，还能揭示单个细胞到达BMM中较远区域时的个体行为。此外，肿瘤类球体内部的细胞可能经历缺氧和营养缺乏，这些条件通过改变基因表达促进细胞迁移和侵袭；而此类特征在二维实验中并不存在。更重要的是，通过使用特定的96孔板和最新的成像技术，该实验可实现高通量操作，使得这一更为复杂的三维实验能够便捷地应用于靶点验证和药物发现。
我们提出的方法可进一步拓展应用于研究肿瘤细胞侵袭的其他方面。特别是，可通过在类球体本身或其周围基质中加入宿主细胞（如成纤维细胞和/或内皮细胞）来增加实验的复杂性。此外，该模型不仅可通过使用不同浓度的BMM来调节基质刚度，还可根据所采用的肿瘤模型对应的特定组织/器官，通过添加其他组分来改变基质的组成： 例如， 脑癌中的腱生蛋白16 以及乳腺癌的胶原蛋白17).
类似的实验设置（类球体的生成与成像）也可用于评估三维环境中的组织侵袭，其中肿瘤类球体与模拟复杂组织的类胚胎体进行共培养12 或其他细胞特异性类器官（例如，星形胶质细胞用于胶质瘤研究18 或胃肠道癌症的类器官培养），但需要进一步工作以实现自动化的图像分析。

传统的抗癌药物研发主要集中在利用体外细胞实验筛选能够抑制肿瘤细胞增殖和/或促进程序性细胞死亡（凋亡）的细胞毒性药物。近年来，研究逐渐转向靶向治疗，开发针对恶性细胞增殖根本分子机制的抑制剂。尽管取得了一些显著成果，但这类药物常伴随快速出现的耐药性问题。鉴于肿瘤细胞的侵袭和转移潜能是导致大多数癌症死亡的原因，且复发性疾病通常表现出更具侵袭性的表型，因此有必要同时考虑采用互补的体外实验模型1,2，以发现能够抑制癌症其他关键“标志性特征”的新型药物。
在恶性进展过程中，肿瘤细胞获得侵入周围组织和/或扩散至远端器官（转移）的能力。癌细胞通过形成侵袭性伪足穿透基底膜3,4。这些结构富含肌动蛋白丝、特定的黏附蛋白和蛋白酶，共同介导肿瘤细胞的运动能力以及细胞外基质（ECM）的降解5。侵袭性伪足向细胞外基质延伸，被认为在肿瘤细胞侵袭以及进入血管通道的外渗过程中发挥重要作用，从而促进血行（或淋巴）播散和转移。
评估肿瘤细胞侵袭的当前标准方法 体外 包括以下内容：基于 Transwell 的实验或 Boyden 小室实验2,6 将单细胞悬液接种于涂有厚层细胞外基质（ECM）来源蛋白的滤膜上方。细胞在趋化因子的诱导下侵袭并迁移至下室。常用的ECM蛋白包括I型胶原或类基底膜基质（BMM， 例如，Matrigel，源自EHS肿瘤7) 模拟天然基底膜成分的基质。
与基于滤膜的Boyden小室类实验方法8相比，可将细胞接种于细胞外基质（ECM）凝胶表面（也可在其中加入成纤维细胞），使其形成单层，随后细胞可单独或集体侵入凝胶中。侵袭能力可通过侵入凝胶的细胞数量和/或细胞从凝胶表面迁移的距离来评估9。肿瘤细胞也可完全包埋于基质中，以单细胞悬液或球状体形式存在——通常置于两层ECM凝胶之间——从而允许细胞从肿瘤团块向外侵入周围基质2,6,10,11。
三维肿瘤球体侵袭实验方法描述了一种快速、可自动化的侵袭检测系统，采用高度可重复且标准化的方法12 在96孔板中以每孔一个球状体的形式进行。将BMM直接加入每个孔中，以形成半固体基质，使肿瘤细胞从球状体主体向外侵袭。在72至96小时的时间内，定期监测肿瘤细胞的侵袭程度。该方法相较于现有方法具有以下优势 体外 上述侵袭实验：肿瘤细胞被组织成模拟肿瘤微区域或微转移灶的三维结构；肿瘤球体在大小上具有高度可重复性；侵袭实验由此开展 原位 在同一块培养板中即可实现肿瘤类球体的培养，无需将其转移至次级培养板；该方法结合最新的自动图像分析技术，能够同时进行高内涵和高通量的肿瘤细胞侵袭分析。
使用成像细胞仪进行图像分析，可在10分钟内完成对96孔板的扫描。通过使用汇合度分析应用，可动态测量单个细胞或由肿瘤类球体扩散并侵入基质的细胞簇所达到的侵袭范围和侵袭速率。对于通量较低的情况，本文还提供了一种基于倒置显微镜和标准成像软件的替代性图像分析方法。

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>保存于 4 &amp;deg;C 以防止凝固，使用预冷的移液器吸头进行分装</td></tr><tr><td>Cultrex 基底膜提取物，PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>保存于 4 &amp;deg;C 以防止凝固，使用预冷的移液器吸头进行分装</td></tr><tr><td>超低吸附 96 孔板</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>将 100 &amp;mu;l 含 1% BSA (w/v) 的水溶液加入 100 &amp;mu;g EGF 中。取其中 25 &amp;mu;l，加入 4,975 &amp;mu;l RHB-A 培养基，配制成 5 &amp;mu;g/ml 的工作液。分装后保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RHB-A 培养基</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>用于稀释 EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>使用前于 56 &amp;deg;C 加热以灭活补体</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>Celigo 细胞计数仪</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>用于图像采集与分析的专用设备。也可采用显微镜手动采集图像，并结合独立的图像分析软件进行替代</td></tr><tr><td>IX70 倒置显微镜</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>配合相机用于手动图像采集</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 数字相机</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>连接至显微镜用于手动图像采集</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>用于控制相机和显微镜进行手动图像采集的软件</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>用于手动测量类球体大小的独立图像分析软件</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>科学绘图与统计分析软件</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>科学绘图与统计分析软件</td></tr></tbody></table>

三维（3d）肿瘤球体侵袭实验

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

侵袭周围正常组织通常被认为是恶性肿瘤（相对于良性肿瘤）的关键特征之一。对于某些特定癌症而言（例如脑肿瘤，例如 多形性胶质母细胞瘤 以及头颈部鳞状细胞癌（SCCHN），可导致严重的发病率，即使在无远处转移的情况下也可能危及生命。此外，不幸的是，经治疗后复发的癌症常表现出更具侵袭性的表型。因此，靶向侵袭过程以开发可与标准抗增殖药物联用的新型疗法具有重要意义。迄今为止，由于缺乏适用于侵袭行为深入分析及药物筛选的稳定、可重复的实验方法，这一策略一直受到限制。本文介绍一种基于均一、自组装三维肿瘤球的简单微孔板方法，该方法在上述研究中具有巨大潜力。我们以人胶质母细胞瘤细胞系及一种对靶向表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂产生耐药性且伴随基质侵袭能力增强的SCCHN模型为例，展示了该检测平台的应用。同时，我们提供了两种半自动定量分析方法：一种使用成像细胞仪，另一种仅需标准显微镜、数字图像采集与图像分析软件。

采用一种简单、可重复且自动化的检测方法评估三维肿瘤球体侵袭能力，该方法如图1所示：通过将细胞接种至ULA 96孔圆底培养板中，获得大小均一的肿瘤球体。在成球4天后，将球体包埋于BMM中，形成一种半固体结构，使肿瘤细胞从中向外侵袭并扩散。球体位于每孔底部中央，可利用成像细胞仪从t = 0开始，间隔监测其在BMM中的侵袭情况，持续至72–96小时。该方法可实现完全自动化的图像分析。
不同类型的癌细胞侵袭示例见图2 - 4。高度恶性的人多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞系U-87 MG可形成紧密的球形三维结构，本研究中用以代表局部侵袭为关键致死特征的脑肿瘤。当嵌入基底膜基质（BMM）后，U-87 MG类球体的细胞以典型的“星爆样”模式扩散12。肿瘤细胞呈放射状伸入基质中，并保持其三维形态。该过程在72小时内持续观察，如图2中U-87 MG类球体所示，肿瘤细胞侵袭范围、细胞过程细节以及侵袭伪足向BMM的延伸均清晰可见。利用图像细胞仪进行全自动图像分析，可实现对肿瘤细胞随时间推移的侵袭程度进行精确定量。如图1所示，图2中的定量结果通过自动分析获得，该分析对从U-87 MG类球体主体延伸至BMM中的细胞突起周围进行分割。请注意，对于该细胞系，肿瘤类球体主体不包含在侵袭区域的测量范围内。
人源鳞状头颈癌细胞系表现出不同的侵袭模式。CALS 和 CALR 为同源细胞系，但 CALS 对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂敏感，而 CALR 具有耐药性14。在无 EGF 存在时，两种细胞系均未侵入基底膜基质（BMM）（图 3）；然而，随着 EGF 浓度增加（至 2.5 ng/ml），类球体出现“出芽”现象。在更高浓度的 EGF（40 和 80 ng/ml）条件下，侵袭程度反而降低。这与既往报道的 EGF 在侵袭方面所呈现的经典钟形剂量反应曲线一致15。在含 20 ng/ml EGF 的条件下，CALR 类球体主体伸出指状突起，而 CALS 细胞在 72 小时后侵袭性较弱（图 3）。这种差异性侵袭在类球体接种至 BMM 后 48 小时即可观察到（BMM 中含 20 ng/ml EGF，以最大化区分两种细胞系），并在 72 小时时最为显著（图 4）。这些图像通过成像细胞仪快速获取，方法与 U-87 MG 相同。然而，在本实验中，为展示另一种分析方法，侵袭程度通过独立的图像分析软件进行人工量化，并以图形形式呈现（图 3 和 图 4）。这些结果揭示了药物敏感与耐药细胞之间的一种表型差异，该差异可用于筛选特异性拮抗耐药且具侵袭性表型的化合物。
<img alt="肿瘤类球体培养过程、96孔板及使用Celigo细胞计数仪进行分析的实验示意图。" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 三维肿瘤类球体侵袭实验的示意图。该工作流程展示了本方法所包含的各个步骤，并附有U-87 MG胶质母细胞瘤类球体在嵌入基底膜基质（BMM）后（上图；t = 0）以及侵袭进入BMM后（下图；t = 72小时）的代表性图像，图像中包含或不包含用于测量侵袭细胞覆盖面积的分割轮廓。标尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>
<img alt="随时间推移的细胞侵袭；显微镜图像，0-72小时生长情况；侵袭百分比柱状图。" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. U-87 MG 胶质母细胞瘤类球体在 BMM 中的侵袭时间进程。 使用成像细胞仪监测并量化了 U-87 MG 类球体在 BMM 中的三维侵袭过程，持续至72小时。(A) 代表性图像和 (B) 肿瘤细胞侵袭的量化结果。标尺 = 500 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官侵袭实验；显微镜图像、EGF浓度、侵袭百分比与EGF的关系图。" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. CALR（耐药型）和 CALS（敏感型）肿瘤类球体的侵袭能力。 (A) 代表性图像和 (B) EGF 剂量依赖性 CALR 与 CALS 肿瘤类球体侵袭的手动定量分析结果。标尺 = 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞侵袭实验，CALS 与 CALR，0-72 小时显微镜图像，含侵袭率图谱分析。" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图 4. 将CALR（耐药型）类球体细胞与 CALS（敏感型）肿瘤类球体细胞置于骨髓微环境（BMM）中时，前者表现出更强的侵袭性。 在 EGF 刺激下，CALR 肿瘤类球体的侵袭程度较 CALS 更显著。（A）代表性图像与（B）侵袭程度的手动定量分析结果如图所示。标尺 = 500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

侵袭周围正常组织通常被认为是恶性肿瘤（相对于良性肿瘤）的关键特征之一。对于某些癌症而言……

本实验的总体目标是提供一种体外、半自动化的三维微孔板检测方法，用于评估肿瘤细胞的侵袭能力。该方法首先在超低吸附圆底96孔板中悬浮培养肿瘤细胞，一次性在每个孔中形成大小可重复的肿瘤类球体。第二步是移除部分培养基，并向每个孔直接加入基底膜样基质（BMM），从而形成一种半固体基质，使肿瘤细胞能够从类球体结构中向基质内侵袭。接下来，在72至96小时的时间段内定期监测肿瘤类固醇侵袭过程，期间可在细胞计数仪上自动或在显微镜下手动进行图像采集。最后一步是通过自动细胞计数仪或成像软件分析肿瘤细胞的侵袭情况。最终，该三维肿瘤类固醇侵袭实验可用于在体外建立更符合生理条件的癌症侵袭模型，并适用于靶点验证和药物筛选研究。我们认为，该技术是对癌症研究中通常用于靶点验证和药物筛选的简单二维细胞增殖检测方法的有益补充，因为它还能使我们在具有生理相关性的三维环境中研究癌症进展的关键特征——侵袭。我最初产生这一方法的想法，是在优化微孔板上3D肿瘤表型生长条件时。当时我认为，若能在相同的实验体系中进一步观察细胞侵袭行为，将会很有价值；结果发现，只需从每个孔中移除部分培养基，并替换为类似基底膜的基质，即可轻松实现。该方法的可视化演示至关重要，因为在BMM传统培养后，将类固醇保持在每个孔的中央位置在初期可能较为困难。这可能导致类固醇位于不同的焦平面，从而造成图像分析不理想。随着经验的积累，这一问题可得到改善。这种情况很少发生，但如有必要，可通过轻轻离心培养板来促进该过程。为开始所有BMM在冰上过夜孵育，请准备一套用于P10、P200和P1000移液器的无菌滤芯吸头，以及无菌离心管，并将其置于-20摄氏度保存。同时，将含有四天龄类固醇的超低吸附96孔板置于冰上。使用多通道移液器，从麻雀培养板的每个孔中轻轻吸出 100 微升生长培养基。此步骤中，将吸头倾斜朝向 U 形底孔的内壁，避免接触孔底以及类球体所在位置。为尽量减少类固醇的干扰，使用预冷的枪头将BMM转移至预冷的离心管中。对于细胞因子诱导侵袭或药物评价研究，使用预冷的枪头向BMM中添加试剂。例如，可使用表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）刺激Cal S和cal r鳞状细胞癌细胞的侵袭。然后轻轻将100微升BMM加入至ubо. 井中，将枪头对准井壁内侧。此步骤最为关键。对于光学图像分析，类固醇必须保持在孔的中央。对所有需要的孔重复此步骤，每种条件设置五到六个重复。如有必要，使用无菌针头更换为新预冷的吸头。如有气泡，请去除。使用显微镜观察类固醇是否位于中央位置；若不在中央，则在4°C条件下以300 × g离心3分钟。此步骤可确保类固醇位于每个孔的中央位置。接着，将培养板转移至37摄氏度的培养箱中，静置1小时使BMM凝固。使用多通道移液器轻轻向每孔加入100 µL完全培养基，用于细胞生长、细胞因子诱导侵袭或药物评价实验。在培养基中加入细胞因子或抑制剂以进行自动图像采集。以一定时间间隔在流式细胞仪上扫描培养板。从零时间点开始，选择汇合度分析应用。然后检查类固醇是否处于焦点。如有需要，在采样设置下手动调整焦点并校正焦点偏移。选择扫描一个中心视野。加入BMM后，肿瘤类固醇应保持在中心位置，因此无需在软件中扫描整个孔板。通过在孔板图上高亮显示待扫描的孔来定义扫描区域，然后点击开始扫描。对于自动图像分析，请选择汇合度分析应用。在分析选项卡中，调整应用程序设置，以在类固醇周围生成精确的分割，包括延伸至骨髓微环境（BMM）中的细胞突起和侵袭性伪足。针对每种肿瘤细胞系或不同时间点调整设置。通过点击若干不同的孔，检查分析设置是否适用于该孔板中的其他类固醇。如果分割未能准确勾勒出类固醇的轮廓，请进一步调整应用程序设置。在结果选项卡上单击“开始分析”。在将孔级别的数据导出到电子表格程序之前，检查多个孔以确认分析质量。对所有时间点重复上述分析，然后计算复孔的平均汇合百分比，并以柱状图形式绘制侵袭率随时间的变化。对于手动图像采集，使用您选择的科学绘图与统计分析软件，采用配备10倍物镜的倒置显微镜，在T=0开始，每隔一定时间点对每个肿瘤类固醇处理组记录一张图像，持续至T=72至96小时之间。根据所研究细胞层侵袭速度的快慢，当侵袭区域过大而无法在10倍视野内完整捕获时，应使用Forex物镜。保存所获取的每一张单独图像，用于人工图像分析。将载物台扫描图像导入图像分析软件中进行分析。校准所用的软件需获取载物台测微尺的图像。使用10倍和4倍物镜进行拍摄。输入图像中的测量值、单位以及所用物镜，并执行校准。此步骤仅需在后续图像分析中执行一次。只需重新加载所需的校准设置即可。接下来，打开侵袭实验图像，并根据获取图像时所用的显微镜物镜选择相应的校准设置。使用此处所用软件测量类固醇覆盖的面积。进入“测量”并选择“计数大小”。选择“同时”然后加载设置，并选择预先确定的检测设置。然后选择计数。应准确分割类固醇区域。将测量结果的不同参数导出至电子表格，并在电子表格中记录相关的图像信息。最后，使用科学作图和统计软件绘制重复类固醇或侵袭的平均面积随时间变化的曲线。此处以U 87 MG胶质母细胞瘤细胞系中观察到的癌细胞侵袭为例，可用于说明脑肿瘤的侵袭过程。一旦嵌入BMM中，细胞便以典型的星爆样侵袭模式扩散，并在72小时的时间段内持续观察该过程。全自动图像分析。使用图像细胞仪可对细胞突起进行分割，并实现肿瘤细胞侵袭的精确量化。请注意，对于该细胞系，类固醇体不包含在侵袭面积的测量范围内。完全自动化的图像分析可轻松完成，并能随时间定量评估肿瘤细胞的侵袭情况。人源鳞状细胞、头颈部同基因型癌细胞系表现出不同的细胞侵袭模式。Cal S细胞系对EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感，而CAL R细胞系则具有耐药性。在无 EGF 的情况下，两种细胞系均未侵入 BMM；而在含有 EGF 时，Cal ars 类固醇细胞主体伸出指状突起。尽管 Cal s 细胞在 72 小时后侵袭性较低，但本实验中图像通过成像细胞仪快速获取；为示例另一种方法，侵袭程度通过独立的图像分析软件进行手动量化。在执行该操作流程时，需注意每种细胞系均需优化其形成类固醇的能力、细胞接种密度、基质成分以及图像采集与分析参数。该方法亦可进一步调整，用于评估三维组织侵袭，例如将肿瘤细胞与类胚胎体共培养以模拟复杂组织，或使用星形胶质细胞类器官模拟胶质瘤、隐窝培养模拟胃肠道癌症，或利用肝脏模型研究肝细胞癌及结肠癌转移。

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医学

三维（3D）肿瘤球体侵袭试验

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用于测量TGF-β诱导侵袭的球体侵袭实验

本视频展示了一种建立三维肿瘤球体与T细胞共培养的方法。首先制备含有肿瘤球体的琼脂糖微孔模具，随后加入T细胞。经过孵育后，该体系可在可控的三维环境中研究T细胞与肿瘤球体之间的相互作用。...

肿瘤类球体中浸润性T细胞的三维共培养模型

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp.

肿瘤细胞侵袭的三维球体模型构建

该方法用于评估癌细胞从类球体向周围三维基质的侵袭。类球体通过悬滴培养法生成，随后包埋于含有基底膜成分和I型胶原的基质中，继而监测类球体外的侵袭情况。...

一种用于在三维环境中评估癌细胞球体侵袭能力的实验方法

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在三维培养中监测癌细胞侵袭和T细胞毒性

本文介绍了一种球形体成像装置的制备方案。该装置可实现对癌细胞球形体的动态或长期荧光成像。本方案还提供了一种简单的图像处理流程，用于分析癌细胞的侵袭行为。...

三维球体模型中癌细胞侵袭的实时荧光成像与分析

侵袭是癌症发生与进展过程中的一个重要生物学现象。该过程受到肿瘤微环境中非肿瘤性细胞及各种组分的影响。本研究旨在描述一种用于分析肿瘤细胞侵袭的替代方法 体外...

分析三维培养物体外细胞侵袭的替代策略

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三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

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