简化的人类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）分离与处理

以下实验的总体目标是展示一种利用 readily available 试剂从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的简单方案。该方法首先通过差速离心技术从人全血中分离中性粒细胞，作为第二步，将分离得到的中性粒细胞用佛波酯（PMA）刺激，以诱导 NET 形成，该过程也称为 NETosis。

接下来，准备一个含有无细胞中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的培养板，并加入癌细胞，以证明NETs对细胞黏附的影响。结果显示，添加NET单层可增强5 49癌细胞的黏附，而当NETs被降解时，这种黏附作用则减弱。使用DNase进行该方法的可视化演示至关重要。

由于该技术较为新颖，且中性粒细胞外陷阱（NETs）结构极为脆弱，因此对其进行操作极为困难。首先，按照文本方案所述，采集80毫升新鲜人全血，分装于14支含肝素的绿色头盖管中。打开每支试管，向其中各加入5毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）。

接下来，将15毫升淋巴细胞分离液（lymphocyte separation media，LSM）加入四个50毫升锥形管中，每管各加15毫升，室温放置。然后，使用安装在60毫升注射器上的18号针头，小心地将稀释后的血液分层加至LSM液面上方，形成清晰的LSM与血液界面。将各管在21摄氏度下以800 × g离心30分钟，离心过程中不得中断。离心结束后，小心吸取并弃去上层两种液体及其间的界面，仅保留底部红色层。该沉淀物含有红细胞和中性粒细胞。

向每支试管中加入 20 毫升 PBS 和 20 毫升 6% 右旋糖酐溶液。轻轻倒置每支试管，室温静置 30 分钟。红细胞将沉降至试管底部。

接下来，将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。将上清液在4°C条件下以450 × g离心5分钟，然后弃去上清液，保留富含中性粒细胞的沉淀。用0.5毫升裂解缓冲液加入4.5毫升无菌水中配制裂解液。

向每支试管中总共加入五毫升裂解液，并将所有沉淀汇集至一个烧瓶中。将烧瓶置于室温避光处10分钟，以裂解任何残留的红细胞。在4°C条件下以450 × g离心5分钟，沉淀中性粒细胞。

弃去上清液，并用五毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀。然后在4°C条件下以450 × g离心样品，去除含有残留裂解液的上清液。将中性粒细胞沉淀重悬于30毫升含3%胎牛血清的冷RPMI培养基中，并将试管置于冰上，以刺激中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成。

在150毫米×25毫米的平底组织培养皿中，向30升中性粒细胞悬液加入500纳摩尔的PMA。使用20毫米网格，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。孵育结束后，轻柔地吸除并弃去培养基，注意不要破坏附着在培养皿底部的网状结构及中性粒细胞层。

然后使用移液器用 15 毫升不含钙和镁的预冷 PBS 冲洗每个培养皿底部，应将所有贴壁物质从底部彻底清除。将冲洗液收集至 15 毫升锥形管中，随后在 450 × g 下离心 10 分钟。在 4 摄氏度条件下，中性粒细胞及任何残留细胞将沉淀至管底。

离心后获得无细胞的网状物上清液，随后将上清液分装至多个1.5毫升离心管中，在4°C条件下以18,000 × g离心10分钟。离心后弃去上清液以沉淀DNA，将沉淀重悬于PBS中，使其浓度相当于每100微升PBS中含有2 × 10⁷个中性粒细胞。此无细胞网状物储备液可用于后续实验。

使用分光光度法测定样品的DNA浓度。合适的浓度范围应在每微升140至180纳克之间。将100微升净原液加入96孔平底板的每个孔中，并在4摄氏度避光条件下孵育过夜，使孔壁包被12至20小时。之后，使用显微镜检查各孔底部是否形成均匀的无细胞网单层。确认形成单层后，轻柔地吸除所有未结合的物质。

确保不破坏底部的单层细胞。这是该操作中最困难的部分。为了维持一个完整的单层细胞，必须非常小心地操作培养板。

将所有试剂和细胞缓慢加入孔的侧壁，非常轻柔地进行吸液，避免吸头接触孔底。轻轻去除非黏附物质后，向每孔加入100 µL的1%牛血清白蛋白封闭液，在室温下孵育1小时。不要振荡或摇动酶标板，以免破坏单层细胞网状结构。

接下来，当癌细胞生长至70%至80%融合时，收集细胞并制备成单细胞悬液。采用标准技术，将细胞重悬于培养基中，浓度为每100微升含2×10⁴个细胞。通过在每毫升培养基中加入1微升CFSE对细胞进行染色，并在室温下孵育10分钟。

接下来，在4°C条件下以450 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于初始体积的培养基中，以维持每100 µL培养基中含有2 × 10⁴个癌细胞的浓度。取出包被好的培养板，轻轻吸除封闭液。

然后向每个孔中加入100 µL癌细胞悬液，在37°C、5% CO₂条件下孵育90分钟，使细胞贴附于培养板上。完全吸出液体后，在部分孔中加入1000单位的DNase，作用10分钟以降解细胞外诱捕网，其他孔作为对照。每孔加入100 µL无菌水，作用10分钟，作为空白对照。接着，轻柔吸出各孔中的液体，并用100 µL PBS洗涤，以去除未贴壁的细胞。

用5 49细胞吸取并弃去孔中所有溶液，仅保留底部的网膜和贴壁的癌细胞。然后每孔加入100 µL 4%甲醛溶液固定细胞，立即将培养板转移至荧光显微镜下读取实验结果，随后使用数据分析软件对结果进行绘图和分析。

在体外静态黏附实验中，使用无细胞网状结构与5 49癌细胞共培养。光学显微镜显示，癌细胞强烈黏附于网状单层结构上。

在DNA降解净单层后，这种黏附作用减弱。对标记的A549癌细胞进行荧光显微镜观察证实了这些结果。通过计数每高倍视野中的细胞数量，量化A549细胞与净单层的结合。如图所示，在溶剂对照组中，癌细胞对网状结构的黏附未发生改变。

然而，在存在 DNA one 的情况下，癌细胞对网状结构的黏附显著减少。观看本视频后，您应能较好地掌握如何从全人血中分离和处理网状结构。这些无细胞的网状结构分离物随后可用于多种技术，包括免疫荧光、共聚焦显微镜、电子显微镜和蛋白质印迹（western blotting）。