一个标准化的方法肝窦内皮细胞的分析及其窗孔用扫描电子显微镜
2015年4月30日
开孔肝窦内皮细胞是一个生物学上重要的过滤系统，受各种疾病、毒素和生理状态的高度影响。这些变化对肝功能有显著影响。我们描述了这些细胞中开窗大小和数量的标准化测量方法。
该程序的总体目标是分析肝窦内皮。这是通过首先分离肝脏并用固定剂灌注来实现的。接下来，将肝脏切成块并脱水，为电子显微镜检查做准备。
然后对肝脏样品进行溅射涂层并在电子显微镜下检查。最后，分析电子显微照片，计算开窗直径和频率以及孔隙率百分比。最终，电子显微镜用于显示各种条件下肝窦内皮的变化。
这种方法为我们提供了对肝血管内皮中血管的超微结构和形态的见解。它也可以用于以相同的方式检查肾脏和大脑 所有涉及使用动物的程序均根据当地立法进行。这项工作得到了悉尼地方卫生区动物福利委员会的批准。
允许的程序在项目许可文件中进行了描述，并遵循始终确保动物福利的准则。这是一种非存活手术。制备固定剂后，根据文本方案，将灌注缓冲液和固定剂加热 35 至 37 摄氏度。
一旦用单次腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉动物，通过后肢撤退和尾部挤压评估镇静水平。接下来，用钝头剪刀在动物的腹部做一个 Y 形切口，露出肝脏和门静脉。然后在门静脉周围系上两条非常松散的缝合线，一条在肝脏近端，另一条在肝脏更远端。
用适当大小的 IV 插管插管门静脉。然后拧紧缝合线以固定套管。现在使用 5 到 20 毫升 PBS 加热至 37 摄氏度，在 10 厘米 H2O 的压力下开始灌注。
避免气泡进入肝脏，这会产生伪影和气压过高，这会损害肝脏，切断腹腔和胸腔 CVA，让缓冲液从肝脏自由排出。这可以防止高背压、对肝脏、肝窦和内皮细胞或 LCC 的损伤。一旦肝脏没有血液，用电子显微镜或 em、固定剂和灌注替换 PBS，直到肝脏变硬且非常苍白。
大约五分钟。然后用手术刀将肝脏切成一到两立方毫米的块。使用 em fixative 进行发布。
将组织在 4 摄氏度下固定 24 至 72 小时。然后将组织转移到 0.1 摩尔的 Cate 钠缓冲液中，并在 4 摄氏度下储存长达 12 个月，以安装标本以进行扫描电子显微镜或 SEM。根据文本方案对样品进行脱水后，标记金属 SEM 存根的底部，并在解剖显微镜下将双面碳带贴在存根的顶部，将样品可视化以识别具有最佳 SEM 正弦曲线的表面。
花边，选定的表面朝上，贴在存根的碳带表面上，并将其牢固地粘在存根上。根据文本协议进行溅射镀膜和 SEM 后，在图像 J 中打开图像，并使用嵌入在图像中的比例尺使用图像 J 中的多边形工具设置比例尺 围绕 LSEC 的整个平坦区域，包括有孔和有孔区域，排除单元表面上可能遮挡开窗的任何大块碎片。要测量开窗直径，请通过选择线条工具在每个开窗的最长直径处放置一条线。
按 M 测量线条，按 D 在图片上永久绘制线条。这条线被定义为开窗直径，现在将在图像 J.Measure 所有间隙（即 LSEC 细胞质中超过 250 纳米的较大孔）以及开窗的结果框中提供。通过描摹非圆形间隙并使用图像 J 计算其超过图像 J 中结果框中的数据进入 Excel 电子表格的面积，来计算非圆形间隙的面积。
为了进一步分析，请使用以下公式进行开窗计算。平均开窗直径等于所有开窗直径的平均值。开窗面积等于 pi r 的平方，其中 R 是根据各个开窗直径计算的。
孔隙率百分比等于 sigma pi R 的平方除以分析的总面积，微米乘以 100 从此计算中排除了间隙的总和面积。为了在出版物中呈现数据，包括开窗直径和确认边界直径用于定义开窗频率和孔隙率的声明，还包括确认分析中是否包括间隙的声明，以及开窗直径和肝脏块数的频率分布图以及图像。通过 SEM 进行低倍放大后，肝脏标本的表面平坦，其暴露区域足够大，可以观察到许多大的肝血管和正弦波，包括门静脉和中央 ES，如图所示。
确保将肝脏阻滞正确放置在安装桩上对于获得正弦波的清晰图像至关重要，应避免使用涵盖肝脏正弦波所有细节的闪光胶囊。因此，如图所示，更高的放大倍率允许观察 LSEC 开窗。肝细胞板可能看起来像血管，但 BLI 等特征有助于定向。
该图表明，高丰盛压力会导致伪影，例如内皮中的大间隙，被认为是由 LSEC SIV 板的合并引起的，这些间隙在 SEM 下很容易识别，避开细胞核正上方的细胞膜，这可以看作是 LSEC 表面下的凸起，这将有助于提高开窗密度和孔隙率计算的准确性。最后，LSEC 门窗直径密度和频率的量化提供了对门窗的经验测量，并允许测量由衰老疾病、毒素或疗法引起的变化。灌注程序之后，组织可以被处理为其他技术，如透射电子显微镜，以查看细胞超微结构、线粒体结构。
它也可用于组织学。
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概述
本文讨论了带孔肝窦内皮细胞，这是一个由各种疾病和生理状态影响的关键过滤系统。详细说明了标准化这些细胞的孔径和数量测量方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 病理生理学
背景
- 肝窦内皮在肝功能中起着至关重要的作用。
- 孔径的变化可能表明疾病状态。
- 电子显微镜是研究这些细胞的关键工具。
- 测量技术的标准化对于重复性至关重要。
研究目的
- 分析肝窦内皮。
- 建立测量孔径特征的方法。
- 评估各种条件对肝功能的影响。
使用的方法
- 肝脏分离和用固定剂灌流。
- 将肝脏切成块并脱水以进行电子显微镜观察。
- 肝脏样本的溅射涂层。
- 在电子显微镜下观察并分析显微图像。
主要结果
- 测量孔径直径和频率。
- 计算肝脏样本的百分孔隙率。
- 识别各种条件下肝窦内皮的变化。
结论
- 电子显微镜有效用于研究肝窦内皮细胞。
- 标准化的测量技术提高了数据的可靠性。
- 了解孔径变化可以提供关于肝脏健康的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations enables mechanistic de-risking in hepatotoxicity and metabolic disease target validation. Standardized SEM-based analysis provides predictive confidence for assessing compound-induced endothelial changes, supporting early go/no-go decisions in discovery pipelines. This method enhances translational continuity by linking ultrastructural phenotypes to liver function outcomes across preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying fenestration diameter, frequency, and porosity as functional readouts of LSEC phenotype.
- Operational Value: Enables biological de-risking through reproducible ultrastructural assessment of endothelial permeability mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports predictive confidence in target selection by linking fenestration dynamics to disease-relevant physiological states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline fenestration metrics.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through fixed perfusion, fixation, and image analysis protocols.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative, SEM-derived outputs suitable for high-content endothelial phenotyping.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by enabling detection of fenestration alterations in response to toxins, aging, or disease states.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation via consistent LSEC morphometric analysis.
- Portfolio Impact: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing empirical data on endothelial integrity under experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, where endothelial integrity informs mechanism-based compound evaluation.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking via fenestration morphometry.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in endothelial function assessment.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of LSEC phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in liver-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable endothelial changes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy sample preparation and morphometric analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including SEM, sputter coater, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for fixation, dehydration, and imaging protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems such as kidney and brain endothelium as noted in the source.
- Practical limitations supported by source material including artifact avoidance from perfusion pressure and proper sample orientation.
