基于纸张的设备进行隔离外囊泡与表征
April 3rd, 2015
该协议细节的方法分离细胞外囊泡（电动汽车），从细胞中释放的小的膜的颗粒，从少至10微升血清样品。这种方法绕过需要超速离心，需要测定时间仅几分钟，并且使电动车从有限体积的样品的分离。
该程序的总体目标是使用基于纸张的平台分离细胞外囊泡。这是通过首先用两张带有圆形纤维素的聚苯乙烯片层压来实现的，剪纸在一系列注册的通孔上对齐。第二步是化学偶联分子，这些分子会将细胞外囊泡结合到纸质测试区。
接下来，可以将生物样品直接移液到纸质测试区，并在冲洗步骤后分离细胞外囊泡。最后一步是使用电子显微镜、Eliza 或转录组学分析表征捕获的细胞外囊泡。最终，可以纯化和浓缩小至 10 μL 血清样品的细胞外囊泡亚群。
因此，与现有的 ultra education 方法相比，这种技术的主要优点是它组装起来要轻柔得多，而且执行起来很简单。演示该程序将是研究生 shall you。从两张聚苯乙烯开始，创建一系列圆形切口。
每个标本的直径小于 5 毫米，带有手动打孔机或 CAD 自动刻字仪。此外，切出一系列直径为 5 毫米的色谱法，用打孔器制作纸盘。将一张聚苯乙烯片放在工作台上，并在每个相应的通孔顶部覆盖一个纸盘。
通过套准并覆盖第二张聚苯乙烯来夹住纸盘。在热层压机中粘合夹层之前，检查整体对齐情况。接下来，通过将层压装置插入等离子室，开始对纸盘进行化学表面改性。
在腔室真空释放后，用氧气等离子体短暂激活纸张表面，立即将纸质装置转移到圆柱溶液中并孵育 30 分钟。设置室温。用 5 毫升 200 标准乙醇冲洗设备，去除多余的 cy 泳道。
然后将装置与 A-G-M-B-S 接头溶液孵育 15 分钟。设置室温。用大量乙醇冲洗去除多余的接头分子。
接下来，将设备与 avadon 在 4 摄氏度下孵育 1 小时，然后用 5 ml PBS 洗涤液去除未结合的 avadon。然后，该设备可以进行抗体结合步骤，或者如果需要，可以在 4 摄氏度下储存 4 周。连接 Aden 后，将 10 微升封闭液移液移液到裸露的纸盘区域，并将纸孵育 10 分钟。
在室温下，重复添加 10 μL 封闭液和 10 分钟的室温孵育。再吸取两次以完成暴露的纸底物的生物功能化，将 10 微升生物素化的捕获分子移液到圆盘上并孵育 10 分钟在室温下对于细胞外囊泡，选择的捕获分子可以是抗 CD 63 抗体或鑫五抗体。重复 10 μL 移液和 10 分钟的孵育过程。
捕获分子附着后再 2 次。通过移液洗去多余的部分。在每个纸盘上加入 10 微升适当的洗涤缓冲液。
在室温下孵育洗涤液 1 分钟，然后重复 10 μL 洗涤液和 1 分钟孵育步骤两次。功能齐全的纸质装置现在可用于从血清或房水中分离细胞外囊泡用于血清处理。将 10 毫升外周血收集在 vacutainer 管中，然后轻轻倒置管 5 次。
将试管垂直放置并等待 30 分钟。设置室温，将血液样品离心 15 分钟。设置室温。
将顶部透明血清层转移到干净的塑料管中，丢弃下层半固相。以较高的离心速度澄清血清 30 分钟。设置室温。
将上清液转移到新试管中，并通过上清液通过 0.8 微米过滤器去除细小颗粒。所得过滤血清可立即使用，也可在零下 80 摄氏度下储存。如果要从体液中提取细胞外囊泡，请通过侵入性手术直接从患者身上收集房水，并将样本储存在零下 80 摄氏度。
使用前，玻璃体液样品不需要过滤或澄清步骤。为了从血清或房水中分离细胞外囊泡，将 5 微升生物样品点吸管到每个生物功能化纸底盘上。在室温下孵育斑点 1 分钟，然后重复 5 微升移液和 1 分钟孵育过程。
再重复两次亲和结合后，先吸取 10 μL 适当的洗涤缓冲液，冲洗掉未结合的囊泡。在室温下孵育缓冲液 1 分钟，然后重复 10 μL 洗涤和随后的孵育。再迈出两步。
捕获的细胞外囊泡现在已准备好进行后续下游分析，以将捕获的囊泡固定在功能化纸支架上，将 10 微升 0.5 x karnofsky 固定剂移液到每个纸盘上。让交联反应在室温下进行 10 分钟，然后用大量 PBS 冲洗所有光盘 5 分钟。接下来，按顺序进行以下洗涤，使纸张基材脱水。
1 次 35% 乙醇孵育、2 次 50% 乙醇孵育、2 次 70% 乙醇孵育、2 次 95% 乙醇孵育和 4 次 100% 乙醇孵育。对于每次洗涤，让乙醇溶液在纸盘顶部在室温下孵育 10 分钟。当造纸设备是骨干溅射时，在金属溅射中涂覆 18 纳米的钯金层。
将样品插入扫描电子显微镜中，并以 5 kV 的电压进行显微镜检查，以防止生物样品过度充电，以通过免疫测定检测捕获的囊泡。首先在每个纸盘上加入 5 μL 抗 CD 9 一抗，并在室温下孵育 1 分钟。通过机械搅拌用 30 毫升室温 PBS 洗涤纸质装置，去除所有未结合的抗体。
接下来，将 5 微升辣根过氧化物酶偶联的二抗移液到每张纸上。圆盘并在室温下孵育 1 分钟。通过机械搅拌用 30 ml PBS 洗涤设备，以去除未结合的二抗。
最后，在每张纸上加入 5 微升彩色和公制基材混合物。在室温下孵育反应 20 至 30 分钟，并使用台式扫描仪扫描由此产生的专色强度变化。首先，通过使用剪刀或剃须刀片切掉多余的聚苯乙烯层压板区域，将单个纸盘与散装设备隔离开来。
将每个纸盘放入干净的 1.5 毫升微量离心机中。通过添加 265 μL 裂解缓冲液对捕获的囊泡进行两次裂解。并将 35 微升基于 PVP 的多糖去除载体到每根管中剧烈涡旋。
为确保释放的 RNA 分子完全囊泡、裂解和脱落，向裂解物涡旋中加入 30 μL 匀浆溶液，混合试管并在冰上孵育 10 分钟。接下来，向裂解物中加入 330 μL 酸性酚氯仿混合物，以确保 RNA 与蛋白质和 DNA 正确相特异性分离，每管剧烈涡旋至少 15 秒。全速离心试管 5 分钟。
在室温下，将含有 RNA 的顶部水相转移到新的 1.5 mL 试管中，并丢弃下层有机相。向 RNA 中加入 1.25 水体积的 100% 乙醇，并短暂涡旋混合。然后将混合物涂在市售 RNA 固体提取柱上。
在室温下将试管离心 15 秒，并丢弃流出馏分。加入 700 μL 工作溶液洗涤色谱柱。第一，将试管离心 5 到 10 秒，然后丢弃流出物。
接下来，用 500 μL 工作溶液洗涤色谱柱。第二，将试管离心 5 到 10 秒。丢弃流出液并再次重复洗涤。
在室温下最后旋转 1 分钟，去除所有残留的乙醇，并将干燥的萃取柱转移到新的 1.5 mL 试管中。加入 100 微升预热的不含 R RNA 的水。将试管全速离心 5 到 10 秒，必要时丢弃顶部提取柱。
使用使用荧光标记生物素的商业 RNA 纯化试剂盒浓缩并进一步纯化 RNA EIT。作为 surface Im 动员的报告者。通过比较交联剂改性表面与非功能化纸张表面产生的高荧光，可以看出纸张功能化方案的有效性和特异性。
此外，当报告分子被生物素化的抗 CD 63 抗体取代时，与阴性对照纸底物相比，功能适当的纸底物将促进更高的细胞外囊泡捕获率。当不同的捕获分子固定在纸基材上时，使用纸装置时，细胞外囊泡的不同亚群似乎表现出不同的尺寸分布。还可以检测膀胱内 RNA 含量和囊泡特异性表面蛋白的丰度。
观看此视频后，您应该对如何使用纸质设备分离和满足细胞外 les 的上升有很好的了解。
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概述
本协议详细说明了使用基于纸张的平台从小体积血清样本中分离胞外囊泡（EV）的方法。该方法避免了超速离心，只需几分钟的分析时间。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 胞外囊泡
背景
- 胞外囊泡是细胞释放的小型膜状颗粒。
- 分离EV对于各种生物分析至关重要。
- 传统方法通常需要大体积样本和长时间处理。
- 该方法允许使用有限的血清样本。
研究目的
- 提供一种快速有效的分离EV的方法。
- 使小型生物样本中的EV分析成为可能。
- 促进对分离的EV的进一步表征。
所用方法
- 用圆形纤维素纸切割的聚苯乙烯片层叠。
- 化学结合分子以将EV绑定到纸质测试区域。
- 将生物样本通过移液器吸取到纸质测试区域。
- 使用电子显微镜、ELISA或转录组分析对捕获的EV进行表征。
主要结果
- 可以从仅10 μl的血清中分离出EV。
- 该方法快速且避免了超速离心的需要。
- 可以有效地表征分离的EV。
- 该方法提高了研究中EV分析的可及性。
结论
- 基于纸张的平台是EV分离的可行替代方案。
- 该方法可以显著简化EV研究。
- 未来的研究可以利用这种技术进行各种应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and characterization of extracellular vesicles (EVs) is a critical bottleneck in translational biomarker discovery and early-stage drug development. This paper-based immunoaffinity platform enables rapid, low-volume EV capture and analysis, reducing reliance on ultracentrifugation and large sample inputs. The approach supports scalable, reproducible workflows for EV-based target validation and mechanistic de-risking across discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of EV subpopulations for pathway and target validation.
- Supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant EVs from minimal samples.
- Facilitates rapid hypothesis testing with quantitative EV marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV samples for downstream phenotypic or molecular assays.
- Standardizes EV isolation for reproducible, quantitative readouts in screening workflows.
- Enables scalable assay development with minimal sample and equipment requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with translational biomarker strategies using clinically relevant fluids.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting RNA and protein profiling of EVs.
- Reduces risk of sample loss or degradation, supporting robust preclinical decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
This paper-based EV isolation method integrates from early discovery through preclinical research, enabling rapid sample processing and downstream molecular characterization.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and target de-risking by enabling selective EV capture and analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative EV isolation for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports SEM, ELISA, and transcriptomic readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by isolating EVs from clinically relevant fluids with minimal input.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable across disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with standardized, low-volume, and equipment-light protocols.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient biomarker and target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, reproducible EV analytics across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoaffinity chemistry and EV biology for optimal marker selection.
- Needs access to basic laboratory equipment and analytical tools such as SEM and ELISA readers.
- Demands cross-team standardization of capture molecules and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various biological fluids but may require protocol optimization for different matrices.
- Sample input limitations and marker specificity must be considered for translational applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:18
Fabrication of Paper Devices
4:04
Serum and Aqueous Humor Sample Collection and Processing
5:09
Isolation of Extracellular Vesicles
5:56
Downstream Assay Example 1: Scanning Electron Micoscopy
7:04
Downstream Assay Example 2: Paper-based ELISA
8:04
Downstream Assay Example 3: RNA Isolation
10:26
Results: Characterization of Captured Extracellular Vesicles
11:24
Conclusion
