利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

本实验的总体目标是分析肝窦内皮。首先分离肝脏并用固定剂灌注，随后将肝脏切成组织块并进行脱水处理，为透射电子显微镜观察做准备。

然后对肝组织样本进行喷金处理，并在电子显微镜下进行观察。最后，分析电子显微照片，计算窗孔直径、窗孔频率及孔隙率百分比。最终，通过电子显微镜揭示在不同条件下肝窦内皮的结构变化。

该方法可使我们深入了解肝脏血管内皮的超微结构和形态。同样，该方法也可用于肾脏和脑组织的观察。所有涉及动物使用的实验操作均依照当地法律法规进行。本研究已获得悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。

允许的操作在项目许可证文件中有详细说明，并遵循确保动物在任何时候福利的指南。本实验为非存活手术。根据文本方案配制固定剂后，将灌注缓冲液和固定剂在35至37摄氏度下预热。

动物经氯胺酮和赛拉嗪单次腹腔注射麻醉后，通过后肢回缩和尾部夹捏反应评估镇静程度。接着，使用钝头剪刀在动物腹部做Y形切口，暴露肝脏和门静脉。然后，在门静脉上靠近肝脏处及其远端分别绑两根非常松的缝线。

使用合适尺寸的静脉套管针穿刺门静脉，然后收紧缝线以固定套管针。接着使用5至20毫升预热至37摄氏度的磷酸盐缓冲液（PBS），在10厘米H2O的压力下开始灌注。

避免气泡进入肝脏，否则会产生伪影并导致过高的气压，从而损伤肝脏。切断腹部和胸部的腔静脉（CVA），以使缓冲液能够自由流出肝脏，防止产生过高的反向压力，避免对肝脏、肝窦和内皮细胞或LCCs造成损伤。当肝脏中的血液完全排出后，将PBS替换为透射电镜（em）固定液，并持续灌注，直至肝脏变得坚硬且颜色非常苍白。

大约五分钟。然后用解剖刀将肝脏切成一至二立方毫米大小的组织块。使用电子显微镜固定液进行后固定。

将组织在 4 摄氏度下固定 24 至 72 小时。然后将组织转移至 0.1 摩尔的 Cate 缓冲液中，并在 4 摄氏度下保存，最长可保存 12 个月，以备用于扫描电子显微镜（SEM）样品的制备。根据文本方案脱水样品后，在解剖显微镜下标记金属 SEM 样品台的底部，并在其顶部贴上双面碳导电胶带，观察样品以确定最适合进行 SEM 分析的窦状隙表面。

将网状结构的一面朝上放置在载片的碳导电胶表面，并牢固地粘贴在载片上。按照文本方案完成溅射镀膜和扫描电镜（SEM）观察后，在 ImageJ 中打开图像，利用图像中嵌入的标尺，使用 ImageJ 中的多边形工具沿肝窦内皮细胞（LSEC）整个平坦区域（包括有孔区和无孔区）进行描记，排除细胞表面可能遮挡孔洞的较大碎片。为测量孔洞直径，选择直线工具，穿过每个孔洞的最长直径画一条线。

按 M 键测量线段，按 D 键在图像上永久绘制该线段。此线段定义为窗孔直径，其数值将显示在 Image J 的结果框中。测量所有大于 250 纳米的 LSEC 胞质内较大孔隙以及窗孔。对于非圆形的孔隙，通过沿其边缘描迹，并利用 Image J 根据结果框中的数据计算其面积，然后将这些数据导入 Excel 电子表格中。

为进一步分析，请使用以下公式进行窗孔计算。平均窗孔直径等于所有窗孔直径的平均值。窗孔面积等于 πr²，其中 r 根据各个窗孔直径计算得出。

孔隙率百分比等于所分析的总面积中所有 πR² 的总和除以总面积（单位为微米）再乘以 100，计算时需排除间隙区域的总面积。在发表数据时，应包含窗孔直径，并附上说明，确认使用了边界直径来定义窗孔、窗孔频率和孔隙率；同时还应说明分析中是否包含了间隙，并提供窗孔直径的频率分布图、肝脏组织块数量以及相关图像。扫描电镜下的低倍镜观察显示，肝组织标本表面平坦，暴露出的区域足够大，可观察到许多较大的肝血管和窦状隙，包括门管区和中央静脉（ES），如图所示。

确保肝脏组织块在载片上的正确放置位置，对于清晰观察肝窦及亮泽的被膜至关重要，应避免遮盖肝窦的任何细节。因此，如本图所示，采用更高倍数的放大可观察到肝窦内皮细胞（LSEC）的窗孔结构。肝细胞板可能形似血管，但诸如BLI等特征有助于定位和辨识。

该图表明，高灌注压力可能导致伪影，例如内皮中出现较大间隙，这可能是由于肝窦内皮细胞（LSEC）上的SIV板融合所致，这些结构在扫描电镜（SEM）下易于识别。避免将细胞核正上方的细胞膜区域纳入分析，因其在LSEC表面下呈现为隆起状，会影响窗孔密度和孔隙率计算的准确性。最后，对LSEC窗孔直径、密度及频率的定量分析可提供窗孔的实证测量指标，并可用于评估衰老、疾病、毒素或治疗所引起的改变。灌注完成后，组织还可用于其他技术处理，如透射电子显微镜观察细胞超微结构、线粒体结构等。

它也可用于组织学。