表面增强拉曼光谱检测生物分子利用EBL装配纳米衬底
2015年3月20日
我们描述了纳米结构底物与固定化蛋白质和适配体相连接的纳米生物系统的制造和表征。报道了涉及纳米结构衬底的光刻制造、生物功能化和表面增强拉曼光谱 （SERS） 表征的相关实验步骤。证明了表面固定蛋白的 SERS 检测，以及蛋白质-配体和适体-配体结合的探测。
以下实验的总体目标是制造和表征将固体纳米结构基材与固定化生物分子相连接的共轭纳米生物系统。这是通过利用超高分辨率电子束光刻或 EBL 在熔融石英载体上获得微小金属纳米结构阵列来实现的。第二步，将底物置于溶液中，将生物分子固定在其表面，产生纳米生物界面。
接下来采用表面增强拉面光谱或 SIRS 来探测界面处的生物分子。所得的 sir 光谱表现出特定分子的拉面模式特征，其强度在很大程度上取决于衬底设计。与红外光谱等现有技术相比，我们的方法的主要优势在于，由于金属纳米结构内的表面等离子体和共振，灵敏度可以大大提高。
我们的方法创建了高度选择性的表面，可以使用分子功能化和电子束光刻相结合来轻松控制。这种方法可以回答多个领域的关键问题，从结构生物学的探索研究或聚合物调动的服务到涉及纳米生物界面的各种设备的开发。这种方法可以在科学上提供生物分子的结构特性，其影响延伸到医学诊断或环境检测。
一般来说，刚接触这种方法的人可能会很挣扎，因为它涉及纳米制造、表面功能化、生物化学和光谱学等方面，这些方面传统上是无关的。要开始旋涂聚甲基丙烯酸甲酯或 PMMA，在基材上涂上光刻胶和导电层。为此，请使用带有真空吸盘的晶圆旋转器，并将样品单独放置在吸盘的中心。使用玻璃移液管将一滴 PMMA 光刻胶滴在样品的中心。
然后以 3， 500 RPM 的速度旋转 60 秒，加速时间为 2 秒。接下来，烘烤基材后，在 180 摄氏度下烘烤基材 3 到 5 分钟，在基材冷却的情况下将样品冷却至室温，然后返回旋转卡盘。在基板上涂抹一滴导电聚合物。
以 3000 RPM 的速度旋转底物 40 秒，旋转后增加 2 秒。按照文本方案中的说明进行电子束光刻或 EBL 曝光后，将样品在 80 摄氏度下烘烤 1 分钟，准备一个装有电离水的烧杯以去除导电聚合物。然后用显影混合物准备第二个烧杯，搅拌 5 分钟，设置室温。
最后，使用镊子在第三个烧杯中制备异丙醇作为冲洗剂。将样品放入水中 3 秒钟，以去除导电聚合物膜。然后将样品放入显影剂中，缓慢上下移动镊子 20 秒，立即将底物转移到异丙醇中并再冲洗 10 秒，然后用氮气干燥样品，将样品倒置到电子束蒸发器系统中，以使蒸发的金属沉积在样品的正面。
在样品上沉积一个 10 纳米厚的金层用于设计 1 和 3，在设计上沉积一个 10 纳米厚的银层。两个，速率约为每秒 0.1 纳米。然后用水将超声处理系统填充至推荐高度，并在单独的烧杯中加入丙酮。
将样品面朝上放在烧杯底部，让样品握住烧杯浸泡 10 分钟。将其放入水浴中，让丙酮的高度与水的高度相匹配。然后打开超声处理系统。
让超声处理进行长达 60 秒。要制备 design one 样品，首先在室温下制备 MUA 和乙醇的 1 毫摩尔溶液，并超声处理 10 分钟。将适当的纳米结构基材浸入 MUA 溶液中 48 小时。
然后用乙醇冲洗样品 3 次并干燥 5 分钟。设置室温。接下来，制备 75 毫摩尔的 EDC 和蒸馏水溶液。
此外，使用微量移液器沉积物在蒸馏水中制备 15 毫摩尔的 NHS 溶液，将 100 微升 NHS 添加到衬底上的金上，并立即在同一区域添加 100 微升 EDC。孵育 1 分钟以激活自组装的单层 MUA。然后将一滴 100 微升蛋白质（一种溶液）滴在底物的相同区域。
将样品放入培养皿的一个隔室中，在另一个隔室中加入一毫升蒸馏水。用盖子密封培养皿，并将样品在 5 摄氏度下存放 24 小时。接下来，用蒸馏水冲洗样品 3 次，将样品连续放入单独的烧杯中，在每个烧杯中浸泡 20 秒，冲洗后或冲洗过程中不要让样品干燥，为设计两个样品。
在磷酸钾缓冲液中制备 0.9 毫摩尔的葡萄糖结合蛋白或 GBP 溶液。同时在缓冲液中制备 100 毫摩尔的 DG 葡萄糖溶液。接下来混合 30 微升 D 葡萄糖溶液和 30 微升 GBP 溶液。
使用 1 毫升塑料微管容器和微量移液器孵育 30 分钟，然后将 20 微升无配体 GBP 溶液和 20 微升配体结合的 GBP 溶液沉积到准备好的底物上。使用微量移液器将样品在 5 摄氏度下储存在带密封盖的培养皿中 24 小时。在室温下用磷酸钾缓冲溶液冲洗样品 3 次制备。
设计三个样品，将多巴胺结合 apre 或 DBA 溶液稀释至一微摩尔的浓度。使用最终 pH 值为 7.4 的 tris EDTA 缓冲液，通过在分析天平上测量多巴胺粉末并将其与磷酸盐缓冲盐水或 PBS 与搅拌珠混合 5 分钟，制备浓度为 5 微摩尔的多巴胺溶液。然后将 20 微升 DBA 溶液滴在每个底物的表面上，让样品在室温下放置 1 小时，并盖上培养皿。
在磷酸钾缓冲液中冲洗样品 3 次后，将样品直立放在洁净室级抹布的顶部以干燥背面，同时在底物正面保持薄膜。将样品放在一边作为对照。接下来，将 5 微升多巴胺溶液滴到现有 PBS 的表面上。
滴在剩余的样品上。孵育样品 10 分钟，然后在磷酸钾缓冲溶液中冲洗样品 3 次。进行拉面光谱分析。
将每个样品放在防水室中，以避免激光照射蒸发。在塑料注射器中加入化学惰性高真空润滑脂。然后将样品放在载玻片上，并在样品周围分配几毫米的油脂，不要接触样品。
将显微镜盖玻片放在基材顶部。轻轻向下按压以形成密封，在基材和盖玻片之间形成一个薄的液体界面，而不会让缓冲液与真空润滑脂接触。使用光学拉曼显微镜系统，无需打开激光器即可聚焦在要采样的金属纳米图案区域的表面。
按照所示文本协议中的说明执行拉曼采样。以下是熔融石英上金和银镍的纳米图案点阵列。使用电子束光刻或 EBL 可实现极好的位置和尺寸。
控制点大小和间隙宽度由 EBL 曝光控制。此处显示了银镍的金端的剂量六边形阵列。这种非常薄的金属层的成核行为导致了不连续的结构。
这是设计 1 中底物固定化蛋白 A 的系列光谱，来自阵列 1 的信号强度比来自阵列 2 的信号强度强得多。来自第三阵的信号非常微弱。间隙间距显然是显示的拉面散射的等离子体解耦和表面增强的关键参数。
以下是葡萄糖结合蛋白的光谱，显示了不同底物设计在无配体和配体结合状态下的影响。最后，显示了无配体和配体结合分子的多巴胺结合适配体的 s 谱图。显示了多巴胺粉的光谱以供参考。
在尝试此过程时，避免基材污染很重要。作为一种光谱技术，它是高度敏感的，您可能会有错误的读数 采用此程序。可以确定特定分析物的最佳源底物设计。
然后可以执行其他 nphy 方法，如非打印 phy，以提高衬底制造的可扩展性 开发后。该技术帮助生物化学和生物传感领域的研究人员在保持溶液状态的同时以非常少量的方式检测没有特定表面的生物分子。观看本视频后，您应该对如何使用制造技术控制金属纳米结构和薄膜特性以及如何利用不同的生物分子识别策略来靶向不同的分析物有一个很好的了解。
概览
本研究详细描述了将纳米结构基底与固定的蛋白质和适配体相接口的纳米生物系统的制造和表征。方法包括光刻制造、生物功能化和表面增强拉曼光谱（SERS）表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米生物技术
- 生物分子相互作用
- 表面增强光谱
背景
- 利用电子束光刻进行纳米结构制造。
- 涉及生物分子在基底上的固定。
- 采用SERS来探测生物分子。
- 通过表面等离子体共振增强灵敏度。
研究目的
- 创建用于生物分子研究的高度选择性表面。
- 探索生物分子的结构性质。
- 开发涉及纳米生物界面的设备。
使用的方法
- 电子束光刻用于基底制造。
- 在纳米结构表面固定蛋白质和适配体。
- 表面增强拉曼光谱用于表征。
- 用分子层功能化表面。
主要结果
- 成功使用SERS检测固定的蛋白质。
- 探测蛋白质-配体和适配体-配体相互作用。
- 展示比传统方法有更高的灵敏度。
- 提供了生物分子结构性质的见解。
结论
- 该方法为研究生物分子相互作用提供了强大的工具。
- 它在医学诊断和环境检测方面具有潜在应用。
- 结合了纳米制造、生物化学和光谱学的方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) combined with electron beam lithography (EBL) enables detection of biomolecular interactions at nanostructured interfaces, supporting target validation through direct observation of binding events. This approach enhances sensitivity for low-abundance analytes, improving predictive confidence in early discovery by reducing false negatives in biomolecular screening. The method provides a reusable platform for assay development, allowing scalable evaluation of ligand binding across protein and aptamer-based systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct detection of protein-ligand and aptamer-ligand binding, supporting hypothesis interrogation and target de-risking.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative readouts of binding affinity and specificity, reducing reliance on indirect assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible SERS spectra that reflect ligand-induced conformational changes, enabling assay standardization.
- Operational Value: Supports multiplexed screening via spatially addressable nanostructure arrays fabricated by EBL.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by capturing real-time biomolecular interactions in near-native conditions.
- Operational Value: Offers a pathway to translate in vitro binding data into predictive models for diagnostic or environmental sensing applications.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven target validation, followed by assay optimization for screening campaigns, and informing preclinical continuity through binding-derived structural insights.
- Discovery Biology: Supports target validation by visualizing binding-induced spectral shifts in immobilized biomolecules.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, substrate-enhanced signals that scale across array formats.
- Analytics: Delivers vibrational fingerprint data that allows discrimination between bound and unbound states, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects binding data to potential biomarker applications via demonstrable ligand-specific spectral responses.
- Enterprise Reuse: Positions EBL-fabricated substrates as a regeneratable platform for repeated biomolecular screening cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, label-free observation of biomolecular recognition events.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise nanostructure fabrication and standardized immobilization protocols.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving early detection of non-binders and false positives.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on quantifiable binding metrics from SERS outputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, surface chemistry, and Raman spectroscopy.
- Depends on access to electron beam lithography systems and optical Raman microscopes.
- Necessitates cross-functional standardization between fabrication, biofunctionalization, and analytical teams.
- Involves adaptation considerations for different biomolecules and immobilization chemistries.
- Includes practical limitations related to substrate stability, signal variability across nanostructure geometries, and ligand accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:04
Fabrication of Nano-patterned PMMA Masks Using Electron Beam Lithography (EBL)
3:47
Noble Metal Nanostructures Fabrication
4:41
Bio-functionalization of Substrates
8:14
Raman Spectroscopy
9:09
Results: Nanostructure-enabled SERS Spectra of Biopolymers
10:29
Conclusion
