基于纸张的细胞外囊泡分离与表征装置

本实验的总体目标是利用基于纸张的平台分离细胞外囊泡。首先，将两张聚苯乙烯片与圆形纤维素纸片进行层压，纸片经裁剪后对齐排列在一组精确对应的通孔阵列上。第二步是在纸张检测区化学偶联能够结合细胞外囊泡的分子。

接下来，可将生物样本直接用移液器加到试纸检测区，经洗涤步骤后即可分离细胞外囊泡。最后一步是利用电子显微镜、ELISA 或转录组学分析对捕获的细胞外囊泡进行表征。最终，仅需低至 10 µL 的血清样本即可实现特定亚群细胞外囊泡的纯化与浓缩。

因此，与现有的超声处理等方法相比，该技术的主要优势在于其操作更为温和，且易于实施。演示该实验步骤的将是研究生Shall you。首先取两片聚苯乙烯材料，制备出一系列圆形切口阵列。

使用手动打孔器或计算机辅助的自动切割绘图仪，制备直径均小于五毫米的样品。此外，使用打孔器切割一系列直径为五毫米的色谱纸圆片。将一张聚苯乙烯片放置在实验台上，并在每个对应的通孔上方覆盖一个纸圆片。

将第二张聚苯乙烯片材对齐并覆盖在纸盘上，形成三明治结构。在使用热压层压机将该三明治结构粘合前，检查整体对位情况。随后，通过将层压后的装置插入等离子体腔室，开始对纸盘进行化学表面修饰。

在释放腔室真空后，立即用氧气等离子体短暂活化纸张表面，并立即将纸张装置转移至cylin溶液中，孵育30分钟。室温放置。用5毫升200 proof乙醇冲洗装置，以去除多余的cy lanes。

然后将装置与A-G-M-B-S连接分子溶液孵育15分钟。室温条件下进行。用大量乙醇冲洗去除多余的连接分子。

接下来，将装置在4°C下与avadon孵育一小时，并用5 mL PBS洗涤以去除未结合的avadon。随后，该装置可直接进入抗体结合步骤，或根据需要在4°C下保存长达四周。在Aden附着后，将10 µL封闭液滴加到暴露的纸盘区域，并将纸材孵育10分钟。

在室温下，重复加入 10 微升封闭液，并在室温孵育 10 分钟。再重复两次，以完成暴露的纸质基底的生物功能化。将 10 微升生物素化的捕获分子加样至圆盘上，并在室温下孵育 10 分钟。对于细胞外囊泡，所选的捕获分子可以是抗 CD63 抗体或踝蛋白五（annexin V）。重复 10 微升加样和 10 分钟孵育步骤。

在捕获分子结合后，再重复两次。用移液器将适量洗涤缓冲液（每张纸片10微升）加入，洗去多余的基团。

室温孵育洗涤液1分钟，重复10 µL洗涤液及1分钟孵育步骤两次。至此，功能化纸基装置已准备好用于从血清或房水中分离细胞外囊泡。进行血清处理时，在真空采血管中收集10 mL外周血，并轻轻倒置混匀5次。

将试管垂直放置，静置30分钟。在室温下，以离心机离心血液样本15分钟。保持室温。

将上层澄清的血清层转移至干净的塑料管中，并弃去下层半固体相。以更高的离心速度离心30分钟以澄清血清。置于室温。

将上清液转移至新的离心管中，并通过0.8微米滤膜过滤以去除细小颗粒。所得滤清血清可立即使用，或于-80°C保存。若需从眼内液中提取细胞外囊泡，应通过侵入性操作直接采集患者的房水，并将样本储存在-80°C。

在使用前，玻璃体样本无需进行过滤或澄清步骤。为了从血清或房水中分离细胞外囊泡，用移液器将五微升生物样本点加到每个生物功能化纸基底圆片上。室温孵育一分钟，然后重复五微升点样及一分钟孵育过程。

亲和结合后，用移液器加入10微升适当的洗涤缓冲液，洗去未结合的囊泡。室温孵育1分钟，重复进行10微升洗涤及随后的孵育步骤，再重复两次。

捕获的细胞外囊泡现在可用于后续分析。将10微升0.5倍浓度的卡诺夫斯基固定剂滴加到每张纸质圆片上，以将捕获的囊泡固定在功能化纸质支撑载体上。室温下孵育10分钟，使交联反应进行，随后用大量PBS冲洗所有圆片5分钟。接下来，按顺序进行以下洗涤步骤，对纸质基底进行脱水处理。

一次35%乙醇孵育，两次50%乙醇孵育，两次70%乙醇孵育，两次95%乙醇孵育，以及四次100%乙醇孵育。每次单独洗涤时，将乙醇溶液在纸片上室温孵育10分钟。当纸装置完全干燥后，在金属溅射仪中用18纳米厚的钯金层对样品进行溅射镀膜。

将样品插入扫描电子显微镜中，在5千伏条件下进行显微观察，以防止生物样品过度充电，从而通过免疫测定检测捕获的囊泡。首先，在每张纸盘上加入5微升抗CD9一抗，室温孵育1分钟。通过机械振荡，用30毫升室温PBS洗涤纸装置，去除所有未结合的抗体。

随后，将五微升辣根过氧化物酶标记的二抗分别加入每张纸片上。室温孵育一分钟。通过机械振荡，用30毫升PBS洗涤装置，以去除未结合的二抗。

最后，将5 µL显色剂与定量底物的混合液滴加到每张纸盘上。在室温下孵育反应20至30分钟，然后使用台式扫描仪扫描检测斑点颜色强度的相应变化。首先，用剪刀或剃刀切除多余的聚苯乙烯覆膜区域，从整体装置中分离出单个纸盘。

将每个纸片放入干净的1.5毫升微量离心管中。通过向每管加入265 µL裂解缓冲液和35 µL基于聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的多糖去除载体，裂解捕获的囊泡，并剧烈涡旋振荡。

为确保囊泡完全裂解以及释放的RNA分子充分游离，向裂解液中加入30微升匀浆液，涡旋混匀，并将离心管置于冰上孵育10分钟。随后，向裂解液中加入330微升酸性酚-氯仿混合液，以确保RNA与蛋白质和DNA实现有效的相分离，每管剧烈涡旋振荡至少15秒。然后将离心管以最大转速离心5分钟。

在室温下，将含有 RNA 的上层水相转移至新的 1.5 毫升离心管中，并弃去下层有机相。向 RNA 样品中加入 1.25 倍体积的 100% 乙醇，短暂涡旋混匀。然后将混合液加入商用 RNA 固相提取柱中。

在室温下离心试管15秒，并弃去流出液。加入700 µL工作溶液洗涤柱子。第一步：离心试管5至10秒，弃去流出液。

接下来，用500 µL工作溶液洗涤柱子。第二步，将离心管离心5到10秒。弃去流出液，并重复洗涤一次。

在室温下以最终一分钟的离心步骤去除任何残留的乙醇，并将干燥的提取柱转移至一个新的1.5毫升离心管中。加入100 µL预热的RNase-free水。以最大转速离心5至10秒，必要时弃去上方的提取柱。

使用带有荧光标记生物素的商业化RNA纯化试剂盒对RNA EIT进行浓缩和进一步纯化。作为表面Im固定的报告分子。通过比较交联剂修饰表面与非功能化纸表面所产生的荧光强度，可以评估纸张功能化方案的有效性和特异性。

此外，当报告分子被生物素标记的抗 CD63 抗体取代时，经过适当功能化的纸质基底相较于阴性对照纸质基底将促进更高的细胞外囊泡捕获率。当不同的捕获分子被固定在纸质基底上时，利用该纸质装置可观察到不同亚群的细胞外囊泡表现出不同的尺寸分布。研究人员还可同时检测囊泡内的RNA含量以及囊泡特异性表面蛋白的丰度。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用纸质设备分离并培养细胞外囊泡。