从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

好的。大家好，我是Christine Beaton，加州大学欧文分校生理学与生物物理学系George Chen实验室的一名助理研究员。今天我将向大家演示如何从大鼠的中枢神经系统中分离单个核细胞。

因此，该操作需要对大鼠进行深度麻醉，以实施心脏灌注，从而确保中枢神经系统内无血液污染。取出组织后，我们将分离脑和脊髓，使用细胞筛制备单细胞悬液，然后利用Percoll双层梯度离心法分离单个核细胞。现在我们开始操作。

现在我已准备好进行心脏灌注，接下来我将展示所需的所有材料。首先，我们需要一个贝尔罐，罐子底部放置了浸有挥发性麻醉剂的纸巾。你可以使用异氟烷或异氟醚。

接下来我们需要准备固定大鼠的装置以及收集血液的工具。因此我们搭建了这个临时装置用于大鼠灌流。你将使用21号针头，并通过静脉输液灌流系统利用重力作用灌注生理盐水溶液。

如果无法使用上述系统，也可以用生理盐水填充多个注射器，然后手动进行灌注。但这种方法要简便得多。此外，我们还需要一个10毫升的注射器筒，其中已放入了Kim擦拭纸。

我将把麻醉剂，即部分麻醉剂，涂抹在大鼠的鼻部，以确保其在操作过程中保持深度麻醉状态。当然，你还需要准备相应的器械。今天我将不进行无菌操作，因为我不会将细胞放入培养环境。

因此，我所使用的所有器械在无菌方面均未作处理。但如果您打算将细胞进行培养，显然应当使用无菌器械。就本视频的目的而言，我将使用一只已死亡的大鼠。

因此，我可以放慢操作速度，逐步向您展示。当然，在实际操作中，您需要一只深度麻醉但未死亡的大鼠，且心脏仍保持跳动。

现在我们开始处理这只大鼠。我将大鼠放置好，使其背部朝向远离我的方向，并用浸湿的擦拭巾覆盖其鼻部。接下来，我要做的第一件事是检查大鼠是否已处于深度麻醉状态。

因此，在进行每个上述操作之前，你都需要这样做。我用镊子夹住大鼠，大鼠完全没有反应。如果大鼠有任何反应，就需要将其放回麻醉装置中，以确保其处于深度麻醉状态。

然后我将使用70%乙醇浸泡大鼠的上半部分。接着我将打开胸腔。首先，我会切开皮肤，并从侧面打开。

然后我将打开体腔本身。这里的这个组织是心脏。这里可以看到右心房。

这就是我要剪开以使血液流出的地方。然后，为了灌注整个身体，我需要将针头插入左心室。因此，我将针头从这里插入。

当针头插入后，我将打开输液管，使生理盐水流入，持续五到十分钟。如果灌注效果良好，你会观察到大鼠的脉搏、鼻子和眼睛的红色逐渐褪去，这表明血液正从大鼠体内排出，说明灌注效果良好。

这是心脏灌注后的红色示踪结果。如您所见，这只小鼠的鼻子、耳朵和眼睛已不再呈粉红色或红色，而是完全变白，这表明灌注效果良好。

血液已全部或大部分从大鼠的体表斑点处流失。现在大鼠已完成心脏灌注，我需要将其头部切断，即进行断头操作。

为此，我将使用常规的实验设备。现在，我将从大鼠体内取出脑组织。因此，先用70%乙醇浸湿所有毛发，以避免毛发四处飞散。

然后，我将首先去除皮肤。由于我不打算将脑组织用于组织学分析，并且需要将其切成小块，因此在取出脑组织时无需特别小心地完整剥离。我会将剪刀插入颅骨底部，即脑组织与脊髓相连的部位，此处如下所示。

我将从两侧切开骨头，然后移除顶部，反复进行这一操作。这样，大脑就完全暴露出来了。

如您所见，灌注效果良好，因为大脑组织完全清晰。在未进行灌注的动物中，您会看到脑表面完全被红色的毛细血管，即红血球充盈的毛细血管所覆盖，而在此完全看不到这些血管，这说明灌注成功。现在我将取出脑组织，注意确保不遗漏嗅球部分，并将其放入含有冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）的离心管中。

现在，我仍然不需要非常小心地保持其完整，将脑组织放入PBS溶液管中，并切断视神经，然后使用刮铲，脑组织就能很容易地取出。接下来，我将从同一只大鼠中取出脊髓。同样，由于之后要将其切成小段，因此在取出过程中不需要特别精细，只要确保将其全部取出即可。

我首先沿着脊柱切开皮肤，此处脊柱已可见。接着，我将去除这里的肌肉组织，使整个脊柱完全暴露。在这里，您可以看到脊髓。

因此，在小鼠中，你可以切断两端，用注射器注入PBS，脊髓几乎可以完整地流出。但在大鼠中并不容易做到这一点。我必须切开并用工具将脊髓挖出。

现在我在两侧进行切割，就像处理脑组织一样，进行切割并移除颅骨，以暴露脊髓。与脑组织相同，脊髓呈现完全白色，表明心脏灌注效果良好。我将沿着整个脊柱继续这一操作。

然后我下移到右侧髋部的位置，也就是这里。接着，我将使用镊子——这个操作不太美观，但我会直接将脊髓取出，并放入装有脑组织的离心管中。现在，我的离心管中包含了大鼠的脑和脊髓组织，接下来我就可以制备单细胞悬液了。

现在我准备从中枢神经系统制备单细胞悬液。为此，我需要一个10厘米的培养皿，其中放置一个70微米的细胞滤筛。我还将使用1毫升注射器的推杆，以及镊子和剪刀。

因此，我将把我的样本放入细胞滤筛中，并确保试管内无残留物。然后，我会将脑组织和脊髓组织一起切成小块。当所有组织完全切碎后，我将使用一次性注射器的推杆将其推过滤筛。

随着单个细胞不断通过，你会逐渐看到细胞训练器外部的 PBS 会变得越来越浑浊。如果需要使我的细胞悬液处于无菌状态，我当然会在超净工作台中进行操作，而不会将手指伸入其中。现在 PBS 已经变浑浊了，我将首次收集这些液体，并将其放入一个 50 毫升的离心管中。

但我会持续观察，同时向我的细胞筛中加入更多PBS，并继续研磨。由于中枢神经系统含有大量脂肪，因此使用该技术制备单细胞悬液时，我发现这是最难处理的器官之一。我已经将全部中枢神经系统组织在细胞筛中反复碾压多次，并收集了所有单细胞悬液。

这是我用从右侧中枢神经系统制备的单细胞悬液加入PBS后补至50毫升的离心管。现在，我将离心该离心管，以进行后续梯度分离。细胞已完成离心，已形成沉淀，因此我将弃去上清液，并将细胞重悬于20毫升含30% Percoll的PBS溶液中。

我将把细胞重悬于10毫升含70% Percoll的PBS中以进行迁移。因此，我先弃去上清液，然后轻轻吹打沉淀，以确保细胞处于单细胞悬液状态，而不是成团存在于沉淀中。

现在我已获得单细胞悬液形式的中枢神经系统细胞。我将把这些细胞悬浮于20 µL含30% Percoll的PBS中，并将这20 µL悬液叠加到10 µL含70% Percoll的PBS上。然后进行离心。

现在，我将取20毫升的CNS悬液，并缓慢地将其铺加到70% Percoll层上，以使操作更简便。你也可以在其中一层加入酚红等染料，但我不太确定它是否会对细胞产生影响。因此，我尽量避免使用染料。

操作时速度要足够慢，以确保两层液体不发生混合，因此下层应避免产生明显的湍流。随着上层逐渐增厚，可以适当加快操作速度。现在我已经将细胞加入到了梯度中。

因此，下方透明的一层是70% Percoll层，上方浑浊的一层是含有我单细胞悬液的30% Percoll层。现在我将把这支离心管放入离心机中离心20分钟，如果操作得当，我将能够观察到单个核细胞层。至此，我们已完成梯度离心步骤。

因此，与往常一样，离心形成密度梯度时，务必小心关闭刹车，以防止因减速过快而破坏梯度。现在我们已获得分层结构：在梯度上方有一层脂肪层，我将将其移除，以避免污染我的细胞悬液。

在30%和70% Percoll 层之间的界面上，你可以看到该界面并不清晰，而是模糊的，而细胞就位于此处。一旦我将细胞移除后，你会看到界面将变得明显更清晰。因此，我将去除上层大部分脂肪，并将其弃去。

我不需要将全部液体移除，但需要移除足够量，以免在吸取单层细胞时液体完全包覆我的移液管。现在，我将使用另一支移液管，插入到界面层位置，收集我的细胞。目前，我已在界面层收集了数毫升的细胞悬液。

因此，我可能已经获得了该部位所能获取的全部细胞。中枢神经系统中的单核细胞数量确实很少。现在，我已经将单个核细胞收集到了离心管中。

我将用 PBS 将该试管补至 50 毫升，并离心细胞使其沉淀，从而去除珠子。建议至少用一整管 PBS 洗涤两遍，以确保完全去除所有珠子。随后，细胞即可用于任何后续实验操作。

今天我向您展示了如何从大鼠的中枢神经系统中分离单个核细胞。当然，一旦获得了这些单个核细胞，您还可以进一步纯化，以从中分离出例如T淋巴细胞等特定细胞群体。我接下来将利用这些细胞进行流式细胞术检测，以分析存在于我脑组织样本中的细胞亚群。

祝您的细胞分离实验顺利。