Name: 供肝易地常温灌注机 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 了解供肝常温机器灌注的标准化操作流程，包括灌注液配制、设备预充及血流动力学监测等关键步骤。该技术可在37摄氏度条件下维持肝脏代谢活性，有效评估移植物活力并减少缺血再灌注损伤。

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本研究工作得到了荷兰Innovatief Actieprogramma Groningen（IAG-3）、Jan Kornelis de Cock基金会以及Tekke Huizingafonds的资助。我们感谢所有荷兰移植协调员在识别可能被弃用的肝脏器官并获取知情同意方面所做的努力。

本方案已获得荷兰格罗宁根大学医学中心医学伦理委员会（Medisch Ethische Toetsingscommissie）的批准。
1. 灌注液的制备
注意：根据本方案制备的用于常温机械灌注的灌注液总体积为 2,233 ml，目标渗透压为 302 mOsmol/L。
<ol>
	<li>根据表1中所述灌注液的组分，将人浓缩红细胞、新鲜冰冻血浆和人血白蛋白单独保存。其余组分以无菌方式混合，并将溶液储存于无菌袋中，以便运输至手术室（OR）。此操作应在无菌环境（理想条件下为符合药品生产质量管理规范的设施）或细胞培养室的层流柜中进行。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td fo:width="2in" style="width:80px">数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>浓缩红细胞（血细胞比容 60%）</td>
			<td style="text-align:right">840 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新鲜冰冻血浆</td>
			<td style="text-align:right">930 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人血清白蛋白 200 g/L（Albuman, Sanquin）</td>
			<td style="text-align:right">100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>改良型肠外营养液（Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.）</td>
			<td style="text-align:right">7.35 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>静脉用多种维生素（Cernevit, Baxter International Inc.）</td>
			<td style="text-align:right">7 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>静脉用浓缩微量元素（Nutritrace, B. Braun Melsungen AG）</td>
			<td style="text-align:right">7.35 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甲硝唑静脉注射液（5 mg/ml）（Flagyl, Sanofi-Aventis）</td>
			<td style="text-align:right">40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>头孢唑林 1,000 mg 瓶装粉末（5 ml，供静脉注射）（Servazolin, Sandoz）</td>
			<td style="text-align:right">2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>速效胰岛素（100 IU/ml）（Actrapid®, Novo Nordisk）</td>
			<td style="text-align:right">20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖酸钙静脉注射液 10%（137.5 mg/ml）（Sandoz）</td>
			<td style="text-align:right">40 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无菌 H2O</td>
			<td style="text-align:right">51.3 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% 氯化钠溶液</td>
			<td style="text-align:right">160 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碳酸氢钠 8.4% 溶液</td>
			<td style="text-align:right">31 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素 5,000 IE/ml 静脉注射液</td>
			<td style="text-align:right">4 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td style="text-align:right">2,233 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>


表1：灌注液的成分16。
<ol start="2">
	<li>将人浓缩红细胞（840 ml）、新鲜冰冻血浆（930 ml）、人血清白蛋白 200 g/L（100 ml）以及步骤 1.1 中配制的溶液转移至手术室，用于灌注装置的给药。</li>
</ol>


2. 灌注装置的预处理
<ol>
	<li>通过氧合器顶部的连接器，将灌注液的各组分（包括浓缩人红细胞、新鲜冰冻血浆、人血清白蛋白以及步骤1.1中配制的溶液）加入机器，并从管路中彻底排除所有气泡。</li>
	<li>启动静脉泵，并按照屏幕上的制造商说明进行操作；随后启动动脉泵，并同样遵循屏幕上的制造商说明。</li>
	<li>根据屏幕上的提示，将压力计相对于大气压归零。此操作可确保在灌注过程中测得的压力为门静脉和肝动脉水平的真实压力。</li>
	<li>以4 L/min的流速开始使用碳氧混合气体（95% O2 + 5% CO2）进行氧合。气流将平均分配至两个氧合器（每个氧合器2 L/min），从而使灌注液中的pO2维持在约60 kPa（或450 mmHg）。对于较长时间的灌注，建议使用独立的氧气和二氧化碳气源，以便微调O2/CO2比例，进而调节灌注液的pH值和pCO2。</li>
	<li>在设备预充后15–20分钟采集灌注液样本进行血气分析，并据此监测pH值和电解质水平。 
	注意：采样前应先弃去约3 ml灌注液，因为这部分液体位于外周管路中，不能代表系统内的实际灌注液状态。加入8.4%碳酸氢钠溶液以增强缓冲能力，目标是维持生理pH值（7.35–7.45）。例如，可加入25–35 ml的8.4%碳酸氢钠溶液，并通过定期采样进行血气分析，监测灌注液中的pH值和碳酸氢根水平。</li>
</ol>
3. 供体肝脏的获取与制备
注意：采用标准技术获取器官 原位 冷却并用冷保存液（0-4 °C)19为便于动脉插管，保留一段附着于肝动脉的超根部主动脉。图2A).
<ol>
	<li>用保存液冲洗胆管即， 威斯康星大学溶液）。使用外科缝线结扎胆囊管。</li>
	<li>将器官打包并存放在标准的无菌供体器官袋和盒子中，加入碎冰，随后运送到机械灌注中心。</li>
	<li>供肝一到达手术室，立即开始背桌操作。
	<ol>
		<li>采集至少10 ml保存液样本用于微生物学检测。</li>
		<li>用手术剪刀切除膈肌与肝脏裸区之间的连接组织，并清除上腔静脉袖口处残留的任何心肌组织。</li>
		<li>使用解剖剪分离动脉和门静脉，并使用外科缝线或血管夹结扎侧支。</li>
		<li>使用不可吸收的单丝缝线闭合主动脉超根部节段的远端例如， 3-0 Prolene）。将动脉插管插入主动脉弓上方的近端主动脉，并用缝线固定（图2A）。使用灌注装置制造商在一次性包装中提供的套管。</li>
		<li>将静脉导管插入门静脉并用缝线固定。使用一次性包装中提供的导管。肝静脉保持不插管。</li>
		<li>用保存液冲洗胆管。将硅胶导管插入胆管，并用缝线固定。 
		注意：切勿将导管过深插入胆管，以免造成胆道上皮损伤。</li>
		<li>通过门静脉插管用0.9% NaCl溶液灌注肝脏，步骤如下：
		<ol>
			<li>如果移植物使用威斯康星大学溶液作为保存液，用2,000 ml冷（0-4 °C0.9% NaCl 溶液，随后给予 500 ml 温热（37 °C0.9% NaCl 溶液</li>
			<li>如果移植物使用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液作为保存液进行保存，则用1,000 ml冷（0-4 °C0.9% NaCl 溶液，随后使用 500 ml 温热的（37 °C0.9% NaCl 溶液。温热灌注液的目的是防止灌注液温度显著下降。</li>
			<li>在将肝脏连接至灌注装置之前立即进行温冲洗。 
			注意：热灌注与开始NMP之间的时间间隔应始终控制在1-2分钟以内。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>供体特征（N = 12）</td>
			<td>数量（%）或中位数（IQR）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年龄（岁）</td>
			<td>61 (50-64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>性别（男性）</td>
			<td>8 (67%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>供体类型 
			DCD，Maastricht III 型 
			DBD</td>
			<td>  
			10 (83%) 
			2 (17%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>体重指数（BMI）</td>
			<td>27 (25-35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>被拒原因 
			DCD + 年龄 >60 岁 
			DCD + 高 BMI 
			DCD + 其他多种原因* 
			重度脂肪变性</td>
			<td>  
			5 (41%) 
			3 (25%) 
			2 (17%) 
			2 (17%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>保存液 
			  UW 液 
			  HTK 液</td>
			<td>  
			6 (50%) 
			6 (50%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCD 供体的热缺血时间（min）</td>
			<td>14 (17 - 20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>冷缺血时间（min）</td>
			<td>389 (458-585)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>供体风险指数（DRI）</td>
			<td>2.35 (2.01-2.54)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：供体特征。 * 一例移植物的供体有静脉注射毒品史，以及供体sO持续时间较长2 &lt;撤除生命支持后，另一移植物的存活率为30%。 缩略语: DCD，循环死亡后捐献；DBD，脑死亡后捐献；UW，威斯康星大学；HTK，组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐
<img alt="显示门静脉、胆管和腹主动脉的肝移植手术序列。" src="/files/ftp_upload/52688/52688fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2：(A) 在修肝台上准备好的人类供体肝脏移植物照片，以及(B–D) 随后进行常温机械灌注的情况。(A) 动脉插管插入腹主动脉，静脉插管插入门静脉。胆管使用硅胶胆道导管进行插管。(B) 将肝脏置于器官腔内，其前面朝下，并将插管连接至灌注装置的管路。(C) 常温机械灌注开始后 30 分钟。(D) 常温机械灌注开始后 6 小时。操作过程中，器官腔由透明盖覆盖，以维持肝脏的无菌湿润环境（本图中未显示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52688/52688fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 常温机械灌注
<ol>
	<li>将肝脏置于器官腔内，使腹侧朝下。立即将肝脏连接至预充液体的灌注装置，将门静脉插管连接至灌注装置的门静脉流入管，将动脉插管连接至装置的动脉流入管。</li>
	<li>根据屏幕上的制造商说明，启动门静脉和动脉双侧的灌注。将平均动脉压设定为 70 mmHg，平均门静脉压设定为 11 mmHg。</li>
	<li>每 30 分钟采集一次灌注液样本，使用常规血气分析仪立即检测血气参数（pO2、pCO2、sO2、HCO2- 和 pH）以及生化参数（葡萄糖、钙、乳酸、钾和钠）。采样前务必弃去约 3 ml 灌注液，因为这部分液体位于外周管路中，不能代表系统内的灌注液状态。
	<ol>
		<li>使用 1 ml 注射器从灌注装置一次性管路组件中的采样连接口吸取灌注液以获取样本。每次采样均应使用新的注射器，并在吸取灌注液后立即排除注射器内的任何气泡。随后将注射器插入血气分析仪，并按照分析仪使用手册中的制造商说明进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从灌注液中收集血浆，冷冻并储存在 -80 °C，用于检测碱性磷酸酶（AlkP）、γ-谷氨酰转移酶（gamma-GT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、尿素和总胆红素。将灌注液在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 5 分钟后收集血浆。</li>
</ol>

<ol><li>Plaats, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+in+liver+transplantation+revisited%3A+Concepts+and+criteria+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation in liver transplantation revisited: Concepts and criteria in the new millennium.</a> Ann. Biomed. Eng. 32 (4), 623-631 (2004).</li>
<li>op den Dries, S., Sutton, M. E., Lisman, Y., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+bile+ducts+in+liver+transplantation%3A+Looking+beyond+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protection of bile ducts in liver transplantation: Looking beyond ischemia.</a> Transplantation. 92 (4), 373-379 (2011).</li>
<li>Seehofer, D., Eurich, D., Veltzke-Schlieker, W., Neuhaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+liver+transplantation%3A+Old+problems+and+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after liver transplantation: Old problems and new challenges.</a> Am. J. Transplant. 13 (2), 253-265 (2013).</li>
<li>Buis, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonanastomotic+biliary+strictures+after+liver+transplantation%2C+part+1%3A+Radiological+features+and+risk+factors+for+early+vs.+late+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver.+Transpl%22%5BJournal%5D)">Nonanastomotic biliary strictures after liver transplantation, part 1: Radiological features and risk factors for early vs. late presentation.</a> Liver. Transpl. 13 (5), 708-718 (2007).</li>
<li>Karimian, N., op den Dries, S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+biliary+strictures+after+liver+transplantation%3A+Is+it+the+amount+of+epithelial+injury+or+insufficient+regeneration+that+counts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The origin of biliary strictures after liver transplantation: Is it the amount of epithelial injury or insufficient regeneration that counts.</a> J. Hepatol. 58 (6), 1065-1067 (2013).</li>
<li>Gastaca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+complications+after+orthotopic+liver+transplantation%3A+A+review+of+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Biliary complications after orthotopic liver transplantation: A review of incidence and risk factors.</a> Transplant. Proc. 44 (6), 1545-1549 (2012).</li>
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<li>Guarrera, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+in+human+liver+transplantation%3A+The+first+clinical+series%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: The first clinical series.</a> Am. J. Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).</li>
<li>Henry, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+machine+preservation+reduces+molecular+markers+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+human+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Hypothermic machine preservation reduces molecular markers of ischemia/reperfusion injury in human liver transplantation.</a> Am. J. Transplant. 12 (9), 2477-2486 (2012).</li>
<li>Schlegel, A., Rougemont, O., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+end-ischemic+cold+machine+perfusion+in+DCD+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of end-ischemic cold machine perfusion in DCD liver grafts.</a> J. Hepatol. 58 (2), 278-286 (2013).</li>
<li>op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+oxygenated+machine+perfusion+prevents+arteriolonecrosis+of+the+peribiliary+plexus+in+pig+livers+donated+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Hypothermic oxygenated machine perfusion prevents arteriolonecrosis of the peribiliary plexus in pig livers donated after circulatory death.</a> PLoS. One. 9 (2), e88521(2014).</li>
<li>Tolboom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnormothermic+machine+perfusion+at+both+20+degrees+C+and+30+degrees+C+recovers+ischemic+rat+livers+for+successful+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Subnormothermic machine perfusion at both 20 degrees C and 30 degrees C recovers ischemic rat livers for successful transplantation.</a> J. Surg. Res. 175 (1), 149-156 (2012).</li>
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<li>op den Dries, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+normothermic+machine+perfusion+and+viability+testing+of+discarded+human+donor+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers.</a> Am. J. Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+viability+assessment+of+discarded+human+donor+livers+during+ex+vivo+normothermic+machine+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Criteria for viability assessment of discarded human donor livers during ex vivo normothermic machine perfusion.</a> PLoS. One. 9 (11), (2014).</li>
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</ol>

本文作者无任何利益冲突需要披露。

本视频提供了使用一种能够通过肝动脉和门静脉进行压力控制双灌注的设备，对人类供体肝脏进行常温机械灌注的逐步操作方案。在遵循本方案的过程中，灌注设备未发生技术故障，所有移植物均得到良好灌注和充分氧合。离体灌注肝脏血流动力学稳定，并具有代谢活性，表现为胆汁生成16,17。
这是一种成熟的人类供体肝脏机械灌注方案。与传统的静态冷保存（SCS）方法相比，该技术具有多种潜在优势21。机械灌注可根据器官保存的预期终点，在不同温度下实现对供体肝脏移植物的保存。低温氧合机械灌注可改善微血管系统的灌注和冲洗效果，并可能通过促进三磷酸腺苷（ATP）再生来恢复细胞内能量储备。然而，对移植物活力的全面评估需要在更接近生理状态的温度下进行灌注（亚常温或常温）。随着灌注温度升高，肝脏代谢活动将增强，并开始产生胆汁。最近一项研究表明，在常温机械灌注（ex&#160;situ NMP）期间，将胆汁生成作为肝功能的指标，可能有助于在移植前评估移植物的活力。该研究显示，胆汁产量与肝组织ATP水平以及肝损伤的组织学和生物化学标志物相关<sup...

目前肝移植中器官保存的方法是用低温（0-4 °C）保存液（如威斯康星大学溶液或组氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液）对供体肝脏进行灌洗并随后低温保存。该方法被称为静态冷保存（SCS）。尽管肝脏在0-4 °C时的代谢率极低，但仍需要0.27 µmol 氧气/min/g 肝组织，而静态冷保存期间无法提供这一需求1。因此，传统的静态冷保存方法会导致供体肝脏发生一定程度的（额外）损伤。虽然这种程度的保存相关损伤在质量良好的供体肝脏中并不构成问题，但对于在供体体内已遭受一定程度损伤的次优肝脏而言，这种损伤可能成为关键且限制性的因素。因此，质量次优或所谓扩展标准供体（ECD）的肝脏常因早期移植物功能衰竭的风险过高而被拒绝用于移植。已有报道显示，接受心脏死亡后捐献（DCD）供体肝脏、老年供体肝脏或脂肪变性移植物的受者中，移植物功能延迟、原发性无功能以及非吻合性胆道狭窄（NAS）的发生率较高2。NAS是肝移植术后发病率和死亡率的主要原因。NAS可发生于供体肝外和肝内胆管，并可能伴有胆管内胆泥和胆栓形成3,4。尽管NAS的病因被认为是多因素的，但移植物保存和移植过程中胆管所经历的缺血/再灌注损伤已被确认为主要的潜在机制2,5。DCD移植物的移植已被确定为NAS发生的最强风险因素之一。DCD供体经历的热缺血期、器官保存期间的冷缺血期以及受者体内的后续再灌注损伤共同作用，被认为导致了胆管的不可逆损伤；加之胆管自身再生能力较差，最终在肝移植后导致胆管纤维化瘢痕形成和管腔狭窄2,5。在接受DCD肝脏移植的患者中，NAS的发生率高达30%6-8。目前已有明确共识：现有的肝移植物静态冷保存方法对于如DCD供体来源的已存在损伤的ECD肝脏而言是不足的。需要采用替代性方法以提高并优化ECD肝脏在移植中的使用。
机械灌注（MP）是一种器官保存方法，与静态冷保存（SCS）相比，可能实现对供体器官更佳的保存效果。MP在扩展标准供体（ECD）移植物的保存中可能尤其具有重要意义。MP的一个重要优势是在保存期间可为移植物提供氧气。MP可在不同温度下进行，通常分为低温（0–10 °C）、亚常温（10–36 °C）和常温（36–37 °C）机械灌注（NMP）。根据MP所采用的温度，需相应调整灌注液的类型，且随着温度升高，应提供更多的氧气。人类肝脏移植中MP的首次临床应用基于低温灌注，且灌注液未进行主动氧合9,10。在动物模型中，低温氧合MP（0–10 °C）已被证明可对肝脏移植物的缺血/再灌注损伤起到保护作用11，并能更好地保存胆管周围血管丛12。在动物模型中也已研究了20 °C或30 °C下的亚常温氧合MP，结果显示与SCS相比，可使心脏死亡后捐献（DCD）肝脏移植物功能更早恢复13,14。近期已有研究报道了对七例被弃用的人类供体肝脏进行亚常温氧合MP的可行性15。常温机械灌注（NMP，37 °C）可在移植前评估移植物的活力和功能16,17。此外，MP可在移植前实现肝脏移植物的逐步复温，已有研究证实该过程有助于移植物的恢复与复苏18。
本方案中用于肝脏机械灌注的灌注装置通过两台离心泵实现双重灌注（经门静脉和肝动脉），分别提供连续的门静脉血流和搏动性的动脉血流。该系统采用压力控制模式，可根据肝内阻力自动调节灌注流量。两个中空纤维膜氧合器用于为肝脏移植物供氧，并清除CO2。可根据预期的机械灌注（MP）类型设定温度（最低温度为10 °C）。灌注过程中，设备可实时显示流量、压力和温度，从而实现对灌注过程的持续监控。每次移植器官灌注均配备一套全新的无菌一次性管路、储液罐和氧合器（图1）。
本视频文章的目的是提供一种使用新开发的肝脏灌注机对人类供体肝脏进行ex situ常温机械灌注的逐步操作方案。
<img alt="肝脏灌注系统示意图：旋转泵装置、氧合过程、灵活的肝脏支架。" src="/files/ftp_upload/52688/52688fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：(A) 灌注系统的示意图，(B) 灌注设备的照片，(C) 氧合器的近景图，以及(D) 用于人供体肝脏常温灌注的离心泵。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52688/52688fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>肝脏辅助装置</td><td>器官辅助公司</td><td>OA.Li.Li.140</td><td>灌注设备</td></tr><tr><td>肝脏辅助一次性套件</td><td>器官辅助公司</td><td>OA.Li.DP.540</td><td>一次性管路套装及插管</td></tr><tr><td>Meredith No.8</td><td>Vygon Nederlands B.V.</td><td>1362082</td><td>胆管插管</td></tr><tr><td>人血清白蛋白 200 g/L / ALBUMAN</td><td>Sanquin</td><td>15522598</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>改良型肠外营养液</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>N14G30E</td><td>7.35 ml</td></tr><tr><td>静脉用多种维生素 / CERNEVIT</td><td>Baxter International Inc.</td><td>9800927</td><td>7 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>浓缩型静脉用微量元素 / NUTRITRACE</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>14811332</td><td>7.35 ml</td></tr><tr><td>甲硝唑 5 mg/ml</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>98181882</td><td>40 ml</td></tr><tr><td>头孢唑林 / SERVAZOLIN</td><td>Sandoz B.V.</td><td>15611337</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>速效胰岛素</td><td>多个供应商</td><td></td><td>20 ml</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙静脉注射液 10%，137.5 mg/ml</td><td>Sandoz</td><td>97038695</td><td>40 ml</td></tr><tr><td>无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fresenius Kabi Nederland B.V.</td><td>98084453</td><td>51.3 ml</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液</td><td>Baxter Nederland B.V.</td><td>15262510</td><td>160 ml</td></tr><tr><td>肝素 5,000 IE/ml，用于静脉给药</td><td>LEO Pharma B.V.</td><td>98026178</td><td>4 ml</td></tr><tr><td>碳酸氢钠 8.4%</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>97973874</td><td>用量根据 pH 值确定</td></tr><tr><td>浓缩红细胞（SAGM 保存液）</td><td>血库（Sanquin）</td><td>N0012000</td><td>750 ml</td></tr><tr><td>新鲜冰冻血浆</td><td>血库（Sanquin）</td><td>N04030A0/N04030B0</td><td>900 ml</td></tr></tbody></table>

离体 供体肝脏的常温机械灌注

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

与传统的静态冷保存（0-4 °C）相比，离体机械灌注可能更有利于供体肝脏的保存。对器官进行持续灌注不仅有助于改善器官质量，还可实现在移植前对供体肝脏进行离体活力评估。本视频文章提供了一套详细的操作步骤，用于在37 °C条件下对人供体肝脏进行离体常温机械灌注，所用设备可对肝动脉提供压力与温度可控的脉动式灌注，并对门静脉提供连续灌注。灌注液通过两个中空纤维膜氧合器进行氧合，灌注温度可在10 °C至37 °C之间调节。在灌注过程中，可通过生化分析灌注液样本，评估肝脏的代谢活性及损伤程度。机械灌注是一种极具前景的技术，有望增加可用于移植的肝脏数量。

12 个因各种原因被拒绝用于移植的人类肝脏在获得供体家属知情同意用于研究后被使用。供体特征详见于 表2人供体肝脏采用本文所述方案进行6小时的常温灌注。通过监测肝脏灌注的宏观均匀性来评估肝移植物的质量（图 2A-D). 通过监测肝动脉和门静脉血流的变化来评估肝脏的血流动力学。观察到肝动脉和门静脉血流先出现初期升高，随后逐渐稳定，在灌注6小时时，动脉平均血流量为256 ± 16 ml/min（均值 ± 标准误），门静脉平均血流量为748 ± 34 ml/min（均值 ± 标准误），表明肝脏在灌注过程中血流动力学稳定。图3A）。通过动脉灌注液采集的灌注液样本进行血气分析，以监测灌注液中的氧合状态。使用碳合气（95% O₂，5% CO₂）进行氧合。2 和5% CO2) 在 4 L/min 的流速下产生持续的 O2 饱和度为100%。 图3B 在我们的经验中，展示了灌注液的氧合并随...

本文介绍了一种用于供体肝脏移植物的含氧ex situ机械灌注方案。文章详细提供了获取并准备肝脏移植物以进行机械灌注、配制灌注液、预充灌注设备以及实施肝脏移植物含氧常温机械灌注的逐步操作流程。

与传统的静态冷保存（0-4 °C）相比，离体机械灌注可能更有利于供体肝脏的保存。持续……

本实验的总体目标是利用机械灌注技术，在体温条件下对人供体肝脏移植物进行体外灌注。首先需配制所需的灌注液，以完成该操作；第二步是通过将灌注液的不同组分加入机器，对灌注装置进行预充。 同时，在无菌台将获取的肝脏移植物进行准备，以连接灌注装置。最后一步是将肝脏连接至灌注装置，并启动常温灌注。最终，通过观察屏幕上显示的动脉和门静脉血流变化来评估肝脏的血流动力学状态，同时通过对动脉灌注液样本进行血气分析，监测灌注液的pH值和氧合状态。与传统的静态保存方法相比，该技术的主要优势在于能够在人体外常温下维持肝脏的存活。通过向移植物提供氧气和营养物质，使其保持代谢活性，有助于减轻缺血再灌注损伤以及低温引起的损伤。由于肝脏在37摄氏度时具有代谢活性，因此可以在移植前评估移植物的存活能力。人类肝脏移植物的离体常温机械灌注过程将由我实验室的博士生Alex Mehan逐步演示。开始此操作时，通过氧合器顶部的连接器将灌注液的各组分加入机器中。灌注液由浓缩人红细胞、新鲜冰冻血浆、人血白蛋白及其他成分组成。开启 Venus 泵和动脉泵。按照屏幕上的厂家说明，逐步提高两侧的泵输出量。以系统化的方式排除封闭系统中的所有气泡。根据屏幕上的说明，将压力计相对于大气压调零。这可确保灌注过程中测得的压力为门静脉水平的实际压力。在设备的门静脉侧将设定温度调整为37摄氏度。将平均门静脉压设定为11毫米汞柱。在设备的动脉侧重复进行压力校准操作。将温度设置为 37 摄氏度，平均动脉压设置为 70 毫米汞柱。以每分钟 4 升的流速使用碳合气（carbogen）开始氧合。气流将分配至两个氧合器中，这应使灌注液中的氧分压达到约 60 千帕。对于较长时间的灌注，建议使用独立的氧气和二氧化碳气源。这可以对氧气与二氧化碳的比例进行微调，从而调节灌注液的pH值以及二氧化碳分压。通过血气分析检查灌注液的pH值。取样前务必弃去约三毫升灌注液，因为该液体位于外周管路中，不能代表系统内的灌注液。同时，应去除血气样本中的所有气泡。加入8.4%碳酸氢钠溶液以提供缓冲能力，目标是维持生理pH值。通常添加15至30毫升8.4%碳酸氢钠溶液。在此阶段，供体肝脏在供体医院通过原位冷却的标准技术获取，并用冷保存液冲洗，以利于动脉插管。在供体肝脏送达灌注中心手术室后，应立即在肝动脉近端保留一段腹主动脉，并开始修肝操作。留取至少10毫升保存液样本用于微生物学检测。在供体医院获取肝脏时，胆囊管已使用手术剪结扎，需去除肝脏裸区与膈肌的附着组织，并清除下腔静脉上端套管区域残留的心肌组织。使用解剖剪解剖动脉和门静脉。使用外科缝线或血管夹结扎侧支。使用不可吸收的单丝缝线（如3.0 Prolene）闭合膈下主动脉节段的远端末端。将动脉插管插入主动脉上干近端，并用缝线固定。接着，将静脉插管插入门静脉，并用缝线固定。肝静脉应保持不插管状态。用保存液冲洗胆管。将硅胶导管插入胆管并用缝线固定。导管插入胆管时不宜过深，以免损伤胆管上皮。最后，通过门静脉插管用0.9%生理盐水冲洗肝脏。如果移植物保存在威斯康星大学溶液中，则先用两升冷生理盐水冲洗，再用半升温生理盐水冲洗；如果移植物保存在HTK溶液中，则先用一升冷生理盐水冲洗，再用半升温生理盐水冲洗，以准备进行机器灌注。首先将肝脏置于器官腔内，使腹侧面朝下。立即将肝脏连接至预充灌注装置，即将门静脉套管连接至装置的门静脉流入管，同时将动脉套管连接至装置的动脉流入管。本方案最关键的步骤是将门静脉和肝动脉套管正确连接至灌注装置。此后应立即开始充分灌注。根据屏幕上的制造商说明，开始门静脉和动脉两侧的灌注。如果管道发生弯曲和/或肝内阻力过高，可能会触发压力警报。检查平均动脉压和平均门静脉压，必要时重新调整。在常温机械灌注期间，注意观察代谢活跃的移植物的胆汁生成情况以及肝动脉的搏动。灌注过程中，在不同时间点使用提供的无菌盖子关闭器官腔室。使用新的1毫升注射器采集灌注液样本，立即进行血液、气体和生化参数分析。每次采样时，从灌注装置一次性管路组件中的采样连接口吸取灌注液。同样，在采集样本前，务必先弃去数毫升灌注液。立即从注射器中排除所有气泡。将1 mL注射器插入血气分析仪，并按照制造商的说明进行血气和生化参数分析。采集灌注液样本以备后续分析。将样本转移至采血管中，并置于融冰上保存。在4°C条件下以1400 × g离心5分钟。收集灌注液中的血浆，随后将血浆在-80°C下冷冻保存，用于后续生化分析，以评估灌注期间肝脏移植物损伤程度及肝脏质量。监测肝脏的宏观均匀性。图中显示的是肝脏在灌注前以及常温机械灌注开始后30分钟和6小时的状态。通过监测动脉和门脉血流在常温机械灌注期间的变化，评估肝脏的血流动力学。血流的初始升高及随后的稳定表明肝脏在灌注过程中具有稳定的血流动力学。通过血气分析监测灌注液的氧合情况以及二氧化碳的清除情况。以每分钟四升的流速使用碳酰气（carbogen）进行氧合，可使氧饱和度持续保持在100%。胆汁生成被用作评估肝脏功能的指标。总胆红素和碳酸氢盐浓度的升高表明所产生胆汁的质量有所改善。观察到胆汁颜色逐渐加深。灌注液中肝损伤标志物（如LT碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶和钾）浓度稳定，表明移植物损伤轻微。此外，在常温机械灌注期间，对肝组织和肝外胆管远端进行的组织学检查未发现移植物出现额外损伤。图中已标注胆管周围腺体和血管结构。观看本视频后，您应能充分了解如何对人类肝脏移植物进行常温机械灌注。该技术有望在移植前改善并评估移植物的存活能力。

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