Name: 从中央与EAE大鼠中枢神经系统的单核细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:23:00.000+00:00
Duration: 20 min 51 s
Description: 学习从实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统中分离单核细胞的方法。该方案采用心脏灌注去除血液污染，结合Percoll密度梯度离心技术，可获得高活性单核细胞用于流式细胞术、电生理或细胞培养等下游应用。

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<ol>
<li> 深度麻醉大鼠。用70%乙醇喷洒，并通过左心室灌注PBS 10分钟以清除血管中的细胞（剪开右心房，从左心室进行灌注）。</li>
<li>取出脑和脊髓，置于含有冰上预冷PBS的50 ml离心管中。将脑和脊髓组织置于放置在含10 ml冰上预冷PBS的10 cm培养皿中的70 mm细胞筛网上，使用无菌1 ml注射器活塞背面将每块组织压过细胞筛网。将获得的单细胞悬液收集至冰上预冷的50 ml离心管中。用PBS冲洗细胞筛网，并将冲洗液加入离心管中，直至溶液澄清。</li>
<li>以390 g离心8–10分钟。</li>
<li>将细胞重悬于20 ml PBS + 30% Percoll溶液中，然后铺在10 ml PBS + 70% Percoll溶液之上。</li>
<li>室温下以390 g离心20分钟。</li>
<li>去除管顶的脂肪层。收集界面处的细胞，用PBS洗涤两次，计数。</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+clinical+scoring+of+chronic-relapsing+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.</li>
</ol>

该操作步骤以及所有涉及活体动物的操作步骤，均须获得您所在机构的动物使用与护理委员会的批准。我们建议在首次进行心脏灌注时，应有兽医或兽医技术人员在场，以确保动物在操作前和操作过程中接受足够水平的麻醉，并确保动物不会遭受不必要的疼痛或痛苦。

<table><tbody><tr><td>PBS，1×，无菌</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网，70 µm</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr></tbody></table>

从患eae大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

无论是研究针对中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病（例如实验性自身免疫性脑脊髓炎，EAE，1），还是研究对中枢神经系统感染（例如脊髓灰质炎、莱姆神经伯氏疏螺旋体病或神经性梅毒）的免疫反应，通常都需要分离浸润到中枢神经系统的免疫细胞。
在本视频方案中，我们演示如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的大鼠中枢神经系统（CNS）中分离单个核细胞（MNCs）。该操作的第一步是用生理盐水对啮齿动物进行心脏灌注，以确保灌注中枢神经系统的血管中无残留血液。任何血液污染都会人为地增加表观CNS浸润MNCs的数量，并可能改变免疫细胞浸润群的表观组成。随后，我们演示如何取出大鼠的脑和脊髓，进行后续的机械性破碎，以制备单细胞悬液。该悬液通过两层Percoll密度梯度离心法分离以获取MNCs。经洗涤后，这些细胞即可用于后续所需的任何实验操作。
通过该方法分离的单个核细胞具有活性，可用于电生理学、流式细胞术（FACS）或生物化学实验。若在无菌条件下操作（使用无菌器械并在组织培养罩内进行），这些细胞也可在组织培养基中进行培养。特定的细胞群体可进一步通过磁性分离方法或流式细胞术进行纯化。

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。

从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

无论是研究针对中枢神经系统（CNS）的自身免疫性疾病，例如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，1），还是……

好的。大家好，我是Christine Beaton，加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。今天我将向大家演示如何从大鼠的中枢神经系统中分离单个核细胞。因此，该操作需要对大鼠进行深度麻醉，以实施心脏灌注，从而确保中枢神经系统内无血液污染。取出组织后，我们将分离脑和脊髓，使用细胞筛制备单细胞悬液，然后利用Percoll双层梯度离心法分离单个核细胞。现在我们开始操作。现在我已准备好进行心脏灌注，接下来我将展示所需的所有材料。首先，我们需要一个贝尔罐，罐子底部放置了浸有挥发性麻醉剂的纸巾。你可以使用异氟烷或异氟醚。接下来我们需要准备固定大鼠的装置以及收集血液的工具。因此我们搭建了这个临时装置用于大鼠灌流。你将使用21号针头，并通过静脉输液灌流系统利用重力作用灌注生理盐水溶液。如果无法使用上述系统，也可以用生理盐水填充多个注射器，然后手动进行灌注。但这种方法要简便得多。此外，我们还需要一个10毫升的注射器筒，其中已放入了Kim擦拭纸。我将把麻醉剂，即部分麻醉剂，涂抹在大鼠的鼻部，以确保其在操作过程中保持深度麻醉状态。当然，你还需要准备相应的器械。今天我将不进行无菌操作，因为我不会将细胞放入培养环境。因此，我所使用的所有器械在无菌方面均未作处理。但如果您打算将细胞进行培养，显然应当使用无菌器械。就本视频的目的而言，我将使用一只已死亡的大鼠。因此，我可以放慢操作速度，逐步向您展示。当然，在实际操作中，您需要一只深度麻醉但未死亡的大鼠，且心脏仍保持跳动。现在我们开始处理这只大鼠。我将大鼠放置好，使其背部朝向远离我的方向，并用浸湿的擦拭巾覆盖其鼻部。接下来，我要做的第一件事是检查大鼠是否已处于深度麻醉状态。因此，在进行每个上述操作之前，你都需要这样做。我用镊子夹住大鼠，大鼠完全没有反应。如果大鼠有任何反应，就需要将其放回麻醉装置中，以确保其处于深度麻醉状态。然后我将使用70%乙醇浸泡大鼠的上半部分。接着我将打开胸腔。首先，我会切开皮肤，并从侧面打开。然后我将打开体腔本身。这里的这个组织是心脏。这里可以看到右心房。这就是我要剪开以使血液流出的地方。然后，为了灌注整个身体，我需要将针头插入左心室。因此，我将针头从这里插入。当针头插入后，我将打开输液管，使生理盐水流入，持续五到十分钟。如果灌注效果良好，你会观察到大鼠的脉搏、鼻子和眼睛的红色逐渐褪去，这表明血液正从大鼠体内排出，说明灌注效果良好。这是心脏灌注后的红色示踪结果。如您所见，这只小鼠的鼻子、耳朵和眼睛已不再呈粉红色或红色，而是完全变白，这表明灌注效果良好。血液已全部或大部分从大鼠的体表斑点处流失。现在大鼠已完成心脏灌注，我需要将其头部切断，即进行断头操作。为此，我将使用常规的实验设备。现在，我将从大鼠体内取出脑组织。因此，先用70%乙醇浸湿所有毛发，以避免毛发四处飞散。然后，我将首先去除皮肤。由于我不打算将脑组织用于组织学分析，并且需要将其切成小块，因此在取出脑组织时无需特别小心地完整剥离。我会将剪刀插入颅骨底部，即脑组织与脊髓相连的部位，此处如下所示。我将从两侧切开骨头，然后移除顶部，反复进行这一操作。这样，大脑就完全暴露出来了。如您所见，灌注效果良好，因为大脑组织完全清晰。在未进行灌注的动物中，您会看到脑表面完全被红色的毛细血管，即红血球充盈的毛细血管所覆盖，而在此完全看不到这些血管，这说明灌注成功。现在我将取出脑组织，注意确保不遗漏嗅球部分，并将其放入含有冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中。现在，我仍然不需要非常小心地保持其完整，将脑组织放入PBS溶液管中，并切断视神经，然后使用刮铲，脑组织就能很容易地取出。接下来，我将从同一只大鼠中取出脊髓。同样，由于之后要将其切成小段，因此在取出过程中不需要特别精细，只要确保将其全部取出即可。我首先沿着脊柱切开皮肤，此处脊柱已可见。接着，我将去除这里的肌肉组织，使整个脊柱完全暴露。在这里，您可以看到脊髓。因此，在小鼠中，你可以切断两端，用注射器注入PBS，脊髓几乎可以完整地流出。但在大鼠中并不容易做到这一点。我必须切开并用工具将脊髓挖出。现在我在两侧进行切割，就像处理脑组织一样，进行切割并移除颅骨，以暴露脊髓。与脑组织相同，脊髓呈现完全白色，表明心脏灌注效果良好。我将沿着整个脊柱继续这一操作。然后我下移到右侧髋部的位置，也就是这里。接着，我将使用镊子——这个操作不太美观，但我会直接将脊髓取出，并放入装有脑组织的离心管中。现在，我的离心管中包含了大鼠的脑和脊髓组织，接下来我就可以制备单细胞悬液了。现在我准备从中枢神经系统制备单细胞悬液。为此，我需要一个10厘米的培养皿，其中放置一个70微米的细胞滤筛。我还将使用1毫升注射器的推杆，以及镊子和剪刀。因此，我将把我的样本放入细胞滤筛中，并确保试管内无残留物。然后，我会将脑组织和脊髓组织一起切成小块。当所有组织完全切碎后，我将使用一次性注射器的推杆将其推过滤筛。随着单个细胞不断通过，你会逐渐看到细胞训练器外部的 PBS 会变得越来越浑浊。如果需要使我的细胞悬液处于无菌状态，我当然会在超净工作台中进行操作，而不会将手指伸入其中。现在 PBS 已经变浑浊了，我将首次收集这些液体，并将其放入一个 50 毫升的离心管中。但我会持续观察，同时向我的细胞筛中加入更多PBS，并继续研磨。由于中枢神经系统含有大量脂肪，因此使用该技术制备单细胞悬液时，我发现这是最难处理的器官之一。我已经将全部中枢神经系统组织在细胞筛中反复碾压多次，并收集了所有单细胞悬液。这是我用从右侧中枢神经系统制备的单细胞悬液加入PBS后补至50毫升的离心管。现在，我将离心该离心管，以进行后续梯度分离。细胞已完成离心，已形成沉淀，因此我将弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升含30% Percoll的PBS溶液中。我将把细胞重悬于10毫升含70% Percoll的PBS中以进行迁移。因此，我先弃去上清液，然后轻轻吹打沉淀，以确保细胞处于单细胞悬液状态，而不是成团存在于沉淀中。现在我已获得单细胞悬液形式的中枢神经系统细胞。我将把这些细胞悬浮于20 µL含30% Percoll的PBS中，并将这20 µL悬液叠加到10 µL含70% Percoll的PBS上。然后进行离心。现在，我将取20毫升的CNS悬液，并缓慢地将其铺加到70% Percoll层上，以使操作更简便。你也可以在其中一层加入酚红等染料，但我不太确定它是否会对细胞产生影响。因此，我尽量避免使用染料。操作时速度要足够慢，以确保两层液体不发生混合，因此下层应避免产生明显的湍流。随着上层逐渐增厚，可以适当加快操作速度。现在我已经将细胞加入到了梯度中。因此，下方透明的一层是70% Percoll层，上方浑浊的一层是含有我单细胞悬液的30% Percoll层。现在我将把这支离心管放入离心机中离心20分钟，如果操作得当，我将能够观察到单个核细胞层。至此，我们已完成梯度离心步骤。因此，与往常一样，离心形成密度梯度时，务必小心关闭刹车，以防止因减速过快而破坏梯度。现在我们已获得分层结构：在梯度上方有一层脂肪层，我将将其移除，以避免污染我的细胞悬液。在30%和70% Percoll 层之间的界面上，你可以看到该界面并不清晰，而是模糊的，而细胞就位于此处。一旦我将细胞移除后，你会看到界面将变得明显更清晰。因此，我将去除上层大部分脂肪，并将其弃去。我不需要将全部液体移除，但需要移除足够量，以免在吸取单层细胞时液体完全包覆我的移液管。现在，我将使用另一支移液管，插入到界面层位置，收集我的细胞。目前，我已在界面层收集了数毫升的细胞悬液。因此，我可能已经获得了该部位所能获取的全部细胞。中枢神经系统中的单核细胞数量确实很少。现在，我已经将单个核细胞收集到了离心管中。我将用 PBS 将该试管补至 50 毫升，并离心细胞使其沉淀，从而去除珠子。建议至少用一整管 PBS 洗涤两遍，以确保完全去除所有珠子。随后，细胞即可用于任何后续实验操作。今天我向您展示了如何从大鼠的中枢神经系统中分离单个核细胞。当然，一旦获得了这些单个核细胞，您还可以进一步纯化，以从中分离出例如T淋巴细胞等特定细胞群体。我接下来将利用这些细胞进行流式细胞术检测，以分析存在于我脑组织样本中的细胞亚群。祝您的细胞分离实验顺利。

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