Name: 视网膜胶质细胞活化的体内动力学在神经退行性疾病:共聚焦成像眼底及细胞形态计量小鼠青光眼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 了解共聚焦扫描激光眼底镜技术在小鼠青光眼模型中实时监测小胶质细胞活化动态的方法。该技术可非侵入性追踪视网膜神经退行性病变过程中的细胞密度与形态变化，为神经免疫学研究提供重要工具。

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感谢犹他大学科学计算与成像研究所提供 FluoRender 软件（项目编号：R01GM09815）。本研究由青光眼研究基金会、Melsa M. 和 Frank Theodore Barr 基金会以及美国国立卫生研究院资助，资助项目编号分别为 M.L.V. 的 R01EY020878 和 R01EY023621，以及 B.K.A. 的 R01EY017182 和 R01EY017950。

体内成像在无病原体设施中进行，所用方案经犹他大学机构动物护理与使用委员会批准。 
注意：本成像方案用于报告基因小鼠，其中视网膜小胶质细胞和浸润的单核细胞/巨噬细胞在趋化因子受体基因座（CX3CR1）调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。
1. 在体 内 通过共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）对视网膜GFP+小胶质细胞进行成像
<ol>
	<li>开启水控加热系统，设定温度以在操作过程中将小鼠体温稳定在 35–37 ºC，并连接两个加热垫。
	<ol>
		<li>启动共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）系统（图 2A）。打开 cSLO 程序，输入用于识别个体小鼠的信息，并在“患者数据”（Patient Data）菜单中设置角膜曲率为 2 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备成像。将干净的 55º 广角物镜牢固地安装至其接口上。通过在加热垫上覆盖清洁纸张来准备检眼镜成像平台。使用夹子将垫子和纸张压平，防止其阻碍物镜移动。</li>
	<li>使用配有 30½ G 针头的一次性 1 ml 注射器，通过腹腔注射 1.3% 三溴乙醇和 0.8% 叔戊醇（剂量为 250 mg/kg 体重，0.5 ml/25 g 体重）对小鼠进行麻醉。将小鼠放回置于加热垫上的笼子中。 
	注意：与吸入麻醉相比，注射麻醉更便于成像时小鼠的定位，并可避免鼻罩和管路对眼部的遮挡。</li>
	<li>当动物停止活动且对尾部夹捏无反应时，将小鼠置于俯卧位，双眼滴加托吡卡胺和去氧肾上腺素（各 0.5%），持续 7 分钟以诱导瞳孔扩张。</li>
	<li>5 分钟后，将小鼠俯卧放置于检眼镜平台中央，并在双眼上佩戴接触镜片，施加最小压力。 
	注意：接触镜片体积小且易碎，但可小心用手操作，也可使用镊子代替40。使用接触镜片为可选步骤，但建议使用，因其可减少眼部干燥并维持成像期间角膜的透明度。</li>
	<li>7 分钟后，调整小鼠位置，使其右眼朝向物镜，眼眶与物镜平行，并将动物固定于平台边缘附近（图 2B）。为获得饱和度和方向一致的图像，在整个成像过程中需持续保持眼睛与物镜之间的距离，以及眼睛与光路的对齐。剪除干扰眼部观察的长胡须。 
	注意：在接下来的 8–10 分钟内，小鼠不会移动或眨眼，呼吸平稳，cSLO 眼动追踪 ART（自动实时）模式可根据高对比度的视网膜标志物自动调整扫描头位置。超过该时间后，小鼠开始喘息和眨眼，导致成像难以进行。</li>
	<li>若未使用接触镜片进行成像，需每 2–3 分钟向双眼滴加 PBS 液滴，以防眼部干燥。</li>
	<li>采集聚焦于内层视网膜的视网膜血管和视盘的彩色眼底图像。
	<ol>
		<li>选择红外模式（IR），将参数设置为 820 nm 激发波长、100% 激光功率、40–60% 灵敏度（图 2C）。</li>
		<li>在高速模式（12.6 帧/秒）下，使用操纵杆移动检眼镜以定位眼睛。在低倍放大下检查角膜和晶状体是否存在损伤或混浊，并排除存在可能影响视网膜成像的缺陷或损伤的眼睛（图 3A）。</li>
		<li>通过将物镜靠近眼睛以定位视盘区域（视神经乳头，ONH 表面），然后将图像中心对准该区域，并通过拧紧操纵杆锁定位置。此眼睛与检眼镜的对齐方式对于获得图像中均匀的焦距和发射至关重要。</li>
		<li>以位于视网膜玻璃体表面的主要血管作为参考焦平面（59 和 60 D），或在显示视盘凹陷的眼睛中使用更深的焦平面（55 D），观察视网膜内层及 ONH。最佳焦距应能清晰分辨主要血管中循环的血细胞，其管腔和管壁应清晰可辨。</li>
		<li>通过调节触摸屏控制面板上的旋钮优化图像饱和度，使视盘周围大部分 55º 眼底区域呈现均匀照明的白色光晕（轻微过曝）。随后降低饱和度以优化对比度，直至可清晰分辨沿主要血管移动的血细胞。若存在非视网膜损伤引起的局部暗区，需重新调整眼睛与相机的对齐，直至获得亮度均匀的图像。此调整对于获取位置和质量可重复的图像集至关重要。</li>
		<li>采集中央视网膜的高分辨率红外图像（直径 1.4–1.7 mm，取决于年龄），实时平均 30 帧（4.7 帧/秒；归一化），以提高信噪比（图 2D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即采集定位于视网膜内层和 ONH 的 GFP+ 小胶质细胞和/或浸润单核细胞的荧光图像。 
	注意：视网膜红外眼底图像的优化决定了 GFP+ 细胞荧光图像的分辨率以及所覆盖的内层视网膜范围。若未能正确聚焦视网膜内层（可通过血管分辨率差来判断），将导致 GFP+ 细胞图像变暗（图 3B）。若红外饱和度未正确且均匀调整，将影响荧光图像（FA），导致 GFP+ 细胞强度和大小出现伪影变化（图 3C）。
	<ol>
		<li>在触摸屏面板上切换至荧光成像模式（FA），使用蓝色 488 nm 激光激发（460–490 nm 带通滤光片组），采集参数设置为 100% 激光功率和 100–125% 灵敏度，所有小鼠均保持一致（图 2E）。</li>
		<li>采集单个 xy 位置的二维荧光视网膜图像，并立即在相同位置采集眼底图像（100 倍扫描平均；两幅图像均为 55º 扫描角度；图 2F）。</li>
		<li>在控制面板中选择“拼接”（composite）模式，左右移动检眼镜，沿鼻颞轴平移视网膜以采集多点图像（图 2G，图 2H）。 
		注意：在扫描单个 xy 位置图像（100 倍扫描平均）后，软件会自动对相同和新区域的新扫描进行平均（在最佳扫描时以绿色圆圈标出，不可行时为红色），并实时拼接所有 xy 位置。最终拼接图像在水平轴上覆盖 1.5–1.7 mm，垂直轴上覆盖 3–4 mm（55º × 120–124º 扫描角度）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在麻醉诱导后 15 分钟内完成每只小鼠的成像，以避免眨眼和运动恢复。</li>
	<li>取下接触镜片，用 PBS 水化眼睛，并将动物放回温暖的笼子中，观察其行为直至运动功能完全恢复。</li>
	<li>对于同一小鼠进行间歇性 cSLO 成像的纵向研究，重复成像间隔不得少于 3 天，以避免麻醉的累积毒性和角膜刺激。</li>
</ol>
2. 活体图像处理与分析
<ol>
	<li>序列图像配准：
	<ol>
		<li>使用血管结构和视盘作为解剖标志，对同一只眼的时间序列眼底图像进行配准。将所有图像在商业幻灯片演示程序中打开，通过将每幅图像拖动至前一幅图像之上，使它们的视盘在xy-平面上对齐（拖动时顶层图像呈半透明状态），然后旋转顶层图像，使其主要血管与下层图像中的血管结构重叠（重点关注远离视盘的血管）。记录每幅图像的旋转角度，并保存该时间序列以供后续参考，同时记录小鼠编号及眼睛信息。</li>
		<li>利用已记录的角度，通过光栅图形编辑软件对相应的一系列单xy点荧光图像进行x-y平面旋转校正。此外，将分辨率调整为300 dpi（不进行缩放），并在RGB模式下调整背景：选择“色阶”工具，并以血管管腔作为黑色样本。将这些图像另存为TIF文件，并在文件名中添加“aligned”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小胶质细胞分割：
	<ol>
		<li>为识别中央视网膜中的GFP+细胞，在FluoRender中打开对应最早时间点/年龄的“aligned”TIF文件。缩放图像以适配屏幕，然后定义渲染视图（复合、正交、插值）及其属性（0.58伽马值，255饱和度点，255亮度，195透明度，1.00阴影），并选择RG通道可见（在工作区面板中双击B通道以隐藏；图4A）。</li>
		<li>为选择单个细胞，需对红色通道（必须在工作区面板中高亮显示）进行阈值分割：逐步提高低阈值，直至大多数细胞被掩膜（白色）且细胞重叠和突起（青色）最少，同时保持高阈值恒定（255）。低阈值范围通常在100至170之间，具体取决于荧光强度（图4B）。</li>
		<li>仅保留红色通道可见的情况下保存此视图（使用“Capture”命令），另存为新的TIF文件，并在原始文件名后添加“cellsegm”（图4C）。使用通用光栅图形编辑软件将其灰度反转，并如前所述将分辨率调整为300 dpi，再次保存为RGB格式（图4D）。 
		注：删除FluoRender自动创建的文件夹（项目），并保存所用阈值以供后续参考。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小胶质细胞胞体分割与形态测量：
	<ol>
		<li>为定量分析GFP+细胞胞体面积，使用具备自动强度测量和阈值功能，以及基于阈值的对象计数与测量功能的图像分析软件。打开“cellsegm”TIF文件，选择重采样方法（样条插值）和红色通道（点击RGB中的红色标签）。取消勾选“以彩色显示通道”（右键点击RGB红色标签），并选择“反色”（图像/调整图像），以反转灰度，使细胞在白色背景上呈现灰色或黑色，从而改善可视化效果（图4E）。</li>
		<li>根据动物年龄，通过在整幅图像上绘制一条水平线（校准，快速校准），将图像校准至1.4–1.7 mm。</li>
		<li>通过强度阈值法对单个细胞胞体进行分割（图4B）。操作时在RGB红色通道上进行，打开“阈值强度”功能（对象计数；选择“计数更新”命令），以追踪代表单个胞体的每个感兴趣区域（ROI）的二维参数。</li>
		<li>在强度直方图中定义阈值，选择255级中的最低50–60%，并通过目视评估阈值颜色掩膜（蓝色）与单个细胞胞体边缘（灰色）之间的重叠情况，进一步优化最终阈值（图4E）。</li>
		<li>通过在10个细胞中测量分割前后胞体面积，评估胞体掩膜对实际胞体尺寸的准确性；若测量结果差异小于10%，则接受所选阈值范围（使用二值工具栏和标注测量功能）。</li>
		<li>手动识别包含多个细胞的胞体ROI，并使用二值工具栏控件或对象目录将其分离（删除或拆分ROI），同时切换二值图层的显示状态以直接观察细胞（图4F）。</li>
		<li>利用面积限制功能，将小胶质细胞分类为胞体面积大于或小于50–60 µm2的群体，分别代表激活态和非激活态小胶质细胞。 
		注：每个胞体子集以不同伪彩色的二值图层标识，可进一步分析其他形态学参数（如周长、圆形度等），也可在特定视网膜区域中进行定量（图4G）。将分析后的图像保存为ND2文件。</li>
		<li>通过叠加胞体掩膜与单xy点图像（对比度提高50%；图4H），验证单个激活态小胶质细胞的突起及其分支复杂性。手动计数直接从胞体延伸出的突起，或测量包含树突结构的多边形直径（使用二值工具栏和标注测量功能）。 
		注：激活态细胞缺乏突起，或仅有少量（&#60;4条）且短小（&#60;2倍胞体直径）的突起；相比之下，非激活态细胞具有高度分支且广泛的树突结构（&#62;3–10倍胞体直径），环绕相对较小的胞体。</li>
		<li>手动识别胞体面积小于&#60;20 µm2和/或GFP表达低于检测限的细胞，这些细胞因强度阈值法无法检出。使用注释中的“分类”命令对人工识别的细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在神经退行性疾病过程中，对小胶质细胞数量及形态学活化的实时监测需要采用非侵入性成像方法，以实现对细胞特征的精细可视化。成像后，必须对小胶质细胞进行分离（分割），并通过多阈值步骤进行形态计量分析，以胞体大小和/或突起复杂性作为评估小胶质细胞活化的指标。在本方案中，我们描述了使用共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）进行活体成像的方法，以及基于连续的细胞和胞体分割对小胶质细胞活化进行定量分析的技术。我们将这些策略应用于研究在慢性视网膜神经退行性疾病背景下，视网膜小胶质细胞活化及小胶质细胞增生在两个月内的动力学变化。
报告基因小鼠及小胶质细胞/外周单核细胞类型
在趋化因子受体（CX3CR1）基因座控制下表达GFP的小鼠的使用46 可对常驻小胶质细胞进行可靠鉴定，且强健的GFP表达可实现显著的 体内 可视化30-32,34,36此处，我们使用一种通过 C57BL/6.129P 回交获得的 DBA/2J 小鼠亚系。Cx3cr1 tm1Litt/J ...

小胶质细胞是神经免疫细胞，自胚胎早期发育阶段起便特异性地存在于中枢神经系统（CNS）中，并持续终生。小胶质细胞拥有一套复杂的受体系统，其活性及区域异质性受到与邻近神经元、胶质细胞、血脑屏障以及浸润性神经炎症细胞之间双向相互作用的调控。1,2小胶质细胞的基础功能通过监测其所在区域的稳态失衡，参与生理维持与修复过程3,4在中枢神经系统（CNS）损伤或疾病过程中，小胶质细胞是最早响应神经元信号的细胞，随后会转变为一种反应性表型，称为“活化的小胶质细胞”。2,5-7小胶质细胞活化涉及基因和蛋白质表达的复杂循环，这些过程与细胞胞体及突起的尺寸变化和重塑密切相关。6-9小胶质细胞活化，以及细胞的重新分布和聚集，可能伴随局部细胞总数的增加（称为小胶质细胞增生）。这种现象可源于细胞增殖与自我更新，无论是否伴有血液来源单核细胞的募集。3,4,7,10-14在多种与年龄相关的慢性中枢神经系统疾病中，持续的小胶质细胞增生及小胶质细胞活化与疾病进展同步发生15-19小胶质细胞如何影响神经退行性病变的机制尚不明确，主要原因是它们既发挥神经保护作用，又具有有害效应，可能对疾病的发生和发展产生不同的影响。旨在理解慢性中枢神经系统疾病的研究通过活体成像技术，观察了动物模型和人类受损中枢神经系统中小胶质细胞的行为，并证实小胶质细胞的改变在疾病早期阶段即可被检测到。15-17,19,20因此，开发用于检测和监测小胶质细胞活化的方法至关重要。 体内.
利用分子成像或生物发光结合正电子发射断层扫描或磁共振成像，已建立起对脑内小胶质细胞活化区域性变化的无创检测方法，作为神经退行性疾病进展的重要体内指标18,21,22。这些高度定量且无创的分子与核成像技术能够以区域分辨水平检测胶质增生。另一种方法是，在CX3CR1GFP/+小鼠中采用双光子共聚焦成像，可实现以细胞分辨率观察脑内小胶质细胞3,4,9,20,23-28。然而，由于即使是微侵入性的脑成像操作也可能干扰小胶质细胞的行为，该方法在长期、重复观察慢性小胶质细胞改变方面受到限制29。相比之下，视网膜为在完整中枢神经系统微环境中直接、体内可视化并重复监测小胶质细胞提供了理想条件，适用于衰老过程、急性损伤后，以及潜在的慢性神经退行性疾病期间的观察。因此，近期研究已证实，通过将共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）技术用于活体CX3CR1GFP/+小鼠，可实现对表达GFP的视网膜小胶质细胞进行高分辨率成像。该方法已被用于追踪单只小鼠在急性诱导损伤或眼内压升高后长达10周内每周GFP+细胞数量的变化30-36。
我们将该方法进一步拓展，用于持续数月的长期成像，并通过形态计量分析，基于细胞体大小对小胶质细胞活化程度的变化进行定量追踪。在利用双光子共聚焦显微镜对皮层切片进行活体成像的研究中，细胞体大小已被定义为评估小胶质细胞活化状态的有效指标。 体内 CX3CR1-GFP+ 小胶质细胞成像9这些及其他研究还表明，细胞体大小与Iba1蛋白表达水平之间存在相关性，而Iba1蛋白表达水平亦随细胞活化而升高。9,37因此，可以在活体小鼠中识别活化的微胶质细胞，并在中枢神经系统健康和疾病过程中长期监测其数量和分布。
本方案描述了使用共焦扫描激光检眼镜（cSLO）进行活体成像与分析的方法，用于监测视网膜神经节细胞（RGC）变性过程中小胶质细胞的数量、分布及形态学活化状态（图1）。因此，本研究采用以下方法：1）一种遗传性青光眼小鼠模型（DBA/2J），该模型随年龄增长出现视神经和视网膜神经变性，且在5至10月龄期间疾病进展表现出显著个体差异38,39；2）对3-5月龄的杂合子 Cx3cr1GFP/+ DBA/2J 小鼠进行每月一次的cSLO 体内 成像，以实现对视网膜及无髓鞘视神经中GFP+细胞的长期可视化；3）通过图像分割与阈值设定对活体成像结果进行分析，以分离细胞胞体并测量其面积。这些策略被应用于评估慢性青光眼早期阶段视网膜小胶质细胞活化状态的动力学变化。

<table><tbody><tr><td>DBA/2J 和 CX3CR1-GFP/+ 小鼠</td><td>杰克逊实验室，缅因州巴港</td><td>000671 和 00582</td><td>小鼠在本机构内繁育，每 3–4 代引入新的种鼠以防止遗传漂变。</td></tr><tr><td>30&amp;frac12; G 针头和 1 ml 结核菌素滑动接头注射器</td><td>BD，新泽西州东卢瑟福</td><td>305106 和 309659</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇、叔戊醇 99% 和磷酸盐缓冲液片剂</td><td>西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯</td><td>T48402、152463 和 P4417</td><td>阿佛丁溶液（pH 7.3，经无菌过滤）必须新鲜配制，或在 4 &amp;deg;C 下保存不超过 1 周。</td></tr><tr><td>热疗 T/Pump</td><td>Gaymar 工业公司，纽约州果园公园</td><td>TP-650</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>费舍尔科技公司，宾夕法尼亚州匹兹堡</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺</td><td>Bausch &amp; Lomb，纽约州罗切斯特</td><td>NDC 24208-585-64</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 接触镜片，1.70 基弧，总直径 3.2 mm，中心厚度 0.40 mm</td><td>Cantor &amp; Nissel Ltd.，英国北安普敦郡</td><td>G003709</td><td>镜片用无菌 PBS 冲洗，并储存于聚丙烯盒中。</td></tr><tr><td>HRA/Spectralis 共聚焦扫描激光检眼镜及 Eye Explorer 软件</td><td>海德堡工程有限公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>版本 1.7.1.0</td><td></td></tr><tr><td>PowerPoint</td><td>微软公司，华盛顿州雷德蒙德</td><td>版本 14.4.3</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe 公司，加利福尼亚州圣何塞</td><td>版本 CS3</td><td></td></tr><tr><td>FluoRender</td><td>犹他大学科学计算与成像研究所</td><td>版本 2.13</td><td>免费软件。&lt;a href=&quot;http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html&quot; target=&quot;_blank">http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>NIS-Elements C</td><td>尼康公司，纽约州梅尔维尔</td><td>版本 4.30.01</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内驻留的神经免疫细胞，其在CNS受损时会改变形态和大小，转变为具有不同功能和基因表达谱的活化状态。由于小胶质细胞的活化受到微环境变化的动态且复杂的调控，其在健康、损伤和疾病状态下的作用仍未被充分阐明。因此，在完整生物体内无创地长期监测和分析小胶质细胞活化状态的变化至关重要。由于技术上的限制，以往难以在不干扰CNS环境的前提下追踪小胶质细胞的行为，导致对小胶质细胞活化的体内研究进展缓慢。这一挑战在慢性神经退行性疾病中尤为突出，因其需要对长期变化进行持续追踪。视网膜作为可进行无创活体成像的中枢神经系统器官，为观察和表征慢性疾病过程中小胶质细胞活化动态提供了强有力的研究体系。
本方案概述了用于长期 体内 使用共聚焦扫描激光眼底镜（cSLO）和CX3CR1对视网膜小胶质细胞进行成像GFP/+ 报告基因小鼠，以单细胞分辨率可视化小胶质细胞。同时，我们描述了定量分析视网膜中大细胞亚群（每视网膜200–300个细胞）每月细胞活化状态及密度变化的方法。通过应用基于自动阈值的形态测量分析，我们验证了胞体面积作为在视网膜中活体追踪小胶质细胞活化状态的有效指标。 体内 图像。我们利用这些活体成像与分析策略，监测慢性青光眼小鼠模型中视网膜神经退行性变早期阶段小胶质细胞活化及小胶质细胞增生的动态变化。该方法可用于研究小胶质细胞在影响视网膜和视神经的慢性中枢神经系统疾病中对神经元和轴突退变的贡献。

我们近期的体内研究利用这些活体成像与分析方法，对慢性青光眼早期阶段视神经乳头（ONH）及视网膜小胶质细胞变化的动力学特征和模式进行可视化和追踪，并探究其与晚期神经退行性变的关系59。本文展示了采用共焦扫描激光检眼镜（cSLO）的图像采集方案，用于在单个年轻的杂合型Cx3CR1-GFP DBA/2J小鼠视网膜中央区域大范围可视化小胶质细胞（图5）。基于高细胞分辨率，我们采用活体图像阈值分割与形态计量学分析方法，实现对单个GFP阳性细胞及其胞体的自动分割（图6）。
为了监测在该慢性青光眼模型中，早于可检测到神经退行性变的年龄段出现的局部小胶质细胞增生和/或小胶质细胞活化情况，我们每月测量了3至5月龄年轻杂合子Cx3CR1-GFP DBA/2J小鼠视网膜中总小胶质细胞密度的变化（n = 10）（图7A）。与个体眼睛中神经退行性变进展的变异性一致41-44，我们的分析显示，在每个年龄阶段，不同眼睛之间的视网膜小...

小胶质细胞活化和小胶质细胞增生是慢性神经退行性变的关键反应。本文介绍了相关方法 体内通过共聚焦眼底成像技术对视网膜CX3CR1-GFP+小胶质细胞进行长期可视化观察，并利用阈值和形态计量学分析方法识别和量化其活化状态。我们监测在年龄相关性青光眼早期阶段小胶质细胞的动态变化。

小胶质细胞是中枢神经系统驻留的神经免疫细胞，可在中枢神经系统损伤后改变其形态和大小，转变为具有……的活化状态。

以下实验的总体目标是通过活体共聚焦视网膜成像，表征慢性青光眼小鼠模型中小胶质细胞的动态变化。该目标通过无创的每月共聚焦眼底镜检查或扫描激光检眼镜（CSLO）实现，以观察视网膜和视神经乳头上的荧光标记小胶质细胞。利用基于阈值的细胞胞体分割及形态学分析对活体图像进行分析，可量化小胶质细胞数量及其活化状态的变化。结果显示，在活体小鼠中进行每月一次的共焦扫描激光眼底成像（CSLO）可用于监测慢性神经退行性疾病早期进展过程中小胶质细胞密度分布及形态学活化的动力学变化。该技术相较于现有方法（如对表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠脑组织进行双光子共聚焦成像）的主要优势在于，CSLO对视网膜的成像能够实现在完整有机体中直接观察并持续监测衰老相关神经退行性疾病发展全过程中的小胶质细胞。我最初提出该方法的设想，是在我们通过离体实验发现：在可检测到神经退行性病变出现之前的年龄阶段，年轻DBA/2J小鼠视网膜中央区域的小胶质细胞已表现出显著的活化和聚集现象。为了探究这些在可检测到青光眼之前出现的早期先天免疫变化是否导致了她的神经退行性病变，我们需要建立一种体内方法来追踪小胶质细胞的变化。活体成像操作流程将由本实验室的技术员 Caesar Romero 进行演示。首先，启动 CSLO 系统并输入会话信息。接下来，安全地准备成像操作。安装一个洁净的55度广角物镜。在给予麻醉剂两分钟后，将小鼠放置于成像平台上，并使用散瞳滴眼液扩大双侧瞳孔。五分钟后，确认小鼠已处于麻醉状态。接下来，用最小压力将隐形眼镜覆盖每只眼睛。调整小鼠体位，使右眼对准物镜，眼眶与物镜平行。动物无需固定，但需保持与物镜之间的距离恒定。在接下来的10到15分钟内，将眼睛与设备对齐，小鼠将保持不动且不眨眼，其眼动将由CSLO活体成像系统进行追踪。开始成像前，首先采集眼底的视网膜内层图像。为此。选择红外模式，该模式对应的激发波长为 820 纳米。然后将激光功率调节至 100%，灵敏度调节至 40% 至 60% 之间。接下来，以高速工作，使用操纵杆调整检眼镜方向，定位眼睛，准备采集视盘及视网膜血管结构的眼底图像。检查角膜和晶状体是否有损伤或混浊。排除可能存在影响图像采集的缺陷或损伤的眼部。通过将物镜靠近眼部，定位视盘区域，即视神经乳头或ONH的表面，然后将图像中心对准ONH。正确放置视神经乳头（ONH）是获得图像均匀聚焦和一致成像的关键。下一步是观察视网膜的内层结构以及视神经乳头。作为参考焦平面，可采用位于视网膜玻璃体表面的主要血管，其对应屈光度为59和60，或在视盘凹陷区域更深至55屈光度处。接下来，使用触摸面板上的旋钮调整图像饱和度，直到视盘周围大部分眼底出现均匀的白色光晕。然后选择较低的饱和度，使光晕均匀，表明该眼睛达到了最佳对比度。如果仍有暗区存在，可能需要重新调整相机位置。现在，通过实时采集并平均30帧图像来获取中央视网膜的高分辨率眼底图像，以提高信噪比。采集速率为每秒4.7帧，图像立即归一化并保持在同一位置，以便后续采集GFP阳性细胞的荧光图像。在触摸屏面板上切换至荧光成像模式，选择488纳米激光作为激发光源，并设置460至490纳米的滤光片组；将激光功率设为100%，灵敏度设为100%至125%。现在采集视神经乳头（ONH）的单个XY点二维荧光图像，平均扫描100次。接下来，在ONH周围选择视网膜的多点成像，在控制面板中选择“复合”模式，然后通过检眼镜沿鼻侧至颞侧轴向平移扫描。软件将自动实时平均新扫描的区域，并将其拼接在一起。如果视网膜区域的图像质量不足以进行平均处理，则用于标识扫描区域的绿色圆圈将变为红色。最终生成的复合图像覆盖范围最大可达1.7毫米×4毫米。在获取复合图像过程中应格外注意操作细节。在完成扫描平均和图像拼接之前，若过快移动物镜，可能导致高分辨率图像丢失。当麻醉效果开始减弱时，成像过程必须终止，因为小鼠将开始出现明显呼吸，导致成像无法继续进行。首先，利用血管结构和视盘作为解剖标志，对时间序列的视网膜图像进行顺序对齐。使用常规图像编辑软件，将所有图像对齐，直至其O hs重叠。在拖动过程中，顶部图像将呈现半透明状态。然后依次旋转每个图像，使其主要血管与前一幅图像中的血管结构重叠，并保存该排列方式以供后续参考。记录每幅图像的校正角度，并将其应用于相应的单个 XY 平面荧光图像。现在，可通过在 Fluor render 中打开配准后的 TIFF 文件，识别定位于中央视网膜的单个 GFP 阳性小胶质细胞。为可视化所有细胞，请用图像填满屏幕，并设置渲染视图为复合正交且插值的模式。然后定义属性：0.58 伽马值、255 饱和度、255 亮度、195 阿尔法值 1.00 阴影。通过选择 RG 通道为可见来完成设置。在工作区框架中双击隐藏 B 通道，以分割单个细胞。选择红色通道并进行阈值处理，通过逐步提高低阈值，使大部分细胞被掩膜覆盖且重叠最小，同时排除细胞突起，高阈值保持不变。最后，使用捕获命令保存包含掩膜细胞的文件。随后在光栅图形编辑器中打开该包含掩膜细胞的图像。将灰度反转以便直接观察，并将分辨率调整为300 DPI或更高。RGB图像以TIF文件格式保存。下一步的活体图像分析针对小胶质细胞，因此需进行分割和形态学分析以识别SATA，用于面积定量。使用能够基于阈值进行强度测量和对象计数的软件。打开包含已分割细胞的TIFF文件，选择样条重缩放以获得最高分辨率，并将红色通道显示为黑白，以实现更佳的可视化效果。接下来，通过将图像的水平直径定义为1.4至1.7毫米（根据年龄而定）来校准图像，以分割单个细胞。对红色通道应用强度阈值。在对象计数和账户更新命令下打开阈值强度功能。使用此功能跟踪每个代表个体的兴趣区域阈值的二维参数。接下来，在强度直方图中定义强度阈值。选择255个灰度级中最低的50%至60%，并进一步优化单个细胞的最终阈值。通过二值化工具栏控件或对象目录，目视评估蓝色阈值色罩与灰色细胞胞体轮廓之间的重叠情况。手动识别包含多个细胞的胞体感兴趣区域。通过分割这些感兴趣区域来分离各个细胞。在此过程中，使用切换功能，通过面积限制直接可视化观察细胞。将小胶质细胞分类为激活状态：若其胞体面积大于50至60平方微米；若胞体较小，则将小胶质细胞分类为非激活状态。最后，通过叠加胞体掩模和单个XY点图像（对比度增加50%），验证该过程并检查每个活化的小胶质细胞的分支复杂性。本研究所描述的方案用于在中央视网膜的大范围内可视化小胶质细胞。在年轻的DBA/2J小鼠（杂合表达CX3CR1-GFP）中，高细胞分辨率结合活体成像、阈值分割及形态计量分析，实现了对单个GFP阳性细胞的自动分割，从而根据面积区分细胞。DBA/2J小鼠模型表现为慢性青光眼，每月进行成像以监测局部微胶质增生和小胶质细胞活化的发展情况，这些观察在可检测到神经退行性变之前各年龄段进行，与单眼神经退行性变进展的变异性一致。该分析揭示了随时间推移视网膜小胶质细胞活化和微胶质增生的变化。分析还检测到单个视网膜内总小胶质细胞及活化小胶质细胞密度的动态变化。小胶质细胞群体密度的变化与表达GFP的细胞密度变化无关，这与其他研究结果一致。因此，共聚焦扫描激光检眼镜（CSLO）分析可作为早期疾病进展的指标。在进行该操作时，必须注意仔细优化 GFP 与小胶质细胞荧光图像的饱和度水平，这些图像定位于视网膜内层。共焦扫描激光检眼镜（CSLO）对中央视网膜成像的可重复性，以及在整个中央视网膜区域检测到的细胞细节的一致性，均高度依赖于该步骤的优化。本活体成像方案目前正在本实验室应用，旨在切实探究视网膜及视神经头小胶质细胞的早期变化与 DBA/2J 小鼠及其他慢性视网膜变性模型中青光眼后期进展之间可能存在的关联。该活体成像策略还可能有助于早期发现其他以视网膜和视神经变性为特征的慢性疾病，例如多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病。

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视网膜胶质细胞活化的体内动力学在神经退行性疾病：共聚焦成像眼底及细胞形态计量小鼠青光眼

来源： Bosco, A., et al. 神经退行性疾病中视网膜小胶质细胞活化的体内动态：小鼠青光眼中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量. J. Vis. Exp. (2015)...

在青光眼小鼠模型中对视网膜小胶质细胞的活体成像

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

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本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo...

体内小鼠视神经纤维完整性的对比增强MRI成像

本文介绍一种在小鼠眼球中诱导眼压升高的实验方案，该过程可导致视网膜神经节细胞丢失，类似于青光眼中所观察到的现象。将磁性微珠注射至前房，并利用磁铁将其吸引至虹膜角膜角，以阻塞房水的流出通道。...

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本方案描述了如何利用眼科成像平台系统，在小鼠等小型啮齿类动物中应用谱域光学相干断层扫描和扫描激光检眼镜等高分辨率成像技术，分别获取视网膜厚度和小胶质细胞分布的信息。...

体内成像携带 Cx3cr1gfp/gfp 报告基因小鼠的谱域光学相干断层扫描与扫描激光检眼镜技术

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本方案概述了用于校准的步骤 体内 可见光光学相干断层扫描光纤成像（vis-OCTF）图像 离体 同一小鼠视网膜的共聚焦图像，用于验证所观察到的视网膜神经节细胞轴突束形态 体内 图像...

可见光光学相干断层扫描光纤图像与同一小鼠视网膜共聚焦图像的配准

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。...

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位...

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

了解共聚焦扫描激光眼底镜技术在小鼠青光眼模型中实时监测小胶质细胞活化动态的方法。该技术可非侵入性追踪视网膜神经退行性病变过程中的细胞密度与形态变化，为神经免疫学研究提供重要工具。

体内神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

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