Name: 一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习使用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞窗孔的标准化方法。该方案通过灌注固定、样本制备和定量图像分析，精确测量窗孔直径、频率和孔隙率，为研究肝脏功能和病理变化提供可靠的形态学数据。

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作者无致谢。

注意：所有涉及动物使用的操作均根据当地法律法规进行。我们的研究已获得悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循始终确保动物福利的指导原则。&#160;务必遵守研究所在国家关于动物实验的法律法规。
1. 透射电镜固定液制备方案
<ol>
	<li>对于100 ml固定液，准备&#160;将2 g多聚甲醛粉末加入25 ml蒸馏水中，置于锥形瓶内，加热至65 ºC，并用磁力搅拌器持续搅拌。 
	注意：戊二醛、多聚甲醛和二甲胂酸钠缓冲液均为有害物质，必须始终在通风橱中操作。</li>
	<li>65 ºC 加热 2 分钟，然后冷却。如有需要，边搅拌边逐滴加入氢氧化钠溶液，直至溶液完全澄清。 
	注意：氢氧化钠具有危险性，需小心操作。</li>
	<li>加入10 ml EM级储备液&#160;戊二醛，50 ml 0.2 M 卡可基酸钠缓冲液和 2 g 蔗糖，用磁力搅拌器搅拌。加入 2 ml 1.0 M CaCl₂2.</li>
	<li>用蒸馏水定容至 100 ml 前，调节 pH 至 7.4。终末固定液含有 2.5 % 戊二醛、2 % 多聚甲醛、2 mmol CaCl₂。2，0.1 M 中含 2% 蔗糖&#160; 卡可基酸盐缓冲液。确保总渗透压为440 mOsmol/L。24小时内使用。&#160;制备方法。</li>
</ol>
2. 肝脏灌注固定
<ol>
	<li>将灌注缓冲液和固定液预热至 35 - 37 ºC。排血缓冲液和固定液的正确温度有助于保持组织完整性。</li>
	<li>通过单次腹腔注射 50 mg/kg 氯胺酮（Ketamine）和 5 mg/kg 赛拉嗪（Xylazine）对动物进行麻醉。</li>
	<li>当动物达到深度麻醉状态（通过后肢回缩和尾部夹捏无反应来判断）后，使用钝头剪刀在动物腹部做 Y 形切口，暴露肝脏和门静脉。 
	注意：确保器械清洁，以避免微生物和一般碎屑污染样本，这些污染物在扫描电镜（SEM）下会明显可见。</li>
	<li>在门静脉上靠近肝脏和远离肝脏的位置分别绑两根非常松的缝线。</li>
	<li>使用合适尺寸的静脉套管（大鼠用 18 G，小鼠用 22 G）插入门静脉，并收紧缝线以固定套管。</li>
	<li>开始以 37 ºC 预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行灌注，灌注压力为 10 cm H2O。通常需要 5 至 20 ml PBS 才能将肝脏血液完全排出。 
	注意：切勿让气泡通过连接套管的管道进入肝脏，因为这会导致栓塞和压力相关的假象；若灌注压力过高，会造成肝细胞、肝窦和肝窦内皮细胞（LSEC）窗孔的损伤。</li>
	<li>切断腹部和胸腔段下腔静脉，使缓冲液可自由流出肝脏，从而防止反向高压对肝窦内皮细胞（LSECs）造成损伤。</li>
	<li>当肝脏血液完全排净后，将 PBS 替换为电镜固定液（EM fixative），继续灌注约 5 分钟，直至肝脏变硬且颜色变得非常苍白。</li>
	<li>停止灌注，用锋利的手术刀将固定的肝脏切成 1 - 2 mm3 的组织块。</li>
	<li>将组织在电镜固定液中后固定 24 - 72 小时，温度保持在 4 ºC。 
	注意：通常情况下，固定不足比过度固定更容易产生假象。</li>
	<li>后固定完成后，将固定液更换为 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，并在 4 ºC 下保存。 
	注意：以此方式保存的样本可在较长时间内保持良好状态（最长可达 12 个月），但为了获得最佳结果，建议尽早进行后续固定和观察。</li>
</ol>
3. 针式灌注
注意：针头固定法是一种灌注固定的变体，通过将固定剂直接注射到活检的肝组织中，使固定剂流经血管，从而清除血液并使组织块充分接触固定剂。操作时必须注意保持较低的注射压力，以避免因压力过高造成组织损伤18,19。
<ol>
	<li>从动物或受试者体内取出一小块肝脏组织，用生理盐水冲洗以去除血液和碎片。</li>
	<li>将生理盐水吸入装有细针头（通常为胰岛素注射器）的注射器中。</li>
	<li>将生理盐水极缓慢地注入肝脏组织，直至血液完全被冲洗出。可能需要多次注射。</li>
	<li>将电子显微镜固定液（EM fixative）吸入另一支装有细针头（通常为胰岛素注射器）的注射器中。</li>
	<li>将固定液极缓慢地注入肝脏组织，直至组织变硬且颜色呈浅褐色。可能需要多次注射。</li>
	<li>使用锋利的手术刀将固定的肝脏切成 1 - 2 mm3 的小块，在电子显微镜固定液中 4 °C 下孵育 24 - 72 小时。在进行二次固定前，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤三次。</li>
</ol>
4. 扫描电子显微镜样品制备
<ol>
	<li>用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗样品 3 次。为固定脂质，将样品在含 2% 四氧化锇的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中后固定 2 小时。 
	注意：彻底清洗非常重要，因为戊二醛与四氧化锇会发生交叉反应，并在扫描电镜（SEM）中产生伪影。</li>
	<li>用浓度递增的乙醇冲洗样品以开始脱水。先用 50% 乙醇冲洗 5 分钟；然后用 70% 乙醇冲洗 3 次，每次 5 分钟；再用 90% 乙醇冲洗 3 次，每次 5 分钟；接着用 100% 乙醇冲洗 2 次，每次 5 分钟；最后用 100% 乙醇（分子筛处理）冲洗 2 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>从样品中完全去除乙醇，替换为六甲基二硅氮烷（HMDS），在通风橱中放置 10 分钟。移除组织样品中的 HMDS，并使其自然挥发。 
	注意：HMDS 在低温下具有强吸湿性，因此在用于最终脱水步骤前应使其恢复至室温。</li>
	<li>可选择立即安装样品，或将其置于干燥器中保存，待进行扫描电镜（SEM）检测时再安装。</li>
</ol>
5. 封片
注意：正确的标本制备方法将最大限度地增加在扫描电镜下可用于分析的清晰界定的窦状隙数量。
<ol>
	<li>标记金属 SEM 样品台的底部，并在其顶部贴上双面导电碳胶带。</li>
	<li>使用解剖显微镜观察样品，确定具有最佳窦状隙结构的表面用于后续扫描电镜观察。将该表面朝上放置于样品台的碳胶带表面。</li>
	<li>将样品牢固地粘附在样品台上，样品现可进行溅射镀膜。</li>
</ol>
6. 包被
注意：在溅射镀膜仪中用一层薄导电金属（金或铂）对样品进行镀膜，可使样品接地，从而保护其免受电子束损伤。若镀层过厚，可能遮蔽感兴趣的结构。
<ol>
	<li>将样本放入自动精细溅射镀膜仪的真空腔中，设置模式为旋转并自动溅射镀膜45秒。使用铂金镀膜可获得更精细的细节，但金也适用。</li>
	<li>在固定好的肝组织样本的外表面涂上一层薄薄的导电碳漆，注意避免涂覆到窦状面。</li>
	<li>待样本完成铂镀膜且碳漆完全干燥后，即可用于扫描电子显微镜观察。样品可保存在干燥器中。</li>
</ol>
7. 使用扫描电子显微镜
<ol>
	<li>将样品放入扫描电子显微镜中，并使显微镜恢复真空状态。</li>
	<li>按照标准显微镜操作程序，从低倍率开始观察样品，逐步提高放大倍数。</li>
	<li>确保显微镜的工作距离、束斑大小和像散已适当调节。</li>
	<li>检查固定完整性。若肝窦内皮细胞（LSEC）基本无裂隙，且含有直径为 30 - 250 nm 的窗孔结构，通常表明样品制备成功。</li>
	<li>若肝窦存在大量裂隙或缺乏窗孔结构，则表明样品制备失败或存在显著病理改变。此时，应使用极细的剃须刀片对样品进行切片，重新镀膜后对切面进行分析，以寻找成功固定的肝窦区域。</li>
	<li>在约 15,000 - 20,000 × 放大倍数下，选择无碎片污染、固定良好且窗孔清晰可见的平坦LSEC表面（通常应包含至少10个窗孔）。</li>
	<li>每例肝脏样本应至少采集10个肝窦的图像，取自不同组织块的不同区域，每例肝脏至少使用两个组织块。每只动物采集10张15,000 - 20,000 × 放大倍数的显微照片，通常足以代表整个肝脏的窗孔定量分析。</li>
</ol>
8. 分析
注意：使用可从美国国立卫生研究院（NIH）免费下载的 ImageJ 软件来量化窗孔直径和频率（<a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a>）。
<ol>
	<li>打开 ImageJ 软件，并使用图像中嵌入的比例尺设置比例（截图 1）。</li>
	<li>在 ImageJ 中使用多边形工具，围绕 LSEC 的整个平坦区域进行描记，包括有孔区和无孔区。不要仅描记筛板区域，否则会导致孔隙率被错误地高估。排除细胞表面可能遮挡孔洞的任何大块碎片。</li>
	<li>测量孔径时，选择直线工具，穿过每个孔洞的最长直径画一条线，按“m”键测量该线段，再按“d”键（draw）将该线永久绘制在图像上。此线段定义为孔径。线段长度将显示在 ImageJ 的结果窗口中（截图 2）。</li>
	<li>测量 LSEC 胞质中所有大于 250 nm 的较大孔洞，包括真正的孔洞和间隙。间隙通常是由于灌注或固定不良导致的人工假象，但也可能由疾病或毒性引起。在后续分析中，间隙的数据将不纳入孔洞参数的计算。</li>
	<li>对于非圆形的间隙，应通过在 ImageJ 中围绕间隙描记轮廓并计算其面积来确定面积。</li>
	<li>将 ImageJ 结果窗口中的数据复制粘贴到 Excel 电子表格中，用于进一步分析。</li>
</ol>
9. 计算
<ol>
	<li>平均窗孔直径 = 所有窗孔直径的平均值（不包括间隙，间隙定义为 ≥ 250 nm）。</li>
	<li>窗孔面积 = πr2,&#160;其中半径 r 由各个窗孔直径计算得出（r = d/2），不包括间隙。</li>
	<li>孔隙率（%）= [Σ(πr2) /（分析的总面积 - Σ（间隙面积&#160; =）(µm2))] × 100。</li>
	<li>窗孔频率 = 窗孔总数 /（分析的总面积 - Σ（间隙面积）(µm2）。</li>
</ol>
10. 窗孔数据的展示
注意：在可能的情况下，包含窗孔量化数据的出版物应包括以下信息
<ol>
	<li>窗孔直径，并说明用于定义窗孔的边界直径范围（通常为 50 - 250 nm）、窗孔频率（个/µm2）和孔隙率（%）。</li>
	<li>需说明分析中是否包含间隙；应提供窗孔直径的频率分布图，并注明纳入分析的肝脏数量、组织块数量、图像数量及窗孔数量。</li>
</ol>

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<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

准确且可重复地测量肝窦内皮细胞状态的能力是理解这些高度特化细胞生物学的重要一步。新兴技术如结构照明显微镜32，原子力显微镜33&#160;以及 d-STORM（直接随机光学重建显微镜） 34 将提供有关这些细胞形态的重要信息 体外 但扫描电镜（SEM）仍是观察和测量其结构的主要方法 原位.
最关键的且技术上最具挑战性的步骤是初始固定：如果肝脏保存良好，后续步骤将产生易于观察且确实美观的肝窦图像。全肝灌注是确保良好固定的最有效方法，但在快速且低压条件下固定的针式灌注样本也可获得相当的结果。脱水肝脏样本吸收水分是导致扫描电镜图像质量差的另一个常见原因，但通过将样本正确储存在含有干燥剂的干燥器中，这一问题可轻易避免。
有必要对窗孔结构的定量方法进行标准化，以便能够比较和解读不同研究团队的研究结果。过去发表的数值存在较大差异，且关于这些数值获取方法的细节信息极少。本文提供了一种标准化的方法，用于确定和呈现描述窗孔超微结构的参数值。</...

肝窦内皮细胞（LSECs）是高度分化的内皮细胞，衬于肝窦壁内。LSECs 上具有无隔膜的穿胞孔，称为窗孔，直径为 50–250 nm。LSECs 表面最多有 20% 被窗孔覆盖，这些窗孔通常成群分布，每群由数十至数百个窗孔组成，称为筛板1-3（图 1）。窗孔允许血浆和纳米底物在血液与肝细胞之间转运，从而形成高效的超滤系统。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可因不同的生理状态、药物及疾病而发生改变。例如，禁食状态下窗孔比进食状态下更大4；2-二碘安非他明可增加窗孔数量5,6；而在衰老及多种疾病状态下，每个细胞的窗孔大小和数量均会减少7-13。准确测量窗孔的大小和数量，对于理解不同疾病、毒性及生理状态对 LSEC 形态的影响、其对肝功能的作用，以及开发调节窗孔的治疗干预手段具有重要意义1。
研究窗孔结构具有较大难度。窗孔的直径低于常规光学显微镜的分辨极限，因此以往只能通过电子显微镜观察完整肝组织或培养的肝窦内皮细胞（LSECs）中的窗孔。扫描电子显微镜（SEM）最常用于研究窗孔的大小、频率和孔隙率（即被窗孔穿孔的LSEC膜所占的百分比），因为SEM能够观察内皮表面的大范围区域，并可测量成千上万甚至数万个窗孔。尽管SEM具有实用价值，但基于SEM的研究所报道的LSEC参数（如窗孔大小、数量、频率和孔隙率）在文献中存在广泛差异（表1）。
窗孔和筛板是脆弱的结构，在样本制备过程中可能发生收缩、破裂、扩张或融合，因此需要谨慎处理以保持其完整性。灌注压力升高14；固定剂和缓冲液的渗透压不正确15；固定不充分或固定时间不足；以及固定后脱水和干燥速度过快，都是扫描电镜（SEM）样本处理中可能产生干扰超微结构保存的人工假象的因素（图2）。窗孔的丢失（“去窗孔化”）和窗孔收缩可能因固定不良而发生，导致窗孔直径减小和细胞通透性降低。此前已有文献描述过改进用于SEM分析样本保存的方法15–17，本文将对此进行讨论，并补充一些提高样本保存质量的实用建议。样本保存的主要目标是清除肝窦内的血液，以便观察肝窦内皮细胞（LSEC）表面结构，同时避免因高压或固定延迟造成的LSEC损伤。通过门静脉进行全肝灌注固定是肝脏固定的首选方法。如其他文献详细所述16,18，灌注必须在低压条件下进行（例如10 cm H2O），以避免与压力相关的人工假象及对LSEC的损伤，这类损伤通常表现为细胞膜上出现大范围的裂隙。然而，对于人类和动物的肝活检样本，采用针头直接灌注固定剂的方法也常能获得较为理想的固定效果，具体操作详见其他文献19。该技术包括将固定剂直接注入组织，直至血液被完全冲洗出样本，且组织变得坚实并完成固定。&#160;由于肝脏的自溶过程极为迅速，为防止超微结构发生改变，电子显微镜样本的固定必须在血流停止后尽快进行。
我们还提出了一种图像分析方法，可最大限度减少伪影的纳入，并对窗孔结构的测量进行标准化。在显微照片中选择窦状隙的差异、对伪影的图像分析，以及对孔隙率和窗孔频率进行细胞面积测量时的方法差异，已导致已发表结果之间存在显著分歧。此前文献中尚未明确阐述对窗孔结构进行评估和测量的标准化方法，以及数据呈现所需的最低要求4,10,20-31。

<table><tbody><tr><td>25% 电子显微镜级戊二醛</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>将储备液保存于 -20 °C，直至使用；避免反复冻融</td></tr><tr><td>多聚甲醛粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>每次均需新鲜配制多聚甲醛</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>配制 0.2 M 储存液，pH 7.4，将粉末溶于 dH₂O 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，通常以0.1 M浓度使用，通过1:2稀释制备</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>通过将粉末溶于dH₂O中配制1 M CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>使用前用弱酸清洗安瓿瓶，以避免污染。在玻璃瓶中配制2%的储备液</td></tr><tr><td>乙醇- 绝对</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&amp;nbsp;</td><td>100% 乙醇必须为高纯度，并与分子筛一同储存</td></tr><tr><td>其他等级的乙醇</td><td>实验室技术</td><td>EL5</td><td>用dH₂O配制梯度乙醇&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&amp;nbsp;</td><td>使用前需恢复至室温</td></tr><tr><td>套管针</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>18 G 适用于大多数大鼠，22 G 适用于大多数小鼠，但最好备用几根 24 G 针头，以应对体型非常小的小鼠</td></tr><tr><td>导电碳带</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>碳导电银浆</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td></td><td></td><td>必须在许可下获取</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>必须在许可下获取</td></tr><tr><td>分子筛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>从100%乙醇中去除水分</td></tr></tbody></table>

利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

肝窦内皮细胞是进入肝脏的门户，其细胞穿通性窗孔结构可使血液中的小分子和溶解物质无阻碍地进入肝实质，进行代谢和加工处理。窗孔是动态结构，其大小和/或数量可随不同的生理状态、药物及疾病状态而发生改变，因此成为重要的调控靶点。要理解不同疾病、毒性及生理状态下肝窦内皮细胞形态的变化及其对肝功能的影响，必须准确测量窗孔的大小和数量。本文介绍了我们实验室所采用的扫描电镜固定与处理技术，以确保样本制备的可重复性及结果解读的准确性。这些方法包括灌注固定、继发固定与脱水、扫描电镜样品制备以及图像分析。最后，我们提供了一套标准化图像分析的逐步操作方法，以惠及本领域所有研究人员。

通过扫描电子显微镜在低倍率下进行初步观察，可见肝脏标本表面平坦，暴露区域足够大，可观察到许多较大的肝血管和肝窦（图1A）。为获得清晰的肝窦图像，必须确保肝脏组织块在载样 stub 上的正确放置，因此应避免观察到肝格利森囊（Glisson’s capsule）（图1B）。提高放大倍数后，可更细致地观察肝脏密集的血管系统，并显示出分隔血管的单层肝细胞板（图1C）。肝脏固定不良会导致图像质量下降，血细胞和碎片会遮挡肝脏结构的观察（图1D）。
进一步增加放大倍数可观察到肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构（图 2A）。正确识别肝窦结构至关重要——在某些情况下，肝细胞板可能看似血管，但诸如胆小管等结构特征有助于定位判断（图 2B）。过高的灌注压力可能导致内皮层出现大间隙等假象，这被认为是LSEC筛板融合所致。此类假象在扫描电镜（SEM）下易于识别（图 2C）。...

有孔肝窦状内皮细胞是一种重要的生物学滤过系统，其结构易受多种疾病、毒素及生理状态的影响。这些变化显著影响肝脏功能。本文描述了对该类细胞中孔径大小和孔数量进行测量的标准化方法。

肝窦内皮细胞是肝脏的门户，其跨细胞窗孔结构可促进小分子和溶解物质的无障碍转运……

本实验的总体目标是分析肝窦内皮。首先分离肝脏并用固定剂灌注，随后将肝脏切成组织块并进行脱水处理，为透射电子显微镜观察做准备。然后对肝组织样本进行喷金处理，并在电子显微镜下进行观察。最后，分析电子显微照片，计算窗孔直径、窗孔频率及孔隙率百分比。最终，通过电子显微镜揭示在不同条件下肝窦内皮的结构变化。该方法可使我们深入了解肝脏血管内皮的超微结构和形态。同样，该方法也可用于肾脏和脑组织的观察。所有涉及动物使用的实验操作均依照当地法律法规进行。本研究已获得悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循确保动物在任何时候福利的指南。本实验为非存活手术。根据文本方案配制固定剂后，将灌注缓冲液和固定剂在35至37摄氏度下预热。动物经氯胺酮和赛拉嗪单次腹腔注射麻醉后，通过后肢回缩和尾部夹捏反应评估镇静程度。接着，使用钝头剪刀在动物腹部做Y形切口，暴露肝脏和门静脉。然后，在门静脉上靠近肝脏处及其远端分别绑两根非常松的缝线。使用合适尺寸的静脉套管针穿刺门静脉，然后收紧缝线以固定套管针。接着使用5至20毫升预热至37摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS），在10厘米H2O的压力下开始灌注。避免气泡进入肝脏，否则会产生伪影并导致过高的气压，从而损伤肝脏。切断腹部和胸部的腔静脉（CVA），以使缓冲液能够自由流出肝脏，防止产生过高的反向压力，避免对肝脏、肝窦和内皮细胞或LCCs造成损伤。当肝脏中的血液完全排出后，将PBS替换为透射电镜（em）固定液，并持续灌注，直至肝脏变得坚硬且颜色非常苍白。大约五分钟。然后用解剖刀将肝脏切成一至二立方毫米大小的组织块。使用电子显微镜固定液进行后固定。将组织在 4 摄氏度下固定 24 至 72 小时。然后将组织转移至 0.1 摩尔的 Cate 缓冲液中，并在 4 摄氏度下保存，最长可保存 12 个月，以备用于扫描电子显微镜（SEM）样品的制备。根据文本方案脱水样品后，在解剖显微镜下标记金属 SEM 样品台的底部，并在其顶部贴上双面碳导电胶带，观察样品以确定最适合进行 SEM 分析的窦状隙表面。将网状结构的一面朝上放置在载片的碳导电胶表面，并牢固地粘贴在载片上。按照文本方案完成溅射镀膜和扫描电镜（SEM）观察后，在 ImageJ 中打开图像，利用图像中嵌入的标尺，使用 ImageJ 中的多边形工具沿肝窦内皮细胞（LSEC）整个平坦区域（包括有孔区和无孔区）进行描记，排除细胞表面可能遮挡孔洞的较大碎片。为测量孔洞直径，选择直线工具，穿过每个孔洞的最长直径画一条线。按 M 键测量线段，按 D 键在图像上永久绘制该线段。此线段定义为窗孔直径，其数值将显示在 Image J 的结果框中。测量所有大于 250 纳米的 LSEC 胞质内较大孔隙以及窗孔。对于非圆形的孔隙，通过沿其边缘描迹，并利用 Image J 根据结果框中的数据计算其面积，然后将这些数据导入 Excel 电子表格中。为进一步分析，请使用以下公式进行窗孔计算。平均窗孔直径等于所有窗孔直径的平均值。窗孔面积等于 πr²，其中 r 根据各个窗孔直径计算得出。孔隙率百分比等于所分析的总面积中所有 πR² 的总和除以总面积（单位为微米）再乘以 100，计算时需排除间隙区域的总面积。在发表数据时，应包含窗孔直径，并附上说明，确认使用了边界直径来定义窗孔、窗孔频率和孔隙率；同时还应说明分析中是否包含了间隙，并提供窗孔直径的频率分布图、肝脏组织块数量以及相关图像。扫描电镜下的低倍镜观察显示，肝组织标本表面平坦，暴露出的区域足够大，可观察到许多较大的肝血管和窦状隙，包括门管区和中央静脉（ES），如图所示。确保肝脏组织块在载片上的正确放置位置，对于清晰观察肝窦及亮泽的被膜至关重要，应避免遮盖肝窦的任何细节。因此，如本图所示，采用更高倍数的放大可观察到肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构。肝细胞板可能形似血管，但诸如BLI等特征有助于定位和辨识。该图表明，高灌注压力可能导致伪影，例如内皮中出现较大间隙，这可能是由于肝窦内皮细胞（LSEC）上的SIV板融合所致，这些结构在扫描电镜（SEM）下易于识别。避免将细胞核正上方的细胞膜区域纳入分析，因其在LSEC表面下呈现为隆起状，会影响窗孔密度和孔隙率计算的准确性。最后，对LSEC窗孔直径、密度及频率的定量分析可提供窗孔的实证测量指标，并可用于评估衰老、疾病、毒素或治疗所引起的改变。灌注完成后，组织还可用于其他技术处理，如透射电子显微镜观察细胞超微结构、线粒体结构等。它也可用于组织学。

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜

肝窦内皮细胞（SECs）的研究必须使用从动物体内获取的原代细胞进行，因为目前尚无可用的细胞系。该方法依赖于肝脏消化和差速离心法来纯化SECs，以便后续培养和实验操作。...

体内 肝脏内吞作用的观察及通过肝脏灌注纯化肝细胞

白细胞向肝脏的募集发生在由独特的肝窦内皮细胞衬覆的肝窦特殊通道中。在生理剪切应力条件下，通过相差显微镜观察白细胞跨越人肝窦内皮的过程，有助于阐明该过程背后的分子机制。...

一种在剪切应力条件下研究白细胞向人肝窦内皮黏附的流动黏附实验

本实验方案的目的是从肝脏中获得高活力和高产量的肝细胞及肝窦内皮细胞。通过门静脉灌注IV型胶原酶溶液，随后进行差速离心，从而分离得到肝细胞和肝窦内皮细胞。...

小鼠肝脏灌注法分离肝细胞和肝窦内皮细胞

本实验方案的目的是利用已描述的标记物鉴定肝脏内的淋巴管内皮细胞群体。我们采用胶原酶IV和DNase对组织进行轻柔剪切，并结合流式细胞术，以鉴定出一群独特的淋巴管内皮细胞。...

小鼠肝脏消化用于淋巴管内皮细胞的流式细胞术分析

本文介绍了一种免疫荧光染色方案，用于直接观察小鼠主动脉的内皮细胞。该技术在研究不同血流模式下内皮细胞的细胞和分子表型以及动脉粥样硬化发展过程中具有重要应用价值。...

利用平铺免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

本方案概述了一种使用连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的常规方法，SBF-SEM是一种强大的三维成像技术。SBF-SEM的成功应用依赖于适当的固定和组织染色技术，以及对成像参数的仔细设置。本方案涵盖了该过程各个阶段的实用注意事项。...

生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

本文介绍了如何构建与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型，以研究胆固醇过量对肝脏微环境及免疫细胞格局的影响。...

斑马鱼非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌早期进展过程中肝脏微环境分析

本文概述并演示了一种分离小鼠原代肝窦内皮细胞（LSEC）的实验方案。该方案基于肝脏胶原酶灌注、通过低速离心法纯化非实质细胞以及CD146磁珠分选技术。我们还利用流式细胞术和扫描电子显微镜对分离得到的LSECs进行表型鉴定与特征分析。...

小鼠原代肝窦内皮细胞的分离与鉴定

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中肝脏细胞外基质的三维成像

一种简单且全面的方案，用于获取肝脏肝细胞或其他组织细胞中细胞器之间膜接触位点的三维细节。...

利用连续切片电子显微镜对肝细胞中细胞器间接触位点进行三维表征

本文介绍了一种通过优化的差速超速离心法从小鼠肝癌组织中富集小细胞外囊泡的方法。...

一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

学习使用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞窗孔的标准化方法。该方案通过灌注固定、样本制备和定量图像分析，精确测量窗孔直径、频率和孔隙率，为研究肝脏功能和病理变化提供可靠的形态学数据。

利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

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