微流控控制环境的红细胞聚集动态调查
2015年6月4日
该协议描述细节的实验步骤，根据一个控制的和恒定的剪切速率量化红血细胞（RBC）的聚集体的基础上，图像处理技术。这个协议的目标是涉及红细胞聚集体尺寸，以在受控的微流体环境中的相应的剪切速率。
该程序的总体目标是在受控和恒定的剪切速率下动态地定量微循环中的红细胞聚集体。这是通过在训练中首先使用红细胞悬液和带有磷酸盐缓冲盐水溶液的双 y 微通道来实现的，从而在血液层中产生持续的欢呼。第二步是使用高速相机可视化和记录流向。
接下来，使用图像处理技术处理记录并获得平均聚合大小和微通道中的聚合大小分布。最后一步是通过跟踪两个连续帧之间注入微通道的荧光粒子的位移来确定血液速度。最终，根据血液速度和血层厚度计算微通道中的剪切速率，以将骨料大小与相应的局部剪切速率相关联。
与光透射法等现有方法相比，该技术的主要优点是，红细胞聚集体在微观共享流中动态分析，而不是使用其他技术进行统计分析。这种方法可以帮助回答血液放射学领域的关键问题，例如了解红细胞聚集体形成的条件和发现微循环中的血液放射学行为。根据标准光刻方法开始制造 120 微米宽、60 微米高和 7 毫米长的微通道。
接下来，从健康的志愿捐献者那里收集血细胞，并按照随附的文本方案中所述制备血细胞比容水平为 5、10 和 15% 的红细胞悬液，将每种红细胞悬液的 1 毫升与 60 微升含有荧光示踪剂颗粒的 1% 溶液混合。轻轻摇动试管以混合溶液。此外，将相同体积的示踪剂颗粒混合到 pH 值为 7.4 的 1 毫升 PBS 中。
在一个 25 μL 玻璃注射器中加入含有红细胞的示踪剂溶液和一个 100 μL 玻璃注射器。使用 PBS 中的示踪剂溶液，确保系统中不存在气泡。接下来，将微通道放在倒置显微镜载物台上，该台连接到能够以每秒 18 帧或更高的速度记录高速相机和微粒图像测速系统。
通过管道将每个注射器连接到微流体通道的入口之一，然后将它们加载到同一注射泵的支架中。对注射泵进行编程，以每小时 2 微升的速度分配 25 微升注射器。由于尺寸差异，这也将以该速率的四倍分配 100 微升注射器。
在实验之间改变流速，以测试不同的剪切速率。使用 20 x 镜头的校准嘲讽来校准高速相机。然后启动泵，开始将两种溶液分配到微通道中。
确定最佳相机曝光度。是时候对骨料进行清晰的成像了。在获取任何测量值之前，等待流达到稳态非常重要。
如果现在达到稳定状态，请在 3 到 5 分钟内完成。重新填充注射器以教育混合物并保持红细胞悬浮。达到稳态流量后，开始记录红细胞的运动。
记录流 7 秒。使用能够进行图像处理的程序，增强使用直方图均衡器方法拍摄的每个灰度图像的对比度。接下来，将灰度图像转换为二进制图像。
通过测试多个值并选择正确检测所有聚合的值，仔细设置阈值。如有必要，填满与一个骨料中的间隙相对应的孔。然后通过确定二进制图像中的相邻白色像素来检测单元格，以便将相邻单元格视为聚集体。
标记检测到的不同红细胞聚集体，然后将二元图像转换为红色、绿色、蓝色图像，以便更好地可视化。最后，将红色、绿色、蓝色图像叠加到原始图像上。为了验证图像处理的效率，请根据检测到的像素数计算帧中检测到的每个聚集体的面积。
以相同的方式处理所有帧。接下来，平均每个帧中检测到的聚合大小，然后计算所有帧的结果。为了获得红细胞悬浮液引擎每次记录的平均聚集体大小，请使用 ridicule 图像将结果转换为平方微米。
然后计算一个红细胞的面积以确定代表。获取数据后，每个检测到的集合体中红细胞的估计数量。使用高速相机，切换到用于微粒图像测速系统的双脉冲相机。
使用成像软件（如此处所示）进行流动的图像采集和速度场测定的图像处理。请务必戴上防护眼镜，然后打开激光系统和相机。将千分尺放在显微镜下，并使用所得图像校准系统。
然后开始流体流动并可视化两种流体中的颗粒。通过聚焦流动中最快、最亮的粒子，找到微通道的中间平面。接下来，将帧之间的时间间隔设置为大约两毫秒，以便最快的粒子在两个图像之间移动 5 到 10 个像素，并开始记录流 O.设置软件以获取所有不同红细胞悬液和不同剪切速率的 100 对图像。
以下图像预处理。选择相关窗口的大小和形状，以及图像重叠的百分比。将结果表示为根据 100 个图像对和速度的均方根误差计算的平均速度场。
关闭激光相机和计算机。完成所有测量和图像处理后，首先根据高速摄像机记录检测和估计微通道中的血液厚度，从而计算剪切速率。为此，请对特定录制中的所有帧进行平均，以获取视频的背景图像。
最后，通过目视检查所有帧的平均图像并手动检测血液层的边缘来去除血液层。然后从提取的速度曲线中手动获得相应血层厚度的速度值，并通过将速度值除以血层来计算剪切速率。此处显示的厚度是在三个连续帧中检测到的四个红细胞聚集体的净运动。
超过 30 个像元的大聚集体以红色显示。9 到 30 个细胞之间的培养基聚集体显示为绿色，少于 9 个细胞的小聚集体显示为蓝色。聚集体的速度根据其在所示微通道中的位置而变化。
以下是以 5% 血细胞比容、10% 血细胞比容和 15% 血细胞比容以每小时 10 微升流速悬浮的红细胞的速度曲线。正如预期的那样，您可以看到两个边缘的速度都趋向于零，并且两个流之间的拐点在血细胞比容水平之间略有不同，因为总剪切速率会增加每个血细胞比容水平下降的聚集体大小。这是由于微通道中的绝对力超过了导致红细胞解聚的聚集力。
在进行此程序时，请务必记住确保微通道中血流的良好图像质量，并确保红细胞流动与图像背景之间的对比。观看此视频后，您应该对如何在受控流速条件下定性和定量分析红细胞聚集体有很好的了解。
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概述
本协议概述了一种使用图像处理技术在受控剪切速率下量化红细胞（RBC）聚集的方法。该研究旨在相关红细胞聚集大小与微流控环境中的剪切速率。
关键研究组成部分
科学领域
- 微流控
- 血液学
- 图像处理
背景
- 红细胞聚集在微循环中起着关键作用。
- 理解剪切速率对于研究血流动力学至关重要。
- 图像处理技术可以增强红细胞聚集的分析。
- 本研究利用微通道设置进行受控实验。
研究目的
- 在微流控环境中量化红细胞聚集。
- 将聚集大小与局部剪切速率相关联。
- 改进对微循环中血流行为的理解。
使用的方法
- 在磷酸盐缓冲盐水溶液中制备红细胞悬液。
- 使用高速摄像机可视化流动。
- 图像处理以确定平均聚集大小和分布。
- 根据血液速度和层厚度计算剪切速率。
主要结果
- 成功量化了红细胞聚集大小。
- 建立了聚集大小与剪切速率之间的关系。
- 展示了图像处理技术的有效使用。
- 洞察了微循环中红细胞行为的动力学。
结论
- 该协议提供了一种研究红细胞聚集的可靠方法。
- 研究结果增强了对微流控系统中血流的理解。
- 未来的应用可能包括血液疾病和治疗的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
