从成年大鼠和人类脊髓室管膜下区分离神经干细胞/前体细胞

本实验的总体目标是从成年大鼠或人脊髓的室管膜下区分离神经干细胞。首先通过椎板切除术获取脊髓，实现这一目标。第二步是将脊髓横向切成每段一厘米的节段，并从每个脊髓节段中解剖出室管膜下区。

接下来，将剪碎的组织切成1毫米大小的组织块，然后进行酶解消化。最后一步是通过不连续密度梯度离心分离出完整的细胞，并将细胞悬液接种培养。最终，可通过免疫荧光显微镜评估神经球的形成及神经干细胞的生长情况。

今天我将演示如何从成年大鼠脊髓的室管膜下区分离神经干细胞。这些细胞可用于回答神经干细胞研究领域中的关键问题，例如哪些外源性因子促进谱系限制，或这些细胞如何响应各种刺激或应激。首先，按照随附的文字版实验方案配制培养基、培养液和解剖缓冲液。

接下来，在麻醉过量后，对大鼠皮肤进行消毒，并使用大型解剖剪剪除背部表面皮肤，暴露脊柱。将解剖剪垂直于背部表面并横向放置，在后肢上方切断脊柱。

然后使用较小的剪刀，从暴露的尾端开始，沿脊柱上方的背侧肌肉向头侧方向做纵向切开，以暴露棘突。将小型钝性骨剪经口外插入脊髓与脊柱之间的椎管侧方间隙内。将刀片浅置，并与脊髓平行。

然后在椎板上做小切口，并小心剥离椎板以暴露脊髓。此角度可避免损伤下方的脊髓。继续向头侧方向去除椎板。

使用钝性组织镊子暴露胸段和颈段脊髓，轻轻将脊髓从椎骨上提起，并用显微剪刀切断神经根。为释放脊髓，将切除的脊髓组织置于含有冰冻无菌大鼠解剖缓冲液的培养皿中。用冰冻的解剖缓冲液冲洗组织，并用剪刀将脊髓横向切成每段1厘米的节段。对于每个组织节段，用精细镊子用一只手固定组织，另一只手持显微剪刀，仔细去除白质及大部分灰质，仅保留脊髓的室管膜周围区域。

将解剖得到的室管膜周围组织移入含有冰冷大鼠解剖缓冲液的10厘米无菌培养皿中。开始分离大鼠神经干细胞时，使用显微剪将室管膜周围组织剪碎成约1立方毫米大小的组织块。接下来，准备酶解消化缓冲液：首先从木瓜蛋白酶解离试剂盒中取出一支木瓜蛋白酶，加入5毫升Earl's平衡盐溶液。

将小瓶置于 37 摄氏度下 10 分钟，使木瓜蛋白酶完全溶解，溶液呈澄清状态。接着，向解离试剂盒中的 DNA 小瓶加入 500 微升 Earle's 平衡盐溶液。轻轻混匀后，取 250 微升 DNA 溶液加入含有木瓜蛋白酶的小瓶中，轻轻混匀。

接下来，将约 0.2 克的剪碎组织加入离心管中，将离心管置于 37 摄氏度的摇床上振荡 45 分钟至 1 小时。孵育后，用 10 毫升移液管反复吹打混合物，以解离任何残留的组织块，得到浑浊的细胞悬液。将细胞悬液转移至无菌的 15 毫升锥形管中，在 300 ×g 离心 5 分钟。

在室温下离心过程中，通过将 2.7 毫升 Earle's 平衡盐溶液与 300 微升重悬的白蛋白 OVO MOID 抑制剂溶液混合，制备 OVO moid 溶液。在 15 毫升锥形管中，加入 150 微升先前制备的 DNA 溶液至卵形 moid 溶液中，通过反复倒置试管混匀；弃去细胞沉淀的上清液，并立即用稀释的 DNA-白蛋白抑制剂混合液重悬细胞沉淀。接下来，通过向 15 毫升试管中加入 5 毫升白蛋白抑制剂溶液，再使用 5 毫升移液器将细胞悬液缓慢而轻柔地叠加在白蛋白抑制剂溶液上方，制备不连续密度梯度。

在室温下以 70 ×g 离心样品 6 分钟。离心结束后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升预热的大鼠 EFH 培养基中，该培养基的配制方法见随附的文字版实验方案。使用血细胞计数板计数活细胞密度，并以每微升 10 个细胞的密度将细胞接种至 T25 培养瓶中，培养基为 EFH。

将锥形瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育，并让培养物静置生长一周，以避免球体聚集。图中所示为大鼠脊髓的横切面，经Luxol快蓝以及血atin和伊红染色，以显示白质与灰质的边界。虚线轮廓标示了在此方案中从该区域分离出的解剖后残留的室管膜周围组织。

如图所示的神经球将在高倍镜下以悬浮培养的方式自由漂浮生长。可见微小突起从神经球表面伸出。通过KI 67阳性染色可观察到神经球具有增殖能力，图中显示神经球经解离后接种于基质胶包被的孔板中。此外，它们主要表达巢蛋白（nestin），这是神经前体细胞的标志物。

通过该操作步骤，可向培养的细胞中添加外源性因子以促进其分化。此外，成体神经干细胞或其子代细胞也可移植到多种动物模型中，以评估其再生修复能力。希望本视频对您有所帮助，祝您的实验顺利成功。