Name: 三维组织工程人食管黏膜型号生产，表征和潜在用途 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: 了解利用脱细胞猪食管支架培养人食管成纤维细胞和上皮细胞，构建三维组织工程人食管黏膜模型的方法。该模型可用于研究食管生物学和再生医学应用。

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我们感谢谢菲尔德教学医院NHS基金会信托的顾问外科医生Roger Ackroyd先生、Andrew Wyman先生和Chris Stoddard先生在获取食管组织样本方面提供的帮助以及对我们工作的支持。我们感谢Ashraful Haque在将肿瘤细胞系整合到模型中所提供的协助。本研究得到了Bardhan研究与教育信托基金（BRET）和约克郡癌症研究（YCR）资助项目的经费支持，特此致谢。

人食管细胞取自接受胃部或食管手术的患者。已获得患者知情同意，允许将组织用于科研目的，并在相应的伦理批准（SSREC 165/03，人类研究组织库许可证 12179）下匿名使用该组织。
1. 人食管上皮细胞的分离
<ol>
	<li>在超净工作台内操作，并采用无菌技术，通过将DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）与Ham’s F12培养基按3:1（v:v）体积比混合，配制上皮细胞培养基。加入10%（v/v）胎牛血清（FCS）、10 ng/ml表皮生长因子、0.4 µg/ml氢化可的松、1.8 x 10-4 M 腺嘌呤、5 µg/ml胰岛素、5 µg/ml转铁蛋白、2 x 10-7 M 三碘甲腺原氨酸、1 x 10-10 M 霍乱毒素、2 x 10-3 M 谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B。</li>
	<li>采用标准无菌技术，向T75细胞培养瓶中加入11 ml DMEM、10% FCS、2 x 10-3 M L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B。加入1 x 106个经致死剂量照射的小鼠3T3成纤维细胞12（溶于1 ml相同培养基中），于37 °C、5% CO2、湿润环境中过夜培养。此步骤将形成后续上皮细胞培养所需的饲养层。</li>
	<li>使用手术刀，并依据病理学家的建议，从接受胃或食管手术患者的非病变背景区域获取约2 cm2的食管鳞状黏膜组织样本。将组织置于含50 ml无菌转运液（PBS，含100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B）的50 ml容器中，室温运送至实验室。</li>
	<li>此时可将组织在转运液中于4 °C保存最多12小时（过夜），以方便操作；但不应延长保存时间，以免导致细胞活力下降。</li>
	<li>在超净工作台内操作，并采用无菌技术，将手术刀片浸入70%乙醇中5分钟以进行灭菌，随后用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>将组织置于无菌培养皿中，用手术刀将其切成0.5 cm长的条状。向培养皿中加入5 ml含0.1%（w/v）胰蛋白酶的PBS，盖上皿盖，在37 °C孵育1小时。</li>
	<li>向培养皿中的组织加入5 ml FCS以终止胰蛋白酶活性。用无菌镊子夹住组织条，用手术刀片轻轻刮擦每条组织的上皮表面1-2分钟，使上皮细胞脱落至周围液体中。移除刮过的组织并弃去。对所有组织条重复该过程。</li>
	<li>收集含有脱落上皮细胞的液体至15 ml离心管中，离心（5分钟，200 x g）。弃去上清液，将沉淀物重悬于12 ml上皮细胞培养基（见步骤1.1所述）中。</li>
	<li>弃去步骤1.2中制备的T75培养瓶内饲养层细胞的培养液。使用无菌移液管将含有新鲜分离上皮细胞的悬液加入该培养瓶中，于37 °C、5% CO2、湿润环境中继续培养。</li>
	<li>24小时后，弃去旧培养液（其中含有细胞碎片），更换为12 ml新鲜上皮细胞培养基。继续在37 °C、5% CO2、湿润环境中培养。接下来24至48小时内将开始出现细胞克隆，可通过将培养瓶置于普通光学显微镜下观察。每2至3天更换一次等体积的新鲜培养液。</li>
	<li>当培养瓶中细胞融合度达到80%时，进行传代13。以1:5比例传代，以增加用于模型构建的细胞数量。在传代前24小时，按照步骤1.2操作，在每个将要接种上皮细胞的培养瓶中建立经照射处理的3T3细胞饲养层。 
	注意：用于下述食管模型的上皮细胞仅限于第1至第4代之间使用。</li>
</ol>
2. 人食管成纤维细胞的分离
<ol>
	<li>在超净工作台中操作，并采用无菌技术，取步骤1.7中预留的组织，放入无菌培养皿中，用无菌手术刀片将其充分切碎。加入10 ml 0.5%（w/v）胶原酶A溶液，盖上培养皿盖，于37 °C、5% CO2、湿润环境中过夜孵育。</li>
	<li>将消化后的悬液转移至15 ml离心管中，离心（10分钟，200 × g），小心倾去并弃除上清液，将沉淀物重悬于10 ml成纤维细胞培养基（DMEM，含10%胎牛血清、2 × 10-3 M L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B）中。</li>
	<li>将细胞悬液接种至T75培养瓶中，于37 °C、5% CO2、湿润环境中培养。24小时后，弃去含有碎片的培养基，更换为12 ml新鲜成纤维细胞培养基。每2至3天更换一次培养基，当细胞融合度达到80%时进行传代13，按1:5比例分瓶以增加细胞数量。 
	注意：在下文所述模型中使用的成纤维细胞，仅限于第4至第10代之间。</li>
</ol>
3. 脱细胞食管支架的制备
<ol>
	<li>从用于食品生产的、刚屠宰的长白猪的屠宰场获取完整的猪食管。单根食管可为约30个独立构建体提供足够的支架材料。 
	注意：由于所需的灭菌程序复杂且耗时，通常建议一次至少获取并处理10根食管。</li>
	<li>立即将新鲜切除的食管放入含有约150 ml 10%聚维酮碘溶液的180 ml无菌容器中，浸泡5分钟，以减少可能的微生物污染。随后将食管转移至第二个含有约100 ml无菌PBS（含200 IU/ml青霉素、200 µg/ml链霉素和1.25 µg/ml两性霉素B）的容器中。
	<ol>
		<li>盖上容器盖子，并在室温下将食管运回实验室。根据食管大小，每个容器可运输两到三根食管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>到达实验室后，在超净工作台中采用无菌操作技术处理组织，以最大限度减少微生物污染。将镊子、剪刀和手术刀片在70%乙醇中浸泡5分钟进行消毒，然后用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>使用无菌镊子夹持食管，用剪刀沿纵向切开食管。将食管放入含有约100 ml无菌PBS的180 ml无菌容器中，轻轻振荡以去除残留碎片，对组织进行冲洗。</li>
	<li>用大量70%乙醇喷洒软木解剖板进行清洁，并待其自然干燥。</li>
	<li>将食管从PBS中取出，使用无菌针将其固定在解剖板上，黏膜面朝上。用无菌镊子夹住食管一端的黏膜表面并轻轻拉离解剖板，使黏膜与下方的黏膜下层分离。
	<ol>
		<li>然后使用无菌手术刀片沿固有层纵向解剖食管，在解剖过程中逐步移除固定针，以便将黏膜完全剥离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保留已分离的黏膜组织，弃去下方的黏膜下层。</li>
	<li>切除并弃去黏膜最近端和最远端各2 cm的区域，因为这些区域分别含有较多的黏膜下腺体和更厚的固有层7。</li>
	<li>使用手术刀将剩余组织切成5 cm2大小的片状。将所有切割后的组织放入含有约150 ml无菌PBS的180 ml无菌容器中，轻轻振荡以清洗组织。若同时处理超过五根食管，则可能需要在本步骤及后续三个步骤中使用多个容器。</li>
	<li>使用无菌镊子将切割后的组织转移至含有150 ml无菌1 M NaCl、200 IU/ml青霉素、200 µg/ml链霉素和1.25 µg/ml两性霉素B的180 ml无菌容器中。在37 °C下孵育72小时。</li>
	<li>将组织放入新的180 ml无菌容器中，加入150 ml无菌PBS。此时上皮层将开始明显与下方组织分离。使用无菌镊子轻轻剥离并移除脱落的上皮层，弃去。
	<ol>
		<li>将剩余组织转移至另一个新的180 ml无菌容器中，加入150 ml无菌PBS，轻轻振荡5分钟进行清洗。倒去PBS，再用新鲜PBS重复清洗两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有组织放入含有400 ml无菌80%（v/v）甘油溶液的500 ml玻璃瓶中，在室温下处理24小时。随后转移至含有400 ml无菌90%（v/v）甘油溶液的容器中，继续处理24小时。</li>
	<li>将组织保存在400 ml无菌100%甘油溶液中，室温下至少保存4个月，以实现组织脱水和灭菌，同时保持基底膜的完整性。</li>
</ol>
4. 培养基的制备
<ol>
	<li>准备螯合的新生小牛血清用于培养基。
	<ol>
		<li>将100 g Chelex 100倒入一个1 L玻璃瓶中，加入去离子水。水的精确体积不关键，但需加入足够量以完全覆盖Chelex粉末。加入磁力搅拌子，通过高压灭菌（121 °C，15分钟）进行灭菌。</li>
		<li>让瓶子冷却并使Chelex沉淀。在超净工作台中倾去多余的水，加入500 ml新生小牛血清（NCS），于4 °C下搅拌过夜。</li>
		<li>停止搅拌，待Chelex完全沉淀（可能需要长达30分钟）。在超净工作台中使用无菌移液管小心倾出螯合后的血清，注意不要扰动Chelex，然后以10 ml分装储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在超净工作台中配制三种不同的培养基，从促增殖型开始，最后配制促分化型。
	<ol>
		<li>配制复合培养基I：由DMEM与Hams F12以3:1（v:v）比例混合，含4 × 10-3 M L-谷氨酰胺、0.5 µg/ml氢化可的松、1 × 10-4 M O-磷酸乙醇胺、2 × 10-12 M三碘甲腺原氨酸、1.8 × 10-4 M腺嘌呤、1.88 × 10-3 M CaCl2、4 × 10-12 M孕酮、10 µg/ml胰岛素、10 µg/ml转铁蛋白、10 ng/ml硒、1 × 10-3 M乙醇胺以及0.1%（v/v）螯合NCS。</li>
		<li>配制复合培养基II，成分同复合培养基I，但将螯合血清替换为0.1%（v/v）非螯合NCS。</li>
		<li>配制复合培养基III，成分同复合培养基II，但省略孕酮，并将血清浓度提高至2%（v/v）非螯合NCS。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 人食管黏膜模型的制备
<ol>
	<li>所有操作均须在超净工作台内进行，采用无菌技术以维持无菌环境。所有工具使用前需在70%乙醇中浸泡5分钟进行灭菌，随后用无菌PBS冲洗。</li>
	<li>在需要使用的前一天，对无细胞猪源性食管支架进行再水化处理。每制备一个构建体需使用一片支架。
	<ol>
		<li>将足够数量的猪源性支架放入盛有100 ml无菌PBS的容器中，充分搅拌并浸泡10分钟以实现组织再水化。倾去PBS并更换新鲜PBS。重复洗涤五次，以确保彻底去除所有甘油残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将再水化后的组织在37 °C条件下于100 ml DMEM培养基中过夜孵育，检测支架的无菌性。若孵育结束后培养基的颜色或浊度未发生变化，则认为支架无菌。确认无菌后，将5 cm2的无细胞支架放入6孔板中，黏膜下层朝上。</li>
	<li>将无菌医用级不锈钢环（内径10 mm，外径20 mm）置于每片支架中央，使用无菌镊子轻轻按压，确保其与组织形成良好密封。</li>
	<li>使用胰蛋白酶-EDTA13消化收集成纤维细胞，制备细胞悬液。使用血细胞计数板14进行细胞计数。离心细胞悬液（10分钟，200 × g）。将细胞沉淀重悬于适量成纤维细胞培养基中，调整终浓度为每毫升含2.5 × 106个细胞。</li>
	<li>在每个环内加入0.2 ml含5 × 105个人食管成纤维细胞的成纤维细胞培养基。在环外周区域加入约2 ml成纤维细胞培养基。于37 °C、5% CO2、湿润环境中孵育。</li>
	<li>24小时后，移除钢环及成纤维细胞培养基，向每孔加入至少5 ml新鲜成纤维细胞培养基，确保支架完全浸没于培养基中。于37 °C、5% CO2、湿润环境中继续培养1周，每2至3天更换一次培养基。</li>
	<li>1周后，将含支架的6孔板转移至超净工作台，吸除培养基，并使用无菌镊子将每片支架翻转，使黏膜面朝上。此时间点记为第0天（Day 0）。</li>
	<li>参照步骤5.4，在组织黏膜面中央放置钢环。</li>
	<li>准备T75培养瓶中的上皮细胞用于胰蛋白酶消化13。在PBS洗涤后、加入胰蛋白酶-EDTA溶液前，向每瓶中加入2 ml无菌0.02%（w/v）EDTA溶液。于37 °C孵育2分钟。轻拍培养瓶，选择性地使i3T3饲养层细胞脱落，而上皮细胞仍附着于瓶壁。
	 
	注：通常无需也不实际将上皮细胞与前一周已整合于模型中的成纤维细胞进行患者匹配。</li>
	<li>倾去含饲养层细胞的EDTA溶液，加入胰蛋白酶-EDTA溶液以收获上皮细胞13。使用血细胞计数板14进行细胞计数。离心细胞悬液（10分钟，200 × g）。将细胞沉淀重悬于适量复合培养基I（Composite Medium I）中，调整终浓度为每毫升含5 × 106个细胞。</li>
	<li>在环内加入0.2 ml含1 × 106个上皮细胞的复合培养基I。在环外周区域加入约2 ml复合培养基I，并将构建体置于37 °C、5% CO2、湿润环境中孵育。</li>
	<li>24小时后（第1天），移除钢环及培养基，加入至少5 ml新鲜复合培养基I，确保支架完全浸没，然后放回孵箱。再过24小时后（第2天），更换为至少5 ml复合培养基II，同样确保支架完全浸没，然后放回孵箱。</li>
	<li>第4天，将无菌医用级不锈钢网格（2 cm宽 × 2 cm长 × 0.5 cm高）放入新的6孔板中，每构建体一个。使用无菌镊子将构建体转移至钢网顶部，黏膜面朝上。
	<ol>
		<li>加入足量的复合培养基III，使液体刚好接触构建体底部，而表面暴露于空气中，以确保样本维持在气-液界面状态。所需培养基的确切体积取决于支架厚度、孔板容积及不锈钢网的确切高度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据实验需求，将构建体在气-液界面条件下维持10至20天（第14天至第24天）。每2至3天（建议采用周一、周三、周五的更换方案）更换新鲜的复合培养基III。
	 
	注：在气-液界面培养5天后（第9天），构建体已形成足够成熟的食管上皮，可用于研究环境因素对食管上皮影响的实验。</li>
	<li>实验结束后，将构建体固定用于组织学分析及免疫组织化学染色7，或从上皮层提取蛋白15或RNA11,16用于进一步分析。如需，可保留条件培养基用于细胞外信号分子的分析17。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种具有生物学意义的人类食管黏膜模型的构建与表征，该模型可作为实验平台，用于研究环境应激因素暴露对食管上皮的影响。
成功构建人食管黏膜模型最关键的步骤包括：确保大部分上皮细胞保持增殖状态，在接种到支架前尚未开始分化；维持复合体的气-液界面，以保证上皮的正确成熟；在整个长期培养过程中保持无菌状态。
由于可用于细胞分离的人体组织量有限，通常无法从单个组织样本中获得足够数量的细胞，直接将 freshly isolated 的细胞接种到支架上，因此需要一个细胞扩增阶段，在此阶段中，细胞在标准的二维细胞培养条件下进行培养。在此期间，必须确保细胞保持增殖能力。为此，应避免培养物达到完全汇合状态，仅使用传代次数不超过4代的细胞，并密切监测细胞形态。因此，细胞应保持其特有的增殖性多边形形态，以及增殖性上皮细胞典型的紧密“鹅卵石”样铺路石外观，而不是出现已经开始分化的培养物中所观察到的更为弥散的形态。第二个关键步骤是通过确保细胞培养基覆盖用于将培养物提升至气液界面的不锈钢网格的上表面，但构建物本身的最上层表面不被浸没来实现控制。第三个...

食管黏膜由位于结缔组织层（即固有层）上方的复层鳞状上皮构成，是最早接触摄入性环境应激原的部位之一。饮食毒素的暴露与食管鳞状细胞癌的发生相关，而十二指肠胃食管反流则是巴雷特化生发病机制中的关键因素，后者与进展为食管腺癌的风险增加相关。食管癌是全球第8位常见恶性肿瘤th 英国男性中最常见的恶性肿瘤，且食管腺癌在西方世界正迅速增加1此外，该疾病的预后改善甚微，总体5年生存率约为15%。因此，亟需建立实验平台，以研究环境应激因素对食管上皮的影响，及其在化生或肿瘤发生中的潜在作用。
尽管永生化细胞系或肿瘤细胞系可使研究人员研究上皮细胞对这些应激因素的反应 体外它们仍保持增殖状态，无法分化为食管黏膜最表层所存在的成熟上皮细胞。此外，已经发生肿瘤转化的细胞系可能仅能提供有限信息，用以了解正常上皮细胞在早期阶段对环境因素刺激的初始反应；而这一阶段恰恰可能是治疗干预潜力最高的时机。最后，传统的细胞培养系统无法模拟组织中上皮细胞与间充质细胞之间，以及这些细胞与周围基质之间可能存在的关键相互作用。 体内.
动物模型为研究食管上皮的反应提供了更接近真实的微环境，并可人为诱导胃食管反流病2。然而，在这些模型中调控环境应激因素可能更具挑战性，且其反应可能无法完全代表人体食管内的实际情况。
已开发出其他利用原代细胞、永生化细胞或肿瘤细胞系的人类食管实验模型，这些模型以含有成纤维细胞的胶原蛋白或混合胶原蛋白/Matrigel支架为基础3,4。与本文所述的脱细胞猪食管支架相比，制备此类支架所需劳动强度较低，且这些类器官模型提供了有用的工具，尤其适用于肿瘤侵袭研究5,6，因为在这些模型中可直接观察肿瘤细胞向胶原凝胶中的浸润过程。然而，这些胶原凝胶具有非天然的力学特性，并缺乏原始组织的某些特征，包括特定的基底膜结构和适当的表面拓扑结构。这可能影响细胞行为，例如使用胶原凝胶支架时，上皮与支架之间的黏附性较差7。因此，人们开发了脱细胞猪食管支架，其优势在于生物学特性更接近真实组织，因而更适合作为实验平台。此外，已有研究表明，在食管构建物中使用原代细胞优于使用永生化的食管上皮细胞系（如Het-1A），因为后者虽能形成多层上皮，但无法正常分层或分化4,7,8。
因此，本实验方案改编自MacNeil实验室已有的构建组织工程化皮肤和口腔黏膜的方法9,10，并结合了脱细胞猪食管支架与原代人食管上皮细胞及成纤维细胞。该方案可生成成熟的、分层的上皮结构，其特征与正常人食管上皮相似，经CK4、CK14、Ki67和兜甲蛋白（involucrin）染色证实。所建立的模型为研究环境应激因素的反应提供了实验平台，并已成功用于探究食管上皮在接触胃食管反流物成分后基因表达的变化11。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白酶</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td>用 PBS 配制 0.1% w/v 溶液，并过滤除菌。使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Labtech</td><td>LM-D1112</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Labtech</td><td>LM-H1236</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Labtech</td><td>FB-1090</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>R+D Systems</td><td>236-EG-200</td><td>用 10 mM 乙酸、1% FCS 配制 200 &amp;micro;g/ml 储存液</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td>用 PBS 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786</td><td>用 PBS 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2767</td><td>用 0.01&amp;nbsp;M HCl 配制 10 mg/ml 溶液，再用蒸馏水稀释 1:10，并在使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2036</td><td>用蒸馏水配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752</td><td>用蒸馏水配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>用水配制储存液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td>商品名 Fungizone</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxoid</td><td>BR0014</td><td>将 1 片溶解于 100&amp;nbsp;ml 水中，高压灭菌以除菌</td></tr><tr><td>胶原酶 A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Ecolab</td><td>10830E</td><td>商品名 Videne</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Gibco</td><td>26010074</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-磷酸乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503</td><td>用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌</td></tr><tr><td>ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒）</td><td>Lonza</td><td>17-838Z</td><td>用于复合培养基的配制</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>0.02% EDTA 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td>使用前在 37&amp;nbsp;&amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher</td><td>11819650</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 通用管</td><td>SLS</td><td>SLS7504</td><td></td></tr><tr><td>180 ml 烧杯</td><td>VWR</td><td>216-2603</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>SLS</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢环</td><td></td><td></td><td>自行制造——医用级不锈钢，内径 10 mm，外径 20 mm</td></tr><tr><td>钢丝网格</td><td></td><td></td><td>自行制造——板材上孔径为 0.3 cm，弯曲成 2&amp;nbsp;cm（宽）× 2 cm（深）× 0.5 cm（高）的网格</td></tr><tr><td>ki67</td><td>Novocastra</td><td>KI67-MM1-L-CE</td><td>克隆号 MM1。使用比例为 1:100。</td></tr><tr><td>CK4</td><td>Abcam</td><td>ab9004</td><td>克隆号 6B10。使用比例为 1:200。</td></tr><tr><td>CK14</td><td>Novocastra</td><td>LL002-L-CE</td><td>克隆号 LL002。使用比例为 1:200。</td></tr><tr><td>兜甲蛋白</td><td>Novocastra</td><td>INV</td><td>克隆号 SY5。使用比例为 1:100。</td></tr><tr><td>OE21</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96062201</td><td></td></tr><tr><td>OE33</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96070808</td><td></td></tr><tr><td>Het-1A</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-2692</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 3T3 成纤维细胞</td><td>ATCC-LGC</td><td>CRL-1658</td><td>此前经辐照（60 Gy）使其生长停滞</td></tr></tbody></table>

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

食管腺癌及其癌前病变巴雷特食管的发病率在西方世界正迅速上升。此外，食管腺癌通常预后较差，近年来生存率几乎没有改善。这些疾病难以研究，且一直缺乏合适的实验平台来探究食管黏膜的病变。
MacNeil 实验室已开发出一种人类食管黏膜模型，该模型与传统的二维细胞培养系统不同，能够重现细胞间及细胞与基质间的相互作用 体内 并形成类似于正常人食管的成熟、分层上皮。简而言之，该模型利用未转化的正常原代人食管成纤维细胞和上皮细胞，在猪源性去细胞食管支架内进行培养。通过CK4、CK14、Ki67和兜甲蛋白（involucrin）染色对该模型进行免疫组织化学表征，结果表明其能够准确再现正常人食管黏膜的组织学特征。
该模型提供了一个稳定且具有生物学相关性的人类食管黏膜实验模型。可通过该模型轻松探究多种研究问题，包括药物制剂的有效性以及酒精、毒素、高温或胃食管反流物成分等环境因素暴露的影响。此外，该模型支持较长期的培养，这是传统二维细胞培养所无法实现的，从而能够 例如研究特定因子对成熟上皮反复暴露长达20天的影响。此外，该模型还可整合多种细胞系，例如源自食管肿瘤或巴雷特化生的细胞系，以在更具生物学相关性的环境中研究肿瘤侵袭和药物反应性等过程。

本手稿描述了成功培养人食管上皮三维模型所需的步骤，该过程如图1所示。为验证该模型作为实验平台的适用性，已开展组织学和免疫组织化学研究，将培养的组织与正常人食管鳞状黏膜进行比较。
通过所述方法生成的上皮组织经组织学评估显示，其为成熟、多层的复层鳞状上皮（图2B），与正常人食管所见的上皮组织相似（图2A），但层数较薄（细胞层数为5至10层，而正常食管为10至20层），且细胞在向表面迁移过程中逐渐变扁平，最终失去细胞核。
对增殖和分化关键标志物的免疫组织化学表征表明，该模型上皮的显微解剖结构与正常人食管上皮相似。在天然食管和模型上皮中均观察到类似的Ki67表达，染色局限于基底层及紧邻的副基底层中的一部分细胞（图3A和3B）。这与已有研究报道一致，即正常食管上皮中通常少于10%的细胞表达增殖标志物Ki6718。CK4通常表达于复层和柱状上皮中，但...

本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。

食管腺癌及其癌前病变巴雷特食管的发病率在西方世界正迅速上升。此外……

本实验的总体目标是构建一种人食管上皮的三维组织工程模型，用作实验研究平台。首先从人食管组织样本中分离出正常的食管成纤维细胞和上皮细胞。第二步，将成纤维细胞接种至去上皮化的无细胞食管支架（具有孔状结构）上，并培养七天。接下来，将支架倒置，并加入分离的人食管上皮细胞，继续培养四天。最后一步是将模型转移至气液界面，再进行五天的培养，以促进成熟复层上皮的形成。最终，通过免疫组织化学方法对模型上皮细胞表达的增殖与分化关键标志物进行表征。与传统的二维细胞培养相比，该技术的主要优势在于能够使细胞形成在体内所具有的细胞-细胞及细胞-基质相互作用。通过该技术，我们能够生成类似于正常食管的成熟复层鳞状上皮。通常情况下，初次接触该方法的研究人员会在三个方面遇到困难。第一，确保大部分上皮细胞在被纳入支架前不发生分化可能具有挑战性。第二，在上皮组织成熟期间，必须注意提供正确的气液界面。第三，在整个培养期间维持其完整性也可能存在困难。为了分离人食管上皮细胞，将获取的食管鳞状黏膜组织置于无菌培养皿中，使用经乙醇消毒的手术刀将组织切成0.5厘米宽的条状。随后，将组织在0.1%胰蛋白酶中于37摄氏度条件下孵育，并在覆盖条件下消化1小时，然后加入5毫升胎牛血清（FCS）终止消化反应。接下来，用镊子夹住组织条，每条用刀片轻轻刮擦上皮表面1至2分钟，使上皮细胞脱落进入周围培养液中。当所有组织条均完成刮擦后，将含有脱落上皮细胞的培养液转移至15毫升离心管中。离心细胞后，弃去上清液，将沉淀重悬于12毫升上皮细胞培养基中。然后弃去饲养层细胞培养中的培养基，使用无菌移液管将上皮细胞接种到饲养层细胞上，以分离人食管成纤维细胞。将刮取的组织条转移至无菌培养皿中，最后用手术刀将组织切碎。将组织块放入10毫升含0.5%胶原酶A的溶液中，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿润环境中消化过夜。次日，将消化液转移至50毫升离心管中，离心收集细胞。用10毫升成纤维细胞培养基重悬腭部组织。将细胞培养瓶置于细胞培养箱中进行培养。制备脱细胞猪食管支架时，首先使用剪刀和镊子将猪食管纵向切开。随后，将食管放入含有100毫升无菌PBS的180毫升无菌容器中，在轻微振荡条件下洗涤10分钟，以去除组织冲洗过程中可能存在的任何残留碎片。当食管中的软木塞干燥后，将其黏膜面朝上放置在解剖板上，并用70%乙醇喷洒软木塞解剖板。然后使用无菌镊子夹住食管一端的黏膜表面，将组织从板上拉开，以分离黏膜层与其下方的黏膜下层。接着使用无菌手术刀片沿固有层纵向解剖食管，在解剖过程中逐步移除固定用的大头针，以便将黏膜完全剥离抬起。弃去下方的黏膜下层，使用手术刀将剩余的黏膜切成边长为五厘米的方形小块。如刚才所示，用150毫升无菌PBS轻轻振荡洗涤这些组织块。五分钟后，将组织转移至一个180毫升的容器中，容器内含150毫升1摩尔氯化钠溶液。在37摄氏度下加入抗生素孵育。72小时后，将组织转移至150毫升无菌PBS中，此时上皮层已开始明显与下方组织分离。使用无菌镊子和手术刀片去除脱落的上皮层，并将剩余组织置于新鲜的150毫升无菌PBS中，轻柔振荡洗涤三次，每次五分钟。此后，组织必须在甘油中保存至少四个月。为完全灭菌支架，首先开始食管黏膜模型的制备：将已在甘油中灭菌保存至少四个月的猪源性支架片段进行再水化处理。使用100毫升无菌PBS溶液，分五次、每次10分钟进行振荡洗涤，每次洗涤均需更换为新鲜PBS溶液。经过第五次搅动测试后，将支架在37摄氏度下于100毫升DMEM中过夜培养，以检测其无菌性。次日早晨，将支架转移至六孔板的各个孔中，黏膜下层朝上。然后将无菌医用级不锈钢环置于每个支架的中央，并使用无菌镊子轻轻按压环体五次，以确保其与组织之间形成充分的密封。将5个人食管成纤维细胞置于0.2毫升成纤维细胞培养基中，接种到每个环的中央。然后在环外区域加入至少2毫升以上的成纤维细胞培养基，将支架放入细胞培养箱中孵育。24小时后，移除环，并将每孔中的培养基更换为至少5毫升新鲜的成纤维细胞培养基。加入培养基，注意确保支架完全浸没。一周后，弃去培养基，用镊子将支架的黏膜面朝上翻转。将环状物重新放回支架上，然后在每个环的中央分别加入0.2毫升复合培养基中的上皮细胞悬液，每环加入一次。在环外区域填充约两毫升的复合培养基一，然后将构建物放回培养箱。24小时后，移除环，并向每个孔中加入至少五毫升新鲜的复合培养基一，确保支架完全浸没。再过24小时后，更换培养基，加入至少五毫升的复合培养基二。第四天，将无菌的医用级不锈钢网栅放入新的六孔板的各孔中，并将构建物转移至网栅上，黏膜面朝上。最后，加入足够的复合培养基三，使其达到构建物底部，同时保持表面暴露于空气中，确保样品维持在气液界面状态。该操作步骤中最关键的部分是建立气液界面。如果难以确定网格是否与无菌移液管尖端的液体接触，可通过观察移液管尖端是否浸入液体中来判断，因为液体中的物体更易观察。或者，可轻轻摇动培养板，液体流动时更易观察其存在，并确认液体位于网格上，而未覆盖您的样本。从逻辑上评估，上皮组织呈现出成熟的多层复层鳞状上皮结构，与正常人食管所见的结构相似但较薄，细胞在向表面迁移过程中逐渐变扁平，最终细胞核消失。通过免疫组织化学方法对增殖和分化关键标志物进行表征，结果表明，该模型上皮的显微解剖结构与正常人食管上皮相似。例如，在天然食管和模型上皮中均观察到类似的细胞角蛋白14表达，染色仅局限于基底层细胞。该模型已成功改进，可通过用癌细胞替代原代上皮细胞以引入肿瘤细胞，从而体现出该模型的灵活性。例如，鳞状细胞癌细胞在支架上形成可见的上皮层，表现为明确的黄色区域，上皮内存在较大的裂隙，这可能反映了细胞连接分子功能异常；在模型中引入食管腺癌细胞则会导致支架发生大量降解，肉眼可见支架变薄。经过两周的气液界面培养后，通过苏木精和伊红（H&E）染色分析证实，细胞下方区域的支架厚度明显减少。在此基础上，可对同一组织样本进一步采用其他基因表达检测方法，如Northern印迹或Western印迹，以回答诸如“上皮层如何响应环境应激？”等问题。因此，该模型在其建立之后，为深入探究更多科学问题提供了极为宝贵的资源。该技术为研究巴雷特食管化生的研究人员铺平了道路，使其能够研究特定反流成分暴露对正常人食管中基因表达的影响。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

三维组织工程人食管黏膜型号生产，表征和潜在用途

在本视频中，我们演示了制备一种脱细胞猪食管支架的方法，该支架保留了其生化结构和组成，可用于组织工程应用。...

脱细胞猪食管支架制备：一种由猪食管生成无细胞支架的技术

本视频介绍了一种体外培养技术，通过在脱细胞猪源支架内共培养原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞，生成 人源食管类器官构建物。这些三维培养模型能够模拟其体内组织对应物的功能和生理特性。...

食管三维筏式培养模型：一种体外培养技术用于构建人食管黏膜模型

本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。...

人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

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在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

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用于大鼠环周性食管重建的组织工程移植物

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

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利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

本文介绍了一种构建基础的三维（3D）肠道细胞系模型系统的方法，以及对固定后的肠道类似物进行石蜡包埋以用于光学显微镜观察的实验方案。通过对特定蛋白进行染色，可从单次实验中分析多个可视化参数，有望应用于临床前药物筛选研究。...

含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

了解利用脱细胞猪食管支架培养人食管成纤维细胞和上皮细胞，构建三维组织工程人食管黏膜模型的方法。该模型可用于研究食管生物学和再生医学应用。

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

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