体内 神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

以下实验的总体目标是通过活体共聚焦视网膜成像，表征慢性青光眼小鼠模型中小胶质细胞的动态变化。该目标通过无创的每月共聚焦眼底镜检查或扫描激光检眼镜（CSLO）实现，以观察视网膜和视神经乳头上的荧光标记小胶质细胞。利用基于阈值的细胞胞体分割及形态学分析对活体图像进行分析，可量化小胶质细胞数量及其活化状态的变化。

结果显示，在活体小鼠中进行每月一次的共焦扫描激光眼底成像（CSLO）可用于监测慢性神经退行性疾病早期进展过程中小胶质细胞密度分布及形态学活化的动力学变化。该技术相较于现有方法（如对表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠脑组织进行双光子共聚焦成像）的主要优势在于，CSLO对视网膜的成像能够实现在完整有机体中直接观察并持续监测衰老相关神经退行性疾病发展全过程中的小胶质细胞。我最初提出该方法的设想，是在我们通过离体实验发现：在可检测到神经退行性病变出现之前的年龄阶段，年轻DBA/2J小鼠视网膜中央区域的小胶质细胞已表现出显著的活化和聚集现象。

为了探究这些在可检测到青光眼之前出现的早期先天免疫变化是否导致了她的神经退行性病变，我们需要建立一种体内方法来追踪小胶质细胞的变化。活体成像操作流程将由本实验室的技术员 Caesar Romero 进行演示。首先，启动 CSLO 系统并输入会话信息。接下来，安全地准备成像操作。

安装一个洁净的55度广角物镜。在给予麻醉剂两分钟后，将小鼠放置于成像平台上，并使用散瞳滴眼液扩大双侧瞳孔。五分钟后，确认小鼠已处于麻醉状态。

接下来，用最小压力将隐形眼镜覆盖每只眼睛。调整小鼠体位，使右眼对准物镜，眼眶与物镜平行。动物无需固定，但需保持与物镜之间的距离恒定。

在接下来的10到15分钟内，将眼睛与设备对齐，小鼠将保持不动且不眨眼，其眼动将由CSLO活体成像系统进行追踪。开始成像前，首先采集眼底的视网膜内层图像。为此。

选择红外模式，该模式对应的激发波长为 820 纳米。然后将激光功率调节至 100%，灵敏度调节至 40% 至 60% 之间。接下来，以高速工作，使用操纵杆调整检眼镜方向，定位眼睛，准备采集视盘及视网膜血管结构的眼底图像。检查角膜和晶状体是否有损伤或混浊。

排除可能存在影响图像采集的缺陷或损伤的眼部。通过将物镜靠近眼部，定位视盘区域，即视神经乳头或ONH的表面，然后将图像中心对准ONH。

正确放置视神经乳头（ONH）是获得图像均匀聚焦和一致成像的关键。下一步是观察视网膜的内层结构以及视神经乳头。作为参考焦平面，可采用位于视网膜玻璃体表面的主要血管，其对应屈光度为59和60，或在视盘凹陷区域更深至55屈光度处。

接下来，使用触摸面板上的旋钮调整图像饱和度，直到视盘周围大部分眼底出现均匀的白色光晕。然后选择较低的饱和度，使光晕均匀，表明该眼睛达到了最佳对比度。如果仍有暗区存在，可能需要重新调整相机位置。

现在，通过实时采集并平均30帧图像来获取中央视网膜的高分辨率眼底图像，以提高信噪比。采集速率为每秒4.7帧，图像立即归一化并保持在同一位置，以便后续采集GFP阳性细胞的荧光图像。在触摸屏面板上切换至荧光成像模式，选择488纳米激光作为激发光源，并设置460至490纳米的滤光片组；将激光功率设为100%，灵敏度设为100%至125%。

现在采集视神经乳头（ONH）的单个XY点二维荧光图像，平均扫描100次。接下来，在ONH周围选择视网膜的多点成像，在控制面板中选择“复合”模式，然后通过检眼镜沿鼻侧至颞侧轴向平移扫描。软件将自动实时平均新扫描的区域，并将其拼接在一起。

如果视网膜区域的图像质量不足以进行平均处理，则用于标识扫描区域的绿色圆圈将变为红色。最终生成的复合图像覆盖范围最大可达1.7毫米×4毫米。在获取复合图像过程中应格外注意操作细节。

在完成扫描平均和图像拼接之前，若过快移动物镜，可能导致高分辨率图像丢失。当麻醉效果开始减弱时，成像过程必须终止，因为小鼠将开始出现明显呼吸，导致成像无法继续进行。首先，利用血管结构和视盘作为解剖标志，对时间序列的视网膜图像进行顺序对齐。

使用常规图像编辑软件，将所有图像对齐，直至其O hs重叠。在拖动过程中，顶部图像将呈现半透明状态。然后依次旋转每个图像，使其主要血管与前一幅图像中的血管结构重叠，并保存该排列方式以供后续参考。

记录每幅图像的校正角度，并将其应用于相应的单个 XY 平面荧光图像。现在，可通过在 Fluor render 中打开配准后的 TIFF 文件，识别定位于中央视网膜的单个 GFP 阳性小胶质细胞。为可视化所有细胞，请用图像填满屏幕，并设置渲染视图为复合正交且插值的模式。

然后定义属性：0.58 伽马值、255 饱和度、255 亮度、195 阿尔法值 1.00 阴影。通过选择 RG 通道为可见来完成设置。在工作区框架中双击隐藏 B 通道，以分割单个细胞。

选择红色通道并进行阈值处理，通过逐步提高低阈值，使大部分细胞被掩膜覆盖且重叠最小，同时排除细胞突起，高阈值保持不变。最后，使用捕获命令保存包含掩膜细胞的文件。随后在光栅图形编辑器中打开该包含掩膜细胞的图像。

将灰度反转以便直接观察，并将分辨率调整为300 DPI或更高。RGB图像以TIF文件格式保存。下一步的活体图像分析针对小胶质细胞，因此需进行分割和形态学分析以识别SATA，用于面积定量。

使用能够基于阈值进行强度测量和对象计数的软件。打开包含已分割细胞的TIFF文件，选择样条重缩放以获得最高分辨率，并将红色通道显示为黑白，以实现更佳的可视化效果。接下来，通过将图像的水平直径定义为1.4至1.7毫米（根据年龄而定）来校准图像，以分割单个细胞。

对红色通道应用强度阈值。在对象计数和账户更新命令下打开阈值强度功能。使用此功能跟踪每个代表个体的兴趣区域阈值的二维参数。

接下来，在强度直方图中定义强度阈值。选择255个灰度级中最低的50%至60%，并进一步优化单个细胞的最终阈值。通过二值化工具栏控件或对象目录，目视评估蓝色阈值色罩与灰色细胞胞体轮廓之间的重叠情况。

手动识别包含多个细胞的胞体感兴趣区域。通过分割这些感兴趣区域来分离各个细胞。在此过程中，使用切换功能，通过面积限制直接可视化观察细胞。

将小胶质细胞分类为激活状态：若其胞体面积大于50至60平方微米；若胞体较小，则将小胶质细胞分类为非激活状态。

最后，通过叠加胞体掩模和单个XY点图像（对比度增加50%），验证该过程并检查每个活化的小胶质细胞的分支复杂性。本研究所描述的方案用于在中央视网膜的大范围内可视化小胶质细胞。在年轻的DBA/2J小鼠（杂合表达CX3CR1-GFP）中，高细胞分辨率结合活体成像、阈值分割及形态计量分析，实现了对单个GFP阳性细胞的自动分割，从而根据面积区分细胞。DBA/2J小鼠模型表现为慢性青光眼，每月进行成像以监测局部微胶质增生和小胶质细胞活化的发展情况，这些观察在可检测到神经退行性变之前各年龄段进行，与单眼神经退行性变进展的变异性一致。该分析揭示了随时间推移视网膜小胶质细胞活化和微胶质增生的变化。

分析还检测到单个视网膜内总小胶质细胞及活化小胶质细胞密度的动态变化。小胶质细胞群体密度的变化与表达GFP的细胞密度变化无关，这与其他研究结果一致。因此，共聚焦扫描激光检眼镜（CSLO）分析可作为早期疾病进展的指标。

在进行该操作时，必须注意仔细优化 GFP 与小胶质细胞荧光图像的饱和度水平，这些图像定位于视网膜内层。共焦扫描激光检眼镜（CSLO）对中央视网膜成像的可重复性，以及在整个中央视网膜区域检测到的细胞细节的一致性，均高度依赖于该步骤的优化。本活体成像方案目前正在本实验室应用，旨在切实探究视网膜及视神经头小胶质细胞的早期变化与 DBA/2J 小鼠及其他慢性视网膜变性模型中青光眼后期进展之间可能存在的关联。该活体成像策略还可能有助于早期发现其他以视网膜和视神经变性为特征的慢性疾病，例如多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病。