Name: 表面增强拉曼光谱检测生物分子利用EBL装配纳米衬底 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学习利用电子束光刻技术制备纳米结构衬底，并通过表面增强拉曼光谱检测固定化蛋白质与适配体等生物分子。该方法为研究生物分子相互作用提供了高灵敏度工具。

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作者谨此感谢：David Wishart、Valentyna Semenchenko、Mark McDermott、Michael Woodside 和 Albert Cao 在蛋白质偶联物及 DNA 适配体的开发与制备过程中提供的帮助；T. M. Fahim Amin、Mosa Sharmin Aktar 和 Trevor Olsen 在样品制备方面的协助；Jonathan Mane 在分子结构图像生成方面的协助；以及加拿大国家研究委员会—国家纳米技术研究所（NRC-NINT）、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和阿尔伯塔大学对本研究工作的资助支持。

1. 底物制备
<ol>
	<li>使用半导体划片机将熔融石英（FS）晶圆切割成1 cm × 1 cm或更小的芯片。</li>
	<li>使用 piranha 溶液（H2SO4：H2O2，3:1；注意：强氧化剂）浴29 15分钟，然后用去离子水冲洗方块，并用氮气吹干。</li>
	<li>将样品正面朝上置于180 °C的加热板上加热15 min。从加热板上取下样品后冷却至室温。</li>
	<li>对于设计1和设计3，继续进行步骤2。</li>
	<li>对于设计2，将样品置于电子束蒸发腔中，并镀上一层10 nm的Ni。</li>
</ol>
2. 使用电子束光刻技术（EBL）制备纳米图案化PMMA掩模
<ol>
	<li>在基底上旋涂PMMA抗蚀剂层和导电层。
	<ol>
		<li>使用带有真空卡盘的晶圆旋转涂布机，将样品逐一置于卡盘中心。用玻璃移液管在样品中心滴加一滴聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）抗蚀剂，随后以2秒的加速时间升至3,500 rpm，并在此转速下旋转60秒。</li>
		<li>将基底在180 °C下烘烤3-5分钟。烘烤后，将样品冷却至室温。</li>
		<li>将基底冷却并放回旋转涂布载物盘后，在基底上滴加一滴导电聚合物。以2秒的加速时间，在3,000 rpm转速下旋涂40秒。在80 °C下烘烤样品1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据标准程序进行电子束光刻曝光16,17,18,30.
		<ol>
		<li>根据制造商的说明，采用不同特征剂量设计曝光方案 表1 尽可能小的光束步长。</li>
		<li>将样品载入电子束光刻腔室。如果电子束光刻系统不具备自动聚焦功能，请在远离待曝光图形区域及微珠边缘的位置选择一处微小划痕进行聚焦。</li>
		<li>根据制造商的说明，进行必要的聚焦、像散校正以及适当的写场对准，并对样品进行曝光。为获得理想的曝光轮廓和最佳图案质量，曝光时应采用30 keV的电子束能量和7.5 µm的光阑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除导电聚合物并显影暴露的样品。
	<ol>
		<li>准备一个烧杯盛装去离子水（DI水），用于去除导电聚合物，另准备一个烧杯盛装显影液混合物（异丙醇:水）2O，7:3），室温下搅拌5分钟。在第三个烧杯中准备高纯度异丙醇作为冲洗剂。</li>
		<li>使用镊子将样品放入水中3秒，以去除导电聚合物薄膜，然后将样品放入显影液中，并缓慢上下移动镊子20秒。立即将基底转移至异丙醇中，再冲洗10秒，随后用氮气吹干样品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 贵金属纳米结构的制备
<ol>
	<li>将样品倒置装入电子束蒸发系统中，以便蒸发的金属沉积在样品的正面。以约 0.1 nm/sec 的速率，在设计 1 和设计 3 的样品上沉积一层 10 nm 厚的 Au 层，在设计 2 的样品上沉积一层 10 nm 厚的 Ag 层。</li>
	<li>向超声系统中加入推荐高度的水，并另取一个烧杯加入丙酮。将样品正面朝上放置于烧杯底部，使其浸泡 10 分钟。手持烧杯将其放入水浴中，使丙酮液面与水位齐平，然后开启超声系统。超声处理时间不超过 60 秒。</li>
	<li>采用与步骤 3.1 相同的程序，通过在 FS 基底（设计 1 和设计 3）和 Ni 涂层 FS 基底（设计 2）上沉积 10 nm 厚的金属薄膜来制备均匀的 Au 和 Ag 垫层基底，省略步骤 2。</li>
</ol>
4. 基底的生物功能化
<ol>
	<li>制备设计1样品：
	<ol>
		<li>在室温下，将11-巯基十一烷酸（MUA）溶于乙醇中，配制为1 mM的溶液，超声处理10分钟。</li>
		<li>将合适的纳米结构基底浸入MUA溶液中48小时。用乙醇冲洗样品三次，并在室温下干燥5分钟。</li>
		<li>制备75 mM的溶液 N-乙基-N'-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺（EDC）溶于去离子水中。配制15 mM的EDC溶液。 N-hydroxysuccinimide (NHS) 溶于去离子水中。</li>
		<li>使用微量移液器将100 µl NHS滴加到基底的金表面，立即在同一区域加入100 µl EDC。孵育1分钟以活化MUA的自组装单分子层（SAM）。</li>
		<li>在基底的同一区域放置 100 µl 蛋白质 A 溶液（47 µM），将样品置于多室培养皿中，于 5 °C 孵育 24 小时；多室培养皿的另一室加入 1 ml 去离子水，并用密封盖封好。</li>
		<li>用去离子水冲洗样品，每次将样品置于不同的烧杯中持续搅拌20秒，共冲洗3次。冲洗过程中及冲洗后均不得让样品干燥。</li>
		<li>进行第5步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备设计2的样品：
	<ol>
		<li>配制0.9 mM的葡萄糖结合蛋白（GBP）溶液，溶于磷酸钾缓冲液（K2HPO4，25 mM，pH 7.5）。在该缓冲液中配制100 mM的D-葡萄糖溶液。</li>
		<li>将30 µl 100 mM D-葡萄糖溶液与30 µl 0.9 mM GBP溶液在1 ml塑料微量离心管中使用微量移液器混合。孵育30分钟。</li>
		<li>使用微量移液器将20 µl无配体GBP溶液和配体结合型GBP溶液分别点样于制备好的基底上。将样品置于带密封盖的培养皿中，在5 °C下保存24小时。</li>
		<li>在室温下用磷酸钾缓冲液冲洗样品3次。</li>
		<li>进行到第5步。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备设计3的样本：
	<ol>
		<li>使用pH为7.4的TRIS EDTA缓冲液将多巴胺结合适配体（DBA）溶液稀释至浓度为1 µM。</li>
		<li>使用分析天平称取多巴胺粉末，加入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并放入搅拌子搅拌5分钟，配制浓度为5 µM的多巴胺溶液。</li>
		<li>在每种基底表面滴加20 µl DBA溶液，将样品置于培养皿中，室温下避光孵育1小时。</li>
		<li>用磷酸钾缓冲液（K2HPO4，25 mM，pH 7.5）</li>
		<li>将样品直立放置在洁净室级别擦拭纸上，以干燥基底背面，同时保持基底正面的薄膜。留出一份样品作为对照。</li>
		<li>在剩余样本上已有的PBS缓冲液液滴表面，加入5 µl含目标多巴胺浓度的多巴胺溶液。将样本孵育10分钟。</li>
		<li>在无适配体的金垫表面滴加一滴多巴胺溶液，孵育10分钟。</li>
		<li>用磷酸钾缓冲液将样品冲洗3次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 拉曼光谱法
<ol>
	<li>将每个样品置于防水腔室中，以避免激光照射导致样品蒸发。
	<ol>
		<li>用化学惰性的高真空润滑脂填充塑料注射器，将样品放置在玻璃载片上，然后在样品周围挤出几毫米的润滑脂，注意不要接触样品。</li>
		<li>将显微镜盖玻片置于基底上方，轻轻按压以形成密封，在基底与盖玻片之间形成一层薄的液体界面，同时确保缓冲液不与真空润滑脂接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用光学拉曼显微镜系统，在不开启激光的情况下，对需要采样的金属纳米图案区域表面进行聚焦。</li>
	<li>进行拉曼采样18,19，激光强度控制在2.4–3.1 mW之间，总采样时间少于20秒，以防止样品受损，物镜放大倍数为10X。根据表1中指定的激发波长，采集设计1、2和3样品的拉曼光谱。同时，以无金属纳米结构的玻璃载片作为支撑，采集蛋白A、GBP、D-葡萄糖溶液以及多巴胺粉末的对照拉曼光谱，用于比较。</li>
</ol>

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<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

表面增强拉曼散射（SERS）正日益被认可为一种极为强大的生物检测技术，具有诸多独特优势。由于其与分子振动之间的关联，可通过SERS光谱选择性地识别特定分析物的“指纹”信息，而极高的灵敏度使得检测极微量的分析物成为可能9,10,11,36。此外，SERS是一种非破坏性技术，且对水的干扰相对不敏感，因此非常适用于在天然水相环境中探测生物材料9。本文所展示的结果强调了这些优势，并进一步证明了SERS作为一种高度灵活的无标记生物检测技术的强大潜力。在三种采用不同基底固定化生物分子单分子层的设计中，均检测到了可明确归属于特定分析物的拉曼振动模式。这些生物分子或其相应配体的检测已通过以熔融石英平面表面作为SERS基底支撑来实现，表明该设计与当前的电子学和微流控系统兼容，有望在新兴的生物电子架构中实现广泛应用，特别是在将生物材料与电子器件及电化学器件表面相耦合的场景中2,3。尤为重要的是，在三项设计中的两项中，已分别利用表面固定化的蛋白质和适配体单分子层作为识别元件，成功实现了对葡萄糖和多巴胺等小分子特异性结合的SERS检测。
然而，在“芯片上”实现高效的表面增强拉曼散射（SERS）生物检测时，需注意若干方面。首先，大多数生物分子普遍存在一个众所周知的挑战，即它们易于降解，特别是在暴露于非自然条件（如干燥环境或强激光照射）时。在整个实验过程中，我们始终强调必须将生物功能化的样品始终保持浸没在适当的溶液中，从样品制备到拉曼光谱采集均应如此。为实现这一目标，已专门设计了一种防水腔室（图7），以防止激光照射过程中液体蒸发。此外，应按照实验方案第5.3步所述，限制激光照射时间和激光强度，以避免样品受损。
SERS 检测的结果对所用基底的几何结构非常敏感，尤其是金属纳米结构之间的特征间距。根据图8和图9所示，设计1样品的 SERS 强度显著依赖于熔融石英上金纳米点之间间隙的宽度。在该设计中测试的三种金纳米点阵列（图8）中，阵列I在金特征之间具有最窄的间隙，因此可实现最强的拉曼信号，提供更高效的电磁场增强效果。如图9所示，需要将特征间距控制在10–20 nm或更小的范围内。本研究展示的采用电子束光刻（EBL）制备 SERS 基底的方法，能够高效地实现对特征间间隙宽度的精确调控。使用正性电子束光刻胶（如PMMA）时，可通过简单调节曝光剂量来改变PMMA掩模中孔的尺寸。经过剥离工艺后，即可获得不同尺寸的金属点，通过选择合适的EBL曝光剂量，可按需调节纳米点之间的间隙宽度18。
另一个挑战是针对特定生物检测应用优化SERS基底的几何结构。尽管增强效应随着特征间隙的减小而增加，但生物分子相对较大的尺寸限制了间隙可缩小的程度。这一点在设计2的结果中表现明显，其固定方法使得蛋白质仅高效结合于贵金属点之间的表面，而不结合于点本身（见图3B）。根据图10所示结果，无结构银垫的SERS光谱未显示出任何来自分析物的谱带。尽管这些银垫具有纳米晶结构并存在极窄的岛间间隙（见图6F），但这些间隙仍过于狭窄，无法容纳蛋白质分子。当需要检测蛋白质-配体结合时，复杂性进一步增加。在图10中，与无配体状态相比，配体结合型GBP的SERS C-H谱带更为显著，这可能假定为D-葡萄糖结合后GBP构象发生变化27,28，导致结构更刚性，拉曼活性增强所致。若比较两种纳米结构基底，无配体蛋白的C-H谱带在纳米点基底获得的SERS光谱中更强，而配体结合蛋白的蛋白和葡萄糖C-H谱带则在纳米六边形基底上更为显著。预期这两个因素导致了上述差异：一是银结构之间存在可供GBP结合至镍层的空间，二是配体结合态与无配体态蛋白在这些结构间“热点”区域对拉曼散射电磁增强的敏感性不同。一方面，纳米点图案提供了相对更大的特征间区域，其中镍涂层可供蛋白质结合，这可能解释了在银纳米点基底上观察到的无葡萄糖GBP更显著的C-H谱带。另一方面，由于其非均匀结构（见图6D），银纳米六边形可能在纳米六边形内部银岛之间的狭窄间隙中表现出更强的电磁增强效应，从而导致在纳米六边形基底上葡萄糖结合型GBP的C-H振动谱带更强。这种相互作用的某些细节仍需进一步验证，针对涉及GBP等大分子蛋白质的复杂分析物的SERS基底优化仍在进行中。
显然，当仅配体在选定区域内具有拉曼活性，而其他组分无此活性时，采用固定化生物分子作为识别元件的配体结合表面增强拉曼散射（SERS）检测将更为便利。设计3即为此种情况，可获得适配体结合多巴胺的显著SERS谱带（图11）。该适配体-多巴胺组合表现出优异的特异性，其SERS谱图呈现明显的谱峰，且无显著背景信号干扰。
未来，无标记表面增强拉曼散射（SERS）技术的发展将涉及利用多种不同的表面纳米结构设计，对生物分子的SERS信号增强进行广泛测试。采用直接写入式电子束光刻技术（EBL）可精确控制纳米结构的尺寸、形状及特征间距，结合本文所述的样品制备方案，将有助于不同研究团队之间实验结果的比较与交叉验证。这将解决在使用替代性“自下而上”方法制备SERS基底时所面临的主要挑战——可重复性问题11,12,13，从而更有效地控制金属纳米结构的尺寸与位置，实现针对多种应用的最优基底设计的可靠识别。这些技术的可扩展性后续还可通过将EBL与纳米压印光刻等互补性纳米光刻技术相结合而进一步提升20，以实现基于可调EBL技术优化的纳米结构设计在未来的大规模生产。

开发和表征由固体纳米结构与生物聚合物相互作用形成的共轭纳米生物系统的能力，对于推动下一代生物传感与生物驱动技术的发展正变得愈发重要1,2。这涉及多个研究领域的跨学科研究，例如相关固态组分的制备（微电极或纳米电极、纳米工程涂层、纳米线或纳米颗粒）2,3,4；在表面固定生物分子以构建所需的生物共轭物5,6,7；以及对纳米生物界面的监测1。在大多数情况下，最佳制备、生物功能化及表征方法的选择密切相关。显然，纳米制造技术的选择取决于系统中固态组分的需求，而后者在很大程度上依赖于检测方法，检测方法又由所涉及的生物聚合物的性质及界面监测目的决定。
在用于表征生物偶联系统的众多技术中1,3，表面增强拉曼光谱（SERS）已成为检测表面化学和生物物质的一种极具前景的方法8,9,10,11。SERS利用单色光与固定在表面的生物分子发生非弹性散射（图1），从而捕获对应于分子振动的独特信号。这种无需标记、复杂化学处理或耗时步骤即可区分不同分子的能力，使SERS成为一种潜在的高效生物检测方法。SERS的另一个重要优势是其高灵敏度。当光与贵金属纳米结构（SERS基底）相互作用时，会激发局域表面等离激元，显著增强分析物的拉曼散射强度，从而实现对极微量分子的检测，从单分子层直至单分子水平8,9,10,11。此外，大多数生物分子需要水溶液以维持稳定性。由于水通常具有较弱的拉曼活性，因此水相样品的背景信号被显著降低9。过去十年中，SERS的应用呈现指数级增长10。然而，SERS面临的一个广泛讨论的挑战是：拉曼散射的电磁增强效应在很大程度上依赖于诱导等离激元波的金属纳米结构的尺寸、形状和间距11,12,13。为了实现高效且可重复的SERS测量，必须在纳米尺度上精确控制基底的几何结构。
<img alt="纳米结构上激光激发示意图，显示散射光和固定的生物聚合物。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 表面增强拉曼光谱示意图。
用于制备表面增强拉曼散射（SERS）基底的多种方法11,12,13大致可分为自下而上法和自上而下法。第一类方法利用各种自组装过程或定向化学合成来生成纳米结构。常见的示例包括将单分散纳米颗粒固定在固体载体上11,12,13、通过热沉积、溅射或电化学沉积制备粗糙金属薄膜11,12，以及多种化学合成方法13。尽管这些技术通常相对简单且成本较低，但大多数方法在结构位置的可控性方面存在不足，且样品间的重复性有限。
相比之下，自上而下的光刻技术采用可操控的工具（如粒子束）在表面创建所需的图案。其中最常用的纳米光刻方法之一是电子束光刻（EBL），该方法能够对低至10 nm以下的结构实现极佳的控制，并且具有灵活性，可在固体基底上实现不同的基底设计11,12。在EBL中，一束电子被聚焦至直径仅为几纳米的光斑，在电子敏感材料（抗蚀剂）表面进行扫描，导致曝光区域发生化学变化。对于正性抗蚀剂（如聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA），电子束照射会引起构成抗蚀剂的聚合物链断裂，从而使其在适当溶剂（显影液）中的溶解度增加。电子束光刻的过程包括：在基底上旋涂一层均匀的抗蚀剂；在真空腔中用电子束照射目标抗蚀剂材料；以及对样品进行显影以去除可溶区域。
与硅等其他材料相比，位于金属纳米结构下方的电介质支撑材料（如熔融石英）已被证明可显著增强表面增强拉曼散射（SERS）中的信号强度，这是由于等离激元波的局域化效应所致14,15。然而，在电介质基底上进行电子束光刻（EBL）图形化，尤其是在纳米尺度下，会因曝光过程中电荷积聚而面临重大挑战。此前我们已证明16,17，通过在抗蚀剂上方放置导电聚合物层可克服这些困难。图2展示了采用电子束曝光与显影，随后进行金属沉积和剥离工艺，在熔融石英支撑体上制备金属纳米结构的整体加工流程示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子束光刻工艺示意图；包括旋涂、曝光、显影和金属剥离。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在介电基底上制备金属纳米结构所采用的电子束光刻、金属沉积及剥离工艺步骤示意图16-19。 本文介绍了通过电子束光刻（EBL）制备表面增强拉曼散射（SERS）基底、基底的生物功能化以及拉曼光谱采集的完整工艺流程。我们近期研究中探索的三种设计18,19, 20将在下文讨论（见图 3、图 4和表 1）。在设计1中，重组蛋白A被固定在熔融石英（FS）基底上的生物功能化金（Au）纳米结构表面18，并实现了对该蛋白质的SERS检测。在设计2中，利用组氨酸标签将带有或不带有配体（D-葡萄糖）的重组葡萄糖结合蛋白22,27,28固定在镍（Ni）涂层FS基底上的银（Ag）纳米结构间隙中，从而检测葡萄糖与该蛋白的结合。在设计3中，巯基修饰的多巴胺结合DNA适配体20,24被固定在FS基底上的Au纳米结构表面，并验证了固定化适配体对多巴胺的结合能力。这些实例涵盖了从基底制备到拉曼光谱采集的所有相关实验步骤，代表了不同类型的生物分子及多种固定化策略，适用于多种应用领域，既可用于通过SERS探究纳米-生物界面的基础研究，也可用于开发以蛋白-配体或适配体-配体结合为识别机制的小分子SERS生物传感器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="贵金属纳米结构示意图：蛋白A、葡萄糖结合、适配体在熔融石英表面。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 三种代表性设计的示意图，分别采用不同的生物分子、固定化方法和基底材料：(A) 蛋白A固定在通过11-巯基十一烷酸（MUA）自组装单分子层（SAM）功能化的贵金属纳米点上，该过程在去离子水中进行；(B) 带有组氨酸标签的葡萄糖结合蛋白（GBP）与D-葡萄糖形成复合物，并固定在贵金属纳米点之间的基底表面；(C) 硫醇末端的多巴胺结合适配体与多巴胺（DBA）结合后，固定在贵金属纳米点上。更多细节见表1。在图示为面板(B)的设计2中，还制备了不含相应配体的样品作为对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构：蛋白质A、结合D-葡萄糖的葡萄糖结合蛋白、结合多巴胺的DNA适配体、多巴胺。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 三种设计中使用的生物分子：（A）蛋白A；（B）葡萄糖结合蛋白与D-葡萄糖；（C）多巴胺结合DNA适配体与多巴胺。图（a）和（b）中的蛋白质三级结构分别来源于蛋白质数据库（PDB ID 1BDD21 和 2HPH22），并使用VMD for LINUXAMD64（版本1.9.1）23绘制。图（c）中的适配体二级结构是基于序列24，利用ValFold25软件预测，并用PseudoViewer 3.026绘制而成。字母G、A、T和C分别代表鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>设计 1</td>
			<td>设计 2</td>
			<td>设计 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物聚合物</td>
			<td>Protein A</td>
			<td>葡萄糖结合蛋白 (GBP)</td>
			<td>多巴胺结合适配体 (DBA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>结合剂</td>
			<td>11-巯基十一烷酸 (MUA) 自组装单分子层 (SAM)</td>
			<td>组氨酸标签</td>
			<td>巯基连接剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>配体</td>
			<td>无</td>
			<td>D-葡萄糖</td>
			<td>多巴胺</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>去离子水 (DI water)</td>
			<td>磷酸钾缓冲液</td>
			<td>三(羟甲基)氨基甲烷 (TRIS) 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 缓冲液；磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基底</td>
			<td>FS 上的 Au 结构</td>
			<td>Ni 涂层 FS 上的 Ag 结构</td>
			<td>FS 上的 Au 结构</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>图案化区域</td>
			<td>4 μm × 10 μm</td>
			<td>4 μm × 8 μm</td>
			<td>4 μm × 10 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">图案</td>
			<td rowspan="3">Au 点阵，50 nm 间距</td>
			<td>Ag 点阵，40 nm 间距</td>
			<td>Au 六边形，200 nm 间距</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag 六边形，200 nm 间距</td>
			<td>Au 无结构垫片</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag 无结构垫片</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">电子束光刻曝光剂量</td>
			<td>点阵：</td>
			<td>点阵：105 μC/cm2</td>
			<td rowspan="4">六边形：180 μC/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阵列 I：120 μC/cm2</td>
			<td>六边形：170 μC/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阵列 II：96 μC/cm2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阵列 III：72 μC/cm2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>激光激发波长</td>
			<td>532 nm</td>
			<td>532 nm</td>
			<td>780 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 纳米生物系统的三种设计。

<table><tbody><tr><td>11-巯基十一烷酸 (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>用于设计1中的表面功能化</td></tr><tr><td>导电聚合物</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>使用70纳米厚层作为EBL曝光时的抗荷电涂层</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>合作实验室</td><td></td><td>设计2中的配体</td></tr><tr><td>多巴胺</td><td>合作实验室</td><td></td><td>设计3中的配体</td></tr><tr><td>多巴胺结合适配体 (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'- /Thiol Modifier C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>设计3中的生物聚合物</td></tr><tr><td>熔融石英晶圆</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖结合蛋白 (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 合作实验室</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;PDB ID 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>设计2中的生物聚合物</td></tr><tr><td>高真空油脂</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>用于密封防水腔室</td></tr><tr><td>过氧化氢 30%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>用于食人鱼溶液</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙基-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(二甲氨基)丙基)碳二亚胺 (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>用于设计1中生物聚合物的固定</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>用于设计1中生物聚合物的固定</td></tr><tr><td>磷酸钾缓冲液</td><td>合作实验室</td><td></td><td>拉曼采样中使用的缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲&amp;nbsp;盐水 (PBS)</td><td>合作实验室</td><td></td><td>设计3中的溶剂</td></tr><tr><td>聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>使用90纳米厚层作为EBL正性光刻胶</td></tr><tr><td>重组蛋白A</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;PDB ID 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>设计1中的生物聚合物</td></tr><tr><td>硫酸 96%, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>用于食人鱼溶液</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷 (TRIS) 和乙二胺四乙酸 (EDTA) 缓冲液</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>设计3中的缓冲液
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>划片机</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO)</td><td></td><td>用于切割FS晶圆</td></tr><tr><td>电子束蒸发镀膜机</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>用于Au和Ag蒸发</td></tr><tr><td>电子束蒸发镀膜机</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>用于Ni蒸发</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>用于防水腔室</td></tr><tr><td>显微镜载玻片 (3&amp;times;1 英寸)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>用于防水腔室</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;TWO&lt;/sup&gt; EBL曝光系统</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;TWO&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; system</td><td>用于EBL曝光</td></tr><tr><td>拉曼显微镜</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>用于拉曼光谱分析</td></tr><tr><td>超声清洗系统</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>用于剥离及溶液混合</td></tr><tr><td>匀胶机</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brewer Spinner and Hotplate</a></td><td>Cee 200X and Cee 1300X</td><td>用于旋涂PMMA和导电聚合物</td></tr></tbody></table>

利用电子束光刻制备的纳米结构基底通过表面增强拉曼光谱检测生物分子

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

报道了在固体基底上将金属纳米结构与固定化生物分子相偶联的共轭纳米生物系统的制备与表征。描述了整个相关实验步骤，包括利用电子束光刻技术制备纳米结构基底、将生物分子固定在基底上，以及通过表面增强拉曼光谱（SERS）对其进行表征。采用了三种不同设计的纳米生物系统，分别为蛋白A、葡萄糖结合蛋白和一种多巴胺结合DNA适配体。在后两种情况下，还包括了相应配体D-葡萄糖和多巴胺的结合。这三种生物分子通过不同的方法固定在纳米结构基底上，并报道了SERS成像的结果。实验结果展示了SERS检测表面固定化蛋白质振动模式的能力，以及捕捉蛋白质-配体和适配体-配体结合过程的能力。结果还说明了表面纳米结构的几何形貌、生物分子固定策略、分子的拉曼活性以及配体结合的存在与否对所获得SERS光谱的影响。

采集主要组分的对照拉曼光谱非常重要，这些组分包括溶液中的游离蛋白质以及溶液中或粉末状态的游离配体，且不使用含金属的基底，以便进行恰当的比较和结果解读。图5A展示了在无纳米结构基底的玻璃载片上，去离子水中游离蛋白A的典型拉曼光谱。其中拉曼强度最高的两个谱带，分别位于2,931 cm-1和1,091 cm-1，对应于C-H键和C-S键的振动。其他强度较低的谱带，如563 cm-1、1,450 cm-1、1,653 cm-1和2,426 cm-1，可归因于多种振动模式的叠加18,33,34,35。在缓冲溶液中，游离配体GPB在三种不同浓度（0.3、0.9和1.3 mM）下的对照拉曼光谱如图5B所示。图中，约3,400 cm-1处的宽谱带对应于溶剂信号36，而2,935 cm-1处的谱带代表蛋白质中C-H键的振动33,34。图5C展示了在缓冲溶液中不同浓度（1、6、100、200和400 mM）D-葡萄糖的高波数拉曼光谱。随着葡萄糖浓度的增加，在2,890 cm-1和2,960 cm-1处出现由C-H键振动产生的谱带。以532 nm和780 nm两种激发波长测得的晶体多巴胺的对照拉曼光谱如图5D所示。该拉曼光谱的大部分信号来源于分子中苯环的弯曲振动以及C-H键的伸缩振动20,37。约3,000 cm-1处的一些谱带仅在532 nm激发波长下观察到，而在780 nm激发波长下未见。
<img alt="显示GBP、D-葡萄糖、多巴胺分析的强度与位移关系的拉曼光谱图" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 在532 nm激发波长下测得的去离子水中蛋白A的对照拉曼光谱18（A）；缓冲溶液中无配体葡萄糖结合蛋白在532 nm激发波长下测得的拉曼光谱（B）；缓冲溶液中D-葡萄糖在532 nm激发波长下测得的拉曼光谱（C）；以及在532 nm和780 nm激发波长下测得的多巴胺粉末的拉曼光谱20（D）。所有光谱均为玻璃载片上溶液（a,b,c）和粉末（d）的常规拉曼光谱，未使用纳米结构基底。在（D）中，拉曼位移区域对应各种分子振动的归属是使用通用原子与分子电子结构系统（General Atomic and Molecular Electronic Structure System, GAMESS）32 和 MacMolPlt31 软件完成的，具体方法见文献20。转载图（a）经美国真空学会许可18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了获得表面固定的生物分子的表面增强拉曼光谱（SERS），需按照步骤1-3所述方法制备以熔融石英为支撑、含有金属纳米结构的基底。基底的质量通过扫描电子显微镜（SEM）进行监测。标准的SEM操作流程已在其他文献中描述16,17,18,19，本实验方案中不再赘述。图6展示了金（Au）和银（Ag）纳米点及类纳米六边形结构的典型SEM图像（图a-d），以及未结构化的金和银电极区域（图e和f，分别对应）。后续步骤包括在纳米结构基底上固定生物材料，采用表1中列出的三种设计，并采集其SERS光谱。为了在拉曼成像过程中维持水相环境，每个样品均置于相应的溶液中（见表1），加盖一层薄玻璃盖片，并按图7所示方式进行密封。
<img alt="纳米粒子设计比较，Au/FS 与 Ag/Ni/FS，显微图像，纳米结构分析。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 用作表面增强拉曼散射（SERS）基底的 10 nm 厚 Au 和 Ag 表面纳米结构的扫描电子显微镜（SEM）图像：（A、B）纳米点阵列；（C、D）纳米六边形阵列；（E、F）无结构垫层。具有 Au 结构的基底（左侧）采用 FS 支撑，而具有 Ag 结构的基底（右侧）在 FS 上使用 10 nm 厚的 Ni 涂层。图像获取方法见文献16,17,18。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="激光激发示意图；使用真空密封显微镜盖片进行样品分析的光谱学装置。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7. 用于溶液中生物功能化样品拉曼成像的防水腔室示意图。
在设计1中，重组蛋白A被固定在通过11-巯基十一烷酸（MUA）自组装单分子层在去离子水中原位功能化的基底上18。该设计中的基底包含三个金点阵列，点间距为50 nm，点间距离不同，基底材料为熔融石英（见图6A和图8）。蛋白质固定化过程始于基底上自组装单分子层（SAM）的形成。为了在SAM与蛋白质之间实现共价结合，需将SAM上的羧基通过去离子水中N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）溶液和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液的混合物处理，转化为胺反应性NHS酯。蛋白A的固定化通过蛋白质中赖氨酸残基取代NHS基团而实现38。图9展示了设计1中蛋白A固定于金纳米结构上的样品成像示例。图9A为样品的光学显微镜图像，包含三个具有不同点间间隙的生物功能化金纳米点阵列（另见图3Aa和图8）；图9B显示了这些阵列上的拉曼光谱映射结果。可以看出，点间间隙最窄的阵列I具有最高的拉曼强度，而点间间隙最宽的阵列III拉曼强度较低。这可归因于点间狭窄区域中更强的等离子体耦合效应，从而产生更高的局域电场18。图9C展示了阵列I和II获得的最强表面增强拉曼散射（SERS）光谱。光谱中出现多个特征峰（1,630 cm-1、1,964 cm-1、2,280 cm-1、2,577 cm-1和2,916 cm-1），其位置接近于图5A中溶液中游离蛋白A的拉曼振动模式。这些峰源于蛋白质中多种化学键的振动，在固定化蛋白和溶液中蛋白的光谱中出现在相似位置，或在固定化后略微向较高波数偏移。相比之下，仅以MUA SAM功能化但未结合蛋白的类似纳米结构基底的SERS光谱呈现出完全不同的图谱18，证实图9所示为表面固定化蛋白A的SERS映射结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SEM图像中的纳米粒子阵列；纳米结构图案；比例尺：100 nm。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 设计1中使用的石英基底上三种金纳米点阵列的扫描电镜（SEM）图像18。 这些阵列具有相同的50 nm间距，但纳米点半径略有不同，导致点间间隙宽度不同。这是通过在制备三种阵列的PMMA掩模时采用不同的电子束光刻（EBL）曝光剂量实现的（见表1）。较高的曝光剂量会在PMMA掩模中形成更宽的孔洞，从而在金属化和剥离后获得更大的金纳米点尺寸。经美国真空学会许可转载18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱分析，拉曼位移与强度关系图，所研究的阵列，数据比较。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 设计1中固定于基底的蛋白A的表面增强拉曼散射（SERS）成像18。（A）样品的光学显微镜图像，包含三个金纳米点阵列，点间距为50 nm，点间间隙不同，基底为熔融石英（另见图6），生物功能化方式如图3A所示。（B）样品的拉曼映射图。（C）来自点阵列I和II的SERS光谱。在图（B）中，纵轴表示基底上的距离，横轴表示拉曼位移，图例条表示拉曼强度。图（B）和（C）中的垂直虚线表示溶液中游离蛋白A的参考拉曼峰，图（C）中的（*）表示来自阵列I的SERS峰。拉曼光谱采用532 nm激发波长获得。经美国真空学会许可转载18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在设计2中，重组葡萄糖结合蛋白（GBP）22 与D-葡萄糖（配体）形成的复合物被固定在磷酸钾缓冲液中的适当基底上。同时制备了固定无配体GBP的样品作为对照。在此设计中，葡萄糖结合蛋白通过组氨酸标签与表面连接，该标签可良好地结合Ni，但不与贵金属结合6。由于基底包含Ag纳米点、纳米六边形以及在Ni涂层熔融石英（FS）上的非结构化Ag电极（分别对应图6B、6D和6F），因此可预期大多数固定的蛋白分子位于Ag纳米结构之间的间隙中，这些区域存在Ni涂层。固定后的无葡萄糖GBP和结合葡萄糖的GBP所获得的拉曼光谱分别如图10A和图10B所示。所有这些光谱均在约3,300 cm-1处显示一个宽峰，对应于缓冲溶液36。使用非结构化Ag电极获得的光谱仅包含这一单峰，未显示任何蛋白振动模式，证实如预期那样，在Ag表面未检测到固定蛋白。相比之下，使用Ag纳米点和纳米六边形阵列获得的光谱在约1,550 cm-1和2,900 cm-1处出现峰，代表分析物信号33,34。特别是约1,550 cm-1处的宽峰，即酰胺II带，归因于蛋白中肽键的振动34,35。在本研究情况下，该峰反映了固定在Ag结构之间Ni表面的GBP振动模式的叠加，表明当使用含有纳米点或纳米六边形的基底时，这些模式在贵金属纳米结构附近产生了表面增强拉曼散射（SERS）增强效应。该峰在无SERS增强条件下溶液中的蛋白光谱中非常微弱（图5B），在无可用Ni表面的Ag电极上则完全缺失，但在具有部分可及Ni表面的纳米结构基底上表现明显。然而，对于本研究更为重要的是约2,900 cm-1附近的其他较窄峰，可归因于C-H键的振动33,34。无葡萄糖GBP的光谱在使用纳米点基底时在2,933 cm-1处显示出明显的峰，在使用纳米六边形基底时也在相似波长处出现微弱但可辨识的峰（图10A）。与无葡萄糖蛋白的情况不同，图10B中显示的结合葡萄糖GBP的SERS光谱表现出两个对应于C-H键振动模式的峰，分别位于2,850 cm-1和2,910 cm-1。这两个峰在结合葡萄糖的GBP位于纳米六边形基底的光谱中表现明显，也可在纳米点基底的GBP光谱中观察到。2,850 cm-1处的峰与溶液中D-葡萄糖对照拉曼光谱的2,890 cm-1峰较为接近，因此可归因于与蛋白结合的葡萄糖；而另一个峰（2,910 cm-1）则归因于蛋白和葡萄糖中C-H键的共同振动。可以得出结论：在此区域可观察到无葡萄糖与结合葡萄糖的基底固定GBP的SERS特征差异，且利用所述设计可检测到与蛋白结合的葡萄糖的C-H键振动。
<img alt="拉曼光谱图；Ag-Ni 表面上的 GBP 纳米结构；酰胺 II、C-H 峰。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 10"> 
图 10. 设计 2 中固定于三种不同基底上的无配体（A）和配体结合型（B）葡萄糖结合蛋白的表面增强拉曼光谱（SERS）。光谱使用 532 nm 激发波长获得。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在设计3中，带有硫醇末端的定制多巴胺结合适配体（DBA）24被固定在三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲溶液中的基底上，随后多巴胺与固定的适配体结合20。该设计所用基底包含在熔融石英（FS）上的金纳米六边形阵列（图6C）。此外，还使用了无结构的金垫（图6E）作为对照。由于DNA本身具有荧光特性39，设计3中采用780 nm的激发波长以降低这一因素的影响。在此设计中，识别元件（适配体）在图11所考虑的拉曼位移区域内无拉曼活性，而多巴胺在该区域表现出显著的拉曼活性。由于仅暴露于多巴胺但未固定适配体的样品未显示出相应的多巴胺谱带20，因此观察到的表面增强拉曼散射（SERS）谱带应来源于与适配体结合的多巴胺。图11比较了金纳米结构上固定适配体在加入多巴胺前后的SERS光谱。正如预期，未结合多巴胺的固定适配体不显示拉曼谱带；相反，在结合多巴胺的固定适配体上观察到多个明显的拉曼谱带。图11中大多数谱带的位置接近结晶态多巴胺中的位置，尽管其强度存在差异。
<img alt="拉曼光谱图，比较不同拉曼位移和强度下金六边形上的DBA/多巴胺。" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图11"> 
图11. 设计320中固定在金纳米六边形基底上的无配体（紫色线）和配体结合型（蓝色线）多巴胺结合适配体的表面增强拉曼光谱（SERS）。 红色线显示了多巴胺粉末的对照SERS光谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了纳米生物系统的制备与表征，该系统将纳米结构基底与固定化的蛋白质和适配体进行界面结合。文中报道了涉及纳米结构基底的光刻制备、生物功能化以及表面增强拉曼光谱（SERS）表征等相关实验步骤。展示了对表面固定化蛋白质的SERS检测，以及对蛋白质-配体和适配体-配体结合相互作用的探测。

在固体载体上将金属纳米结构与固定化生物分子相偶联的共轭纳米生物系统的制备与表征

以下实验的总体目标是构建并表征共轭纳米生物系统，该系统通过将固体纳米结构基底与固定化的生物分子相连接而形成界面。该目标通过采用超高分辨率电子束光刻技术（EBL），在熔融石英基底上制备出微小的金属纳米结构阵列来实现。第二步，将基底置于溶液中，使生物分子在其表面固定化，从而形成纳米生物界面。接下来，采用表面增强拉曼光谱（SERS）来探测界面处的生物分子。所获得的SERS光谱呈现出特定分子的拉曼振动模式特征，其信号强度强烈依赖于基底的设计。与现有技术（如红外光谱）相比，本方法的主要优势在于，由于金属纳米结构中的表面等离子体共振效应，检测灵敏度可得到显著提升。我们的方法通过分子功能化与电子束光刻技术的结合，能够创建出高度选择性的表面，并实现便捷调控。该方法可回答多个领域的关键科学问题，涵盖结构生物学探索研究、聚合物驱动的服务应用，以及涉及纳米生物界面的各种器件开发。该方法能够深入揭示生物分子的结构特性，其影响可延伸至医学诊断或环境检测等领域。通常，刚接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该方法涉及纳米制造、表面功能化、生物化学和光谱学等多个传统上互不相关的领域。首先，在基底上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）抗蚀剂层和导电层。为此，使用带有真空卡盘的晶圆旋转涂布仪，将样品逐一置于卡盘中央。用玻璃移液管在样品中心滴加一滴 PMMA 抗蚀剂。然后以3,500 RPM转速离心60秒，加速度时间为2秒。接着将基底在180摄氏度下烘烤3至5分钟，烘烤完成后使样品随基底冷却至室温，随后将基底放回旋涂机卡盘。在基底上滴加一滴导电聚合物。按照文本方案中所述，在完成电子束光刻（EBL）曝光后，将样品在80摄氏度下烘烤一分钟，然后以3000 RPM转速旋转基底40秒，随后进行两秒的斜坡减速。准备一个烧杯，装入去离子水以去除导电聚合物。再准备第二个烧杯，加入显影液混合物，室温下搅拌五分钟。最后，使用镊子在第三个烧杯中准备好异丙醇作为冲洗剂。将样品放入水中3秒，以去除导电聚合物薄膜。然后将样品放入显影液中，并立即缓慢上下移动镊子20秒，随后迅速将基底转移至异丙醇中，再冲洗10秒，接着用氮气吹干样品。将样品倒置装入电子束蒸发系统中，以便蒸发的金属沉积在样品的正面。在第一和第三种设计的样品上沉积一层约10纳米厚的金层，在第二种设计上沉积一层约10纳米厚的银层，沉积速率为每秒约0.1纳米。然后，向超声系统中加入推荐高度的水，并在另一个烧杯中倒入丙酮。将样品正面朝上放入烧杯底部，保持烧杯静置，使样品浸泡10分钟。然后将烧杯放入水浴中，调节丙酮液面高度与水位高度一致。随后开启超声系统。超声处理最长持续60秒。为首先制备设计一的样品，先在室温下配制1毫摩尔的MUA与乙醇溶液，并超声处理10分钟。将合适的纳米结构基底浸入MUA溶液中，浸泡48小时。然后用乙醇冲洗样品三次，并干燥五分钟。将温度调至室温。接下来，用EDC和蒸馏水配制75毫摩尔的溶液。同时，使用微量移液器将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）配制成 15 毫摩尔的水溶液，取 100 微升 NHS 溶液滴加到基底的金表面，随后立即在同一区域加入 100 微升 EDC 溶液。孵育 1 分钟，以活化 MUA 的自组装单分子层。然后，在基底的同一区域滴加 100 微升蛋白质溶液。将样品放入培养皿的一个区域中，另一区域加入一毫升蒸馏水。用盖子密封培养皿，并在5°C条件下保存样品24小时。随后，将样品在蒸馏水中清洗三次，每次分别置于不同的烧杯中持续清洗20秒；清洗过程中或清洗后均不得使样品干燥，针对设计中的两个样品均需如此操作。在磷酸钾缓冲液中配制0.9毫摩尔的葡萄糖结合蛋白（GBP）溶液。同时在缓冲液中配制100毫摩尔的DG葡萄糖溶液。接下来，取30微升D-葡萄糖溶液与30微升GBP溶液混合。使用一个1毫升的塑料微量离心管和微量移液器孵育30分钟，然后将20微升无配体的GBP溶液和20微升配体结合的GBP溶液分别滴加到制备好的基底上。使用微量移液器将样品置于培养皿中，加盖密封后于5°C保存24小时。在室温下用磷酸钾缓冲液冲洗样品三次以进行准备。设计三个样品，将多巴胺结合适配体（DBA）溶液用终pH为7.4的Tris-EDTA缓冲液稀释至1微摩尔浓度。使用分析天平称量多巴胺粉末，并将其溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入搅拌子搅拌5分钟，配制成5微摩尔浓度的多巴胺溶液。然后，将20微升DBA溶液滴加至各基底表面，将样品置于培养皿中，室温下避光孵育1小时。用磷酸钾缓冲液将样品冲洗三次后，将样品垂直放置在洁净室级别的擦拭纸上，以干燥基底背面，同时保持基底正面的液膜。留出一份样品作为对照。随后，将 5 µL 多巴胺溶液滴加到现有 PBS 表面。将剩余样品点样。在磷酸钾缓冲液中清洗样品三次前，先将样品孵育10分钟。以进行拉曼光谱分析。将每个样本置于防水腔室中，以避免激光照射导致蒸发。用化学惰性的高真空润滑脂填充塑料注射器。然后将样本放置在玻璃载片上，并在不接触样本的情况下，在其周围挤出数毫米的润滑脂。将显微镜盖玻片置于基底上方，轻轻按压以形成密封，使基底与盖玻片之间形成一层薄的液体界面，同时避免缓冲液接触真空油脂。使用光学拉曼显微镜系统，在不开启激光的情况下，对准待测金属纳米结构区域的表面进行聚焦。按照文中所示实验方案进行拉曼采样。此处为在熔融石英上制备的金和银-镍纳米图案点阵列。采用电子束光刻（EBL）可实现优异的位置和尺寸控制。控制点的尺寸和间隙宽度由电子束光刻（EBL）曝光控制。此处展示的是金和银-镍复合材料的六边形阵列。此类超薄金属层的成核行为导致形成不连续结构。在此系列光谱中，设计一中固定在基底上的蛋白A信号强度来自阵列一的信号远强于阵列二，阵列三的信号则非常微弱。间隙间距显然是影响等离子体去耦合以及拉曼散射表面增强效果的关键参数。以下是葡萄糖结合蛋白的光谱图，展示了不同底物设计在配体游离态和配体结合态下的影响。最后给出了多巴胺结合适体在配体游离态和配体结合态分子的光谱图。为作参考，还显示了多巴胺粉末的光谱图。在进行该实验操作时，重要的是避免基底材料被污染。由于光谱技术具有高度敏感性，若操作不当可能会导致错误的读数。可针对特定分析物确定最佳的源基底设计。随后，可以采用其他非光刻图案化方法（如非印刷型PHY），以进一步提高基底制备的可扩展性。该技术帮助生物化学与生物传感领域的研究人员能够在溶液中无需特定表面的情况下，检测极微量的生物分子。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用制备技术调控金属纳米结构的尺寸与薄膜特性，以及如何运用不同的生物分子识别策略来靶向不同的分析物。

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