三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

本实验的总体目标是构建一种人食管上皮的三维组织工程模型，用作实验研究平台。首先从人食管组织样本中分离出正常的食管成纤维细胞和上皮细胞。第二步，将成纤维细胞接种至去上皮化的无细胞食管支架（具有孔状结构）上，并培养七天。

接下来，将支架倒置，并加入分离的人食管上皮细胞，继续培养四天。最后一步是将模型转移至气液界面，再进行五天的培养，以促进成熟复层上皮的形成。最终，通过免疫组织化学方法对模型上皮细胞表达的增殖与分化关键标志物进行表征。

与传统的二维细胞培养相比，该技术的主要优势在于能够使细胞形成在体内所具有的细胞-细胞及细胞-基质相互作用。通过该技术，我们能够生成类似于正常食管的成熟复层鳞状上皮。通常情况下，初次接触该方法的研究人员会在三个方面遇到困难。

第一，确保大部分上皮细胞在被纳入支架前不发生分化可能具有挑战性。第二，在上皮组织成熟期间，必须谨慎确保提供正确的气液界面。第三，在整个培养期间维持其完整性也可能存在困难。

为了分离人食管上皮细胞，将获取的食管鳞状黏膜组织置于无菌培养皿中，使用经乙醇消毒的手术刀将组织切成0.5厘米宽的条状。随后，将组织在0.1%胰蛋白酶中于37摄氏度条件下孵育，并在覆盖条件下消化1小时，然后加入5毫升胎牛血清（FCS）终止消化反应。接下来，用镊子夹住组织条，每条用手术刀片轻轻刮擦上皮表面1至2分钟，使上皮细胞脱落进入周围培养液中。当所有组织条均完成刮擦后，将含有脱落上皮细胞的培养液转移至15毫升离心管中。

离心细胞后，弃去上清液，将沉淀重悬于12毫升上皮细胞培养基中。然后弃去饲养层细胞培养基，使用无菌移液管将上皮细胞接种到饲养层细胞上，以分离人食管成纤维细胞。将刮取的组织条转移至无菌培养皿中，最后用手术刀将组织切碎。

将组织块放入 10 毫升含 0.5% 胶原酶的溶液中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳及湿润环境下消化过夜。次日，将消化液转移至 50 毫升离心管中，离心收集细胞。用 10 毫升成纤维细胞培养基重悬腭部组织。

将细胞培养瓶置于细胞培养箱中进行培养。制备脱细胞猪食管支架时，首先使用剪刀和镊子将猪食管纵向切开。随后，将食管放入含有100毫升无菌PBS的180毫升无菌容器中，在轻微振荡条件下洗涤10分钟，以去除组织冲洗过程中可能存在的任何残余碎片。

当食管中的软木干燥后，将软木解剖板用70%乙醇喷洒，软木置于板上，黏膜面朝上。现在，使用无菌镊子夹住食管一端的黏膜表面，将组织从板上拉开，以分离黏膜层与下方的黏膜下层。然后使用无菌手术刀片，沿固有层纵向解剖食管，在解剖过程中逐步移除大头针，以便将黏膜抬起分离。

弃去下方的黏膜下层，使用手术刀将剩余的黏膜切成边长为五厘米的方形小块。如刚才所示，用150毫升无菌PBS轻轻振荡洗涤这些组织块。五分钟后，将组织转移至一个180毫升的容器中，容器内含150毫升1摩尔氯化钠溶液。

在37摄氏度下加入抗生素孵育。72小时后，将组织转移至150毫升无菌PBS中，此时上皮层已开始明显与下方组织分离。使用无菌镊子和手术刀片去除脱落的上皮层，并将剩余组织置于新鲜的150毫升无菌PBS中，轻柔振荡洗涤三次，每次五分钟。此后，组织必须在甘油中保存至少四个月。

为完全灭菌支架，首先开始食管黏膜模型的制备：将已在甘油中灭菌保存至少四个月的猪源性支架片段进行再水化处理。用100毫升无菌PBS分五次、每次10分钟振荡洗涤，每次洗涤均更换为新鲜PBS。

第五次搅动测试后，将支架在37摄氏度下于100毫升DMEM中过夜培养，以检测其无菌性。次日早晨，将支架转移至六孔板的各个孔中，黏膜下层朝上。然后将无菌医用级不锈钢环置于每个支架的中心位置，并使用无菌镊子轻轻按压环体五次，以确保其与组织之间形成充分的密封。

将5个人食管成纤维细胞置于0.2毫升成纤维细胞培养基中，接种至每个环的中央。然后在环外区域加入至少2毫升以上的成纤维细胞培养基，将支架放入细胞培养孵育箱中孵育。24小时后，移除环，并将每孔中的培养基更换为至少5毫升新鲜的成纤维细胞培养基。

加入培养基，确保支架完全浸没。一周后，弃去培养基，用镊子将支架的黏膜面朝上翻转。将环状物放回支架上，然后在每孔复合培养基0.2毫升中，向每个环的中心各加入一次六分之一的上皮细胞。

在环外区域填充约两毫升的复合培养基一，然后将构建物放回培养箱。24小时后，移除环状物，并向每孔中加入至少五毫升新鲜的复合培养基一，确保支架完全浸没。再过24小时后，更换培养基，加入至少五毫升的复合培养基二。

第四天，将无菌的医用级不锈钢网状支架放入新的六孔板的各孔中，并将构建物转移至支架上，黏膜面朝上。最后，加入足够的复合培养基三，使其达到构建物底部，同时保持表面暴露于空气中，确保样品维持在气液界面状态。该操作步骤中最关键的部分是建立气液界面。

如果难以确定网格是否与无菌移液管尖端的液体接触，可通过观察移液管尖端是否浸入液体来判断，因为当移液管尖端浸入时更容易看清。或者，可尝试轻轻摇动培养板，液体流动时更易观察，从而确认液体位于网格上且未覆盖样本。从逻辑上评估，上皮组织呈现出成熟的多层复层鳞状上皮结构，与正常人食管所见的结构相似但较薄，细胞在向表面迁移过程中逐渐变扁平，最终细胞核消失。

通过免疫组织化学方法对增殖和分化关键标志物进行表征，结果表明，该模型上皮的显微解剖结构与正常人食管上皮相似。例如，在天然食管和模型上皮中均观察到类似的细胞角蛋白14表达，染色仅局限于基底层细胞。该模型已成功改进，可通过用癌细胞替代原代上皮细胞以引入肿瘤细胞，从而体现出该模型的灵活性。

例如，鳞状细胞癌细胞在支架上形成可见的上皮层，表现为明确的黄色区域，上皮内存在较大的裂隙，这可能反映了功能失调的纤毛分子的存在；而在模型中引入食管腺癌细胞则会导致支架发生大量降解，肉眼可见支架变薄。经过两周的气液界面培养后，通过苏木精和伊红（H&E）分析证实，细胞下方区域的支架厚度明显减少。在此基础上，可对同一组织应用其他基因表达检测方法，如Northern印迹或Western印迹，以回答诸如“上皮层如何响应环境应激？”等问题。因此，该模型在其建立之后，为深入探究更多科学问题提供了极为宝贵的资源。

该技术为研究巴雷特食管化生的研究人员铺平了道路，使其能够研究特定反流成分暴露对正常人食管中基因表达的影响。