三维组织工程人食管黏膜型号生产，表征和潜在用途
May 18th, 2015
这份手稿描述了生产，表征和组织工程食管三维结构从正常原代人成纤维食管，并在脱细胞化猪接种支架鳞状上皮细胞制备的潜在用途。结果证明类似于正常人食道成熟复层上皮的形成。
该程序的总体目标是生成人类食管上皮的 3D 组织工程模型，用作实验平台。这是通过首先从人食管组织样本中分离正常人食管成纤维细胞和上皮细胞来实现的。在第二步中，将成纤维细胞接种到去上皮无细胞、孔征、食管支架上，并培养 7 天。
接下来，将支架倒置，并将分离的人食管上皮细胞加入培养物中 4 天。在最后一步中，将模型移至气液界面再培养 5 天，从而形成成熟的复层上皮。最终，免疫组化用于表征模型上皮细胞表达的增殖和分化的关键标志物。
与传统的 2D 细胞培养相比，该技术的主要优点是它允许细胞进行细胞、细胞和细胞基质的相互作用，就像它们在体内一样。使用这种技术，我们可以产生类似于正常食管的成熟分层鳞状上皮。一般来说，刚接触这种方法的人会因为三个原因而挣扎。
第一，确保大多数上皮细胞在被纳入支架之前不分化可能是一个挑战。第二，必须注意确保在上皮成熟期间提供正确的气液界面。第三，在整个文化时期保持活力可能是一个挑战。
为了分离人食管上皮细胞，将收获的食管鳞状粘膜组织放入无菌培养皿中，并使用乙醇灭菌的手术刀将组织切成 0.5 厘米的条状。然后将组织在 37 摄氏度覆盖的 0.1% tryin 中孵育，一小时后用 5 毫升 FCS 停止消化。接下来，用镊子握住条带，用手术刀刀片轻轻刮擦每条条带上皮表面一到两分钟，将上皮细胞去除到周围的培养基中，当所有条带都被刮掉后，将含有分离的上皮细胞的培养基转移到 15 毫升离心管中。
离心细胞后，丢弃番泻叶，将沉淀重悬于 12 mL 上皮培养基中。然后丢弃 Fetter 细胞培养物中的培养基，使用无菌移液器将上皮细胞接种在饲养细胞上，以分离人食管成纤维细胞。将刮下的组织条转移到无菌培养皿中，最后用手术刀将组织切碎。
在 10 毫升 0.5% 胶原酶（一种覆盖 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的溶液）中消化碎片，并在潮湿的气氛中过夜。第二天，将消化物转移到 50 mL离心管中，然后离心细胞。将上颚悬浮在 10 毫升成纤维细胞培养基中。
在细胞培养箱中的 T 75 培养瓶中培养。为了准备脱细胞的猪食管支架，首先使用剪刀和一把镊子纵向切开猪食道。接下来，在含有 100 毫升无菌 PBS 的 180 毫升无菌罐中清洗食管 10 分钟，轻轻摇晃以去除冲洗组织时的任何碎屑。
当软木塞在食道中干燥时，将含有 70% 乙醇的软木解剖板喷洒到板上，粘膜面朝上。现在，使用无菌镊子抓住食道一端的粘膜表面，并将组织从板上拉出，将粘膜与下面的粘膜下层分开。然后使用无菌手术刀刀片，沿固有唇纵向解剖食道，随着解剖的进行去除销钉，以便将粘膜抬起。
丢弃下面的粘膜下层，用手术刀将剩余的粘膜切成 5 厘米见方的块。如刚才所示，在 150 毫升无菌 PBS 中轻轻搅拌洗涤碎片。5 分钟后，将组织转移到装有 150 毫升 1 摩尔氯化钠溶液的 180 毫升罐中。
补充 37 度的抗生素。72 小时后，将组织转移到 150 毫升无菌 PBS 中，此时上皮将开始明显地与下面的组织分离。使用无菌镊子和手术刀刀片去除脱落的上皮细胞，将剩余的组织放入一罐 150 毫升无菌 PBS 中，轻轻搅拌三次，每次洗涤 5 分钟，组织现在必须在甘油中储存至少四个月。
为了对支架进行完全消毒，通过对已在甘油中消毒至少四个月的猪支架片进行再水化来开始制备食管粘膜模型。在 100 毫升无菌 PBS 中进行 5 次，每次 10 分钟的搅拌。每次洗涤用新鲜的 PBS 替换脊髓酸酯。
第五次搅拌后，在 37 摄氏度的 100 毫升 DMEM 中孵育过夜，测试支架无菌性。第二天早上，将支架转移到粘膜下层朝上的六孔板的各个孔中。然后将无菌医用级不锈钢环放在每个脚手架的中心，并使用无菌镊子轻轻按压环，以确保与组织充分密封五次。
将 5 个人食管成纤维细胞在 0.2 毫升成纤维细胞培养基中居中，放入每个环的中心。然后用至少两毫升的成纤维细胞培养基淹没环外侧的区域，并在细胞培养箱中孵育支架。24 小时后，取下环，用至少 5 mL 新鲜成纤维细胞替换每个孔中的培养基。
中等，注意脚手架完全浸入。一周后，丢弃培养基，用镊子将支架粘膜表面朝上倒置。将环放回支架上，然后在 0.2 毫升复合培养基中加入六个上皮细胞的一个时间中心，一个添加到每个环的中心。
用大约 2 毫升复合培养基 1 堵住环外的区域，然后将构建体放回培养箱中。24 小时后，取下环，用至少 5 毫升新鲜复合培养基更换每个孔中的培养基，其中 1 毫升，确保支架完全浸没。再过 24 小时后，用至少 5 毫升的复合培养基替换培养基。二。
第四天，将无菌医用级不锈钢网状网格放入新的六孔板的孔中，并将构建体转移到粘膜面朝上的网格中。最后，添加足够的复合介质 3 以到达复合材料的底面，同时使表面暴露在空气中，确保样品保持在气液界面。该过程最棘手的部分是设置气液接口。
如果不清楚网格是否与无菌管尖接触，因为更容易看到管道是否浸没。或者，您可以尝试轻轻摇动板，因为在板移动时更容易看到液体，并检查网格上是否有液体并且没有覆盖样品。这样，对上皮的逻辑评估呈现出一个成熟的多层分层鳞状上皮，与正常人食管观察到的相似但更薄，细胞逐渐变平，最终在向表面迁移时形成核。
增殖和分化关键标志物的免疫组织化学表征表明，模型上皮的显微解剖结构与正常人食管上皮的显微解剖结构相似。例如，在天然食管和模型上皮中观察到相当的细胞角蛋白 14 表达，染色仅限于基底层的细胞。该模型已成功修改为通过用癌细胞替换原代上皮细胞来掺入肿瘤细胞，证明了该模型的灵活性。
例如，鳞状癌细胞产生一个上皮，在结构上可见为明确的黄色区域，上皮内有大裂缝，可能反映了存在功能失调的细胞分子，包括模型内的食管腺癌细胞，导致大量支架降解，肉眼可见，作为支架变薄。在气液界面生长两周后，并在 h 和 e 分析中证实细胞下方区域的支架厚度明显减少。在此程序之后，可以将其他基因表达方法（如 northern 或 western 印迹）应用于同一组织，以回答以下问题： 上皮细胞如何对环境压力做出反应？因此，这为更深入地研究更多问题提供了一个非常有价值的资源。
这项技术为对巴雷特化生感兴趣的研究人员研究暴露于特定反流成分对正常人食管中基因表达的影响铺平了道路。
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概述
本手稿描述了人类食管上皮3D组织工程模型的生产和特征分析。该模型是使用正常初级人类食管成纤维细胞和上皮细胞种植在脱细胞猪基质中而创建的。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 再生医学
- 细胞生物学
背景
- 人类食管是消化系统的关键器官。
- 当前用于研究食管组织的模型有限。
- 组织工程为创建功能性组织模型提供了潜在的解决方案。
- 了解食管上皮的发育对于治疗应用至关重要。
研究目的
- 开发人类食管上皮的3D组织工程模型。
- 提供研究食管生物学的实验平台。
- 对上皮细胞的增殖和分化进行特征分析。
所用方法
- 从组织样本中分离正常人类食管成纤维细胞和上皮细胞。
- 将成纤维细胞种植到脱细胞食管基质上。
- 翻转基质以添加上皮细胞进行进一步培养。
- 在气液界面培养以促进分层上皮的发展。
主要结果
- 形成与正常人类食管相似的成熟分层上皮。
- 成功特征化增殖和分化的关键标志物。
- 证明基质适用于组织工程应用。
- 在再生医学和疾病建模中的潜在用途。
结论
- 开发的3D模型有效模拟了人类食管上皮。
- 该模型可作为未来研究的宝贵工具。
- 进一步的研究可以探索其在药物测试和疾病研究中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Biopharma R&D faces a critical need for physiologically relevant human esophageal models to improve predictive confidence in drug response and disease mechanism studies. This 3D tissue-engineered esophageal mucosal model enables robust interrogation of cell-cell and cell-matrix interactions, supporting translational continuity from early discovery through preclinical research. Its flexibility to incorporate normal, metaplastic, or tumor-derived cells positions it as a reusable platform for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a human-relevant, stratified epithelial context.
- Supports biological de-risking by recapitulating in vivo cell interactions and tissue architecture.
- Facilitates functional target validation through manipulation of environmental and pharmacological exposures.
- Provides a platform for mechanistic studies of disease progression and cellular response.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Enables assay standardization and reproducibility through extended culture and controlled exposures.
- Delivers quantitative outputs via immunohistochemical and histological characterization.
- Supports reliable evaluation of drug efficacy and toxicity in a mature epithelial environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling normal, metaplastic, and neoplastic esophageal mucosa.
- Enables study of chronic and repeated exposures, supporting translational biomarker discovery.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling tumor invasion and drug responsiveness.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in a human tissue context.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing a physiologically relevant platform for hypothesis testing and compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in a stratified human tissue model.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assay outputs for compound and environmental factor testing.
- Analytics: Provides immunohistochemical and histological readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Models disease progression and biomarker response in a human-relevant system.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform adaptable to various cell types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in esophageal research.
- Operational Value: Standardizes 3D tissue culture, enabling reproducibility and scalability across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of esophageal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3D tissue culture, and scaffold preparation.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue processing and immunohistochemical analysis.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions and analytical endpoints.
- Adaptable to various cell sources, including tumor and metaplastic lines, for diverse research needs.
- Culture maintenance and air-liquid interface setup present practical challenges for new users.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:05
Human Esophageal Epithelial Cell and Fibroblast Isolation
4:08
De-cellularized Pig Esophageal Scaffold Preparation
6:27
Human Esophageal Mucosa Model Preparation
9:44
Results: Representative 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosa
11:26
Conclusion
