Name: 同心凝胶系统来研究基质微环境的三维细胞迁移的生物物理作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学习同心凝胶系统研究三维细胞迁移的方法，通过内外层胶原蛋白凝胶构建生理相关环境，定量分析细胞在基质微环境中的生物物理行为变化。该方法有助于深入理解细胞动力学机制。

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作者感谢 W. Sun 和 K. Jansen 提出的宝贵讨论意见，并感谢新加坡国立大学纳米生物力学实验室提供的支持。N.A.K. 感谢玛丽·居里国际研修基金（Marie Curie IIF Fellowship）提供的资助。

1. 细胞收获
<ol>
	<li>从 37 °C、5% CO2 培养箱中取出 MD-MBA-231 细胞。使用 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液从组织培养板上消化细胞。对于 T25 培养瓶中的细胞，使用 1 ml 胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>将细胞在 15 ml 圆锥形离心管中以 200 × g 离心 4 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 ml 培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞密度 ρ。 
	注意：为制备接种细胞的内层凝胶，后续需将细胞悬液稀释 10 倍以达到最终的细胞接种密度。因此，需要制备 10 倍浓缩的细胞悬液。</li>
	<li>计算获得 10 倍细胞浓度所需的培养基体积： 
	<img alt="培养基制备体积计算公式；图示包含密度和浓度变量的公式。" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"> 
	注意：MD-MBA-231 细胞的推荐最终细胞接种密度 cfinal 约为 2 × 106 个细胞/ml，本实验方案中采用此值。其他细胞类型可探索不同的接种密度。</li>
	<li>再次将细胞在 15 ml 圆锥形离心管中以 200 × g 离心 4 分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>将细胞充分重悬于所需体积的无血清细胞培养基中（即步骤 1.3 中计算的 Vmedium），以最大程度减少细胞团块形成。 
	注意：酚红具有自发荧光，可能干扰荧光/反射成像。为获得最佳图像质量，可考虑使用不含酚红的培养基。</li>
</ol>
2. 胶原蛋白溶液的制备
<ol>
	<li>取用储存的胶原蛋白溶液、10× PBS 缓冲液、Milli-Q H2O、0.1 M NaOH 以及若干微量离心管。将所有试剂置于冰上，以防止胶原蛋白提前聚合，并保持无菌状态。</li>
	<li>将无菌的玻璃底培养皿置于 37 °C 培养箱中预热，以达到平衡。 
	注意：本方案中的所有体积均针对直径为 12 mm 的玻璃底培养皿进行了优化。若使用其他类型的培养皿，请相应调整体积。</li>
	<li>根据胶原蛋白储存液的浓度，计算配制内层凝胶（溶液 I）所需的体积，以制备 50 µl 浓度为 2.4 mg/ml 的胶原蛋白溶液。 
	注意：内层凝胶也可使用其他浓度的胶原蛋白溶液。</li>
	<li>在无菌环境（通常为生物安全柜）中，将 5 µl 的 10× PBS 缓冲液缓慢加入步骤 2.3 中计算出的胶原蛋白储存液体积中，并轻轻混匀。注意避免产生气泡。</li>
	<li>使用校准过的 pH 计，以 0.1 M NaOH 调节混合液的 pH 至 7.4。作为粗略参考，大约使用 5 µl 即可将 pH 调至接近 7.4（具体用量因储存液浓度和初始 pH 而异）。 
	注意：此步骤涉及的体积过小，无法使用标准 pH 计直接测量。可采用以下方法之一：
	<ol>
		<li>为多个样品同时配制胶原蛋白溶液。使用标准 pH 计对总体积进行 pH 调节，然后将溶液分装至各样品中。</li>
		<li>或者，配制较大体积的胶原蛋白溶液（i.e.，体积足以使用标准 pH 计），调节其 pH 至目标值，记录所需 NaOH 体积，再按比例缩小体积，并在实验中使用相应量的 NaOH。使用石蕊试纸确认最终 pH 值。</li>
		<li>否则，可使用微型 pH 电极更精确地调节小体积溶液的 pH。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 H2O 将溶液补足至 45 µl。所有操作均需在冰上进行，以防止胶原蛋白提前聚合。</li>
</ol>
3. 同心凝胶培养物的形成
<ol>
	<li>从培养箱中取出预热的玻璃底培养皿（见步骤 2.2）。</li>
	<li>向溶液 I 中加入 5 µl 的 10 倍浓缩细胞悬液（在步骤 1.5 中制备）。充分重悬，注意避免产生气泡。此时混合物体积为 50 µl，含有终浓度的胶原蛋白（2.4 mg/ml）和细胞密度（cfinal = 2 × 106 个细胞/ml）。</li>
	<li>将 20 µl 含细胞的溶液 I 缓慢加至孔中央，使其形成圆顶状液滴（图 1A）。此步骤需注意避免产生气泡。若出现气泡，应迅速而轻柔地用移液枪头刺破或吸出。随后将培养皿轻轻放回培养箱，使内层凝胶聚合 45 分钟。</li>
	<li>在内层凝胶聚合结束前约 15 分钟，开始制备溶液 O（用于外层无细胞胶原凝胶）。 
	注意：外层凝胶的胶原浓度和聚合 pH 可根据需要调整，以获得具有不同微结构的网络10。本方案中，重点采用在 pH 7.4 条件下聚合的 1.5 – 4.0 mg/ml 胶原凝胶。
	<ol>
		<li>根据胶原原液浓度，计算制备 200 µl 终浓度胶原溶液 O 所需的体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 20 µl 的 10× PBS 缓冲液缓慢加入步骤 3.4 计算出的胶原原液体积中，并轻轻涡旋混匀。使用校准过的 pH 计，以 0.1 M NaOH 调节混合液 pH 至目标值。有关 pH 调节的细节，请参见步骤 2.5 的注释。</li>
	<li>用 H2O 将溶液补足至终体积 200 µl。所有操作均需在冰上进行，以防止胶原过早聚合。</li>
	<li>在内层凝胶聚合 45 分钟后（见步骤 3.3），从培养箱中取出培养皿。将 180 µl 溶液 O 轻柔地加至内层凝胶上方，确保溶液完全覆盖内层凝胶并填满孔内空间（图 1B）。
	<ol>
		<li>此步骤应小心操作，避免搅动溶液，否则可能导致外层凝胶纤维排列不均。注意勿用移液枪头触碰内层凝胶，避免产生气泡或空气 pockets。若出现气泡，应迅速而轻柔地用移液枪头刺破或吸出。随后将培养皿轻轻放回培养箱，使外层凝胶聚合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外层凝胶聚合 45 分钟后，从培养箱中取出培养皿。此时凝胶应已基本固化，但若操作粗暴仍可能从底部脱离。
	<ol>
		<li>轻柔地向培养皿中加入 2 ml 预热的细胞培养基（图 1C），确保凝胶完全浸没于培养基中。在整个培养期间，每 2 – 3 天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 活细胞成像
<ol>
	<li>使用配备长期活细胞成像功能的倒置共聚焦显微镜进行成像。显微镜需内置带有温度（37 °C）和 CO2（5%）控制的培养室。在实验开始前至少1小时开启显微镜，并预热载物台。 
	注意：使用长工作距离的物镜，以优化在三维凝胶中对细胞的观察和定位。</li>
	<li>将凝胶置于含有5 µl荧光细胞示踪染料的培养基中孵育30分钟，以便在三维系统中准确标记细胞位置。随后用1× PBS洗涤三次，去除未结合的染料。之后向培养皿中加入细胞培养基。</li>
	<li>从培养箱中取出培养皿，放置于显微镜载物台上（图1D）。 
	注意：原则上，外层凝胶聚合完成后即可开始活细胞成像。然而此时内层凝胶中的细胞尚未充分铺展。若需观察最早侵入外层凝胶的细胞迁移行为，可在培养开始后24小时（根据细胞类型而定）启动活细胞成像。作为大致参考，内层凝胶中大多数细胞进入外层凝胶通常需要约12至14天的培养时间。</li>
	<li>在外层凝胶中围绕内层凝胶的区域选择成像体积（VoV）。
	<ol>
		<li>所选VoV应包括紧邻凝胶界面的区域、中间区域以及靠近外层凝胶边缘的区域7。为避免边缘效应，应排除距离凝胶底部、侧壁以及顶部表面50 µm以内的区域。每个VoV的典型尺寸为647 × 647 × 100 µm3（分别对应x、y和z方向），z轴堆栈间隔为5 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保正确选择成像模式、通道/滤光片、曝光时间和图像分辨率。在进行延时活细胞成像的同时，利用共聚焦反射光显微镜对胶原网络进行无标记成像。</li>
	<li>拍摄样本图像，绘制强度直方图，并调整增益和偏移，以确保信号充足且不发生饱和，使直方图范围介于零与最大强度之间。在整个实验过程中不得再更改这些设置。</li>
	<li>对选定的VoV进行延时成像，时间间隔Δt为10分钟，持续8小时（或根据需要更长时间）。</li>
</ol>
5. 细胞追踪与数据分析
<ol>
	<li>使用适当的图像处理软件对 z-堆栈图像进行定量图像后期处理。
	<ol>
		<li>对延时图像进行分割，以自动选择三维细胞位置（x、y、z、t）。</li>
		<li>对每一帧手动检查定位准确性，去除因细胞碎片或细胞突起被误识别为细胞而产生的假阳性信号。从分析中剔除增殖的细胞，并将重叠或连接的细胞拆分为独立的对象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据上一步获得的细胞坐标（x、y、z、t），通过连接时间序列中每个细胞的位置生成三维延时细胞轨迹。</li>
	<li>通过剔除短于设定阈值长度（通常为 20 分钟）的轨迹，消除随机噪声和系统噪声。</li>
	<li>如有必要，通过从轨迹中减去整体净位移来校正样品漂移。</li>
	<li>根据观察到的细胞轨迹计算细胞位移 <img alt="Δd=|dn⃗−d0⃗|; 向量距离公式; 代数方程; 数学概念" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq2.jpg" width="80" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"> 和细胞迁移距离 <img alt="距离计算公式, Σ 公式, 向量运算, 数学概念" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 3">，其中 是表示细胞在时间 点三维位置的向量， 是总时间点数。
	<ol>
		<li>计算细胞速度：S = d/(n • Δt)，其中 Δt 为帧间时间间隔。使用 P = Δd/d 计算细胞迁移方向性（或持续性）。该简单的持续性度量表明，当 P = 0 时，净位移为零；当 P = 1 时，轨迹为一条直线方向性路径。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本方案中，我们描述了一种 体外 用于研究细胞在拓扑结构类似细胞外基质的基质环境中三维迁移行为的实验方法 体内与目前其他可用方法相比，本实验方法主要有三大优势。首先，该方法可同时在群体水平和单个细胞水平上研究细胞迁移机制，从而为研究集体细胞迁移提供了可能13，迄今为止主要局限于二维检测方法14，同时观察群体中单个细胞的行为。对于那些不会自然成群或成簇迁移的细胞，该检测方法提供了一种途径，可从大量处于不同局部微环境中的细胞中详细分析其迁移特性，从而有助于深入理解迁移效率和方向持久性的生物物理起源。7,15.
其次，通过调整内层和外层凝胶的凝胶条件，可直接研究基质力学性能和微观结构对三维细胞迁移行为的影响10这一点尤为重要，因为已知细胞迁移和癌症侵袭受到基质力学特性和孔隙率的显著影响。16,17，以及我们体内的软组织具有极为多样的拓扑结构18此外，该方法可轻松适用于胶原以外的其他基质。这一优势在于，并非所有细胞系都能在基...

细胞迁移在多种生理反应（如胚胎发育、止血和免疫反应）以及病理过程（如血管疾病、炎症和癌症）中均发挥着关键作用1因此，解析细胞迁移背后的生化与生物物理因素，不仅对于理解细胞功能的基本原理至关重要，而且对推动组织工程、抗转移及抗炎药物开发等各类生物医学应用具有重要意义。由于 体内 观察在技术上具有挑战性，因此大量研究工作集中于 体外 细胞迁移的重现
体外研究细胞迁移的方法主要是为在二维（2D）表面进行的实验设计的，其中最著名的是划痕或伤口愈合实验2。这类实验具有操作简便、易于进行活细胞成像的优点，并可为理解细胞迁移背后的多种生化机制提供有价值的见解。然而，这些实验未能考虑细胞外基质（ECM）的结构及其重塑过程，而这些因素在理解体内细胞迁移时至关重要。近年来，人们越来越认识到，三维（3D）培养模型（通常基于胶原基质3）能够更好地模拟体内环境。事实上，细胞在3D环境中的迁移行为与在2D表面上显著不同，这主要归因于环境维度的差异4。此外，基质的生物物理和力学特性对细胞迁移具有敏感性影响5，包括在肿瘤细胞侵袭过程中的作用6。
在此，我们介绍一种用于研究细胞在细胞外基质（ECM）中三维迁移行为的方法，该基质的生物物理特性可通过制备条件便捷地调节。细胞被接种于“内层凝胶”中，随后可从中逃逸并侵入原本无细胞的“外层凝胶”。该方法基于细胞识别外层凝胶中无细胞区域的能力及其向该区域迁移的倾向，这一过程与细胞的力学感知能力密切相关。7在本研究中，我们采用胶原网络作为高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭的细胞外基质（ECM）。内外层凝胶的力学性能和微结构均可调节。8 并进行表征9 以实现生理相关的条件。细胞轨迹的重建与分析可对群体水平和单个细胞水平上的时空迁移行为进行详细的定量研究。重要的是，该同心凝胶系统的构建模拟了 体内 迁移细胞（尤其是侵袭性癌细胞）所面临的组织拓扑结构，从而为细胞迁移和转移的物理机制提供重要见解。

<table><tbody><tr><td>细胞培养箱</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>型号: 371, 序列号 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>配备培养室的倒置共聚焦激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>荧光细胞示踪染料 CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>直径35 mm的培养皿，带直径12 mm的玻璃底孔</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01（改进型Neubauer）</td><td></td></tr><tr><td>微处理器pH计</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen胶原蛋白</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>酸溶性I型牛胶原蛋白（储存液pH ~ 2）</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC，工作距离 8.2-6.9 mm，数值孔径 0.45</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Sartorius</td><td>序列号 29153352</td><td>基础型pH计 PB-11</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

细胞迁移能力在生命过程中多种细胞功能中至关重要&#160;从胚胎发育到伤口愈合&#160;肿瘤和癌症转移。尽管已有大量研究，但细胞迁移的基本生化与生物物理原理仍未被完全阐明，尤其是在具有生理相关性的三维（3D）微环境中。本文描述了一种 体外 一种用于定量研究细胞三维迁移行为的检测方法。该方法利用细胞的力学感知能力及其向先前未占据的细胞外基质（ECM）迁移的倾向性。我们以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 在胶原凝胶中的侵袭作为模型系统。通过活细胞成像技术，可对培养数周过程中细胞群体的扩散以及单个细胞的迁移动态进行监测，并分析获得具有时空分辨率的数据。此外，该方法可轻松适配于多种不同的细胞外基质，因而为研究微环境中生物物理因素对细胞迁移的影响提供了一种简便而强大的手段。

本文以高侵袭性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 为例，采用 2.4 mg/ml 的内层胶原凝胶和每毫升 2 × 106 个细胞的接种密度，进行了同心凝胶实验。如图2所示，通常在培养数天后，细胞突破内层与外层凝胶的界面，开始侵入外层凝胶，细胞群体主要呈放射状向外扩散。
可以通过改变外层凝胶的聚合条件，研究基质密度和机械特性对细胞迁移行为的影响。图3展示了在pH 7.4条件下聚合的1.5 mg/ml、2.4 mg/ml和4.0 mg/ml胶原蛋白外层凝胶中单个细胞的运动情况。在内层与外层凝胶交界处，连续8小时采集共聚焦延时图像，三种不同胶原浓度下细胞的位移以白色箭头标示。根据细胞接种密度和增殖速率，通常每个样品中可提取并分析约200条单个细胞的运动轨迹。
我们定量分析了细胞在3种不同胶原蛋白浓度下的运动轨迹，分析指标包括8小时成像期间的平均净位移、迁移距离、方向持续性和平均速度（图4）。结果显示，在4.0 m...

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外 描述了一种在生物物理特性可变的环境中，于群体和单个细胞水平上研究细胞迁移时空行为的方法。

细胞迁移能力在生命过程中多种细胞功能中至关重要，从胚胎发育和伤口愈合到……

本实验的总体目标是研究细胞在三维生理相关环境中的迁移特性。首先将细胞接种于内层胶原凝胶中，然后将其包埋于具有特定基质特性的无细胞外层胶原凝胶中以实现该目标。随后，允许细胞侵袭并迁移至外层凝胶，在此过程中可对细胞进行实时监测和定量分析。最终，这种同心凝胶实验用于展示细胞迁移行为如何受到细胞外基质生物物理特性的影响。与现有的转移实验或划痕实验等方法相比，该技术的主要优势在于，细胞迁移发生在一个生理相关性较高的三维环境中，且该环境的结构和生物物理特性非常易于控制。该方法的可视化演示至关重要，因为浓缩内层凝胶系统的形成过程十分精细。良好的凝胶界面对于本实验的成功至关重要，但有时可能较难实现。首先准备处于80%融合度、可从T25培养瓶中收获的MDA-MB-231细胞培养物。每瓶加入1毫升胰蛋白酶溶液处理细胞。然后以200 × g的离心力离心4分钟收集细胞沉淀，弃去上清液，并将细胞重悬于5 mL培养基中。现在使用血细胞计数板测定细胞密度，并确定每毫升含1亿个细胞所需的体积。然后以200 × g离心4分钟沉淀细胞。弃去上清液，并将沉淀物充分重悬于所需体积的无血清培养基中。此悬浮液的浓度为最终接种浓度的10倍。开始实验前，将所需的储备溶液收集于冰桶中，包括10倍浓度的PBS、无菌水和0.1摩尔的氢氧化钠。在生物安全柜中将数个微量离心管预冷，保持无菌操作技术，分装所需量的胶原蛋白，用于制备50微升浓度为2.4毫克/毫升的内层凝胶溶液。然后向量取的胶原蛋白中缓慢加入5微升10×PBS。加入PBS时轻轻涡旋混匀管内液体，但避免产生气泡。接下来，用碱性溶液将混合物的 pH 值调节至 7.4。通常加入五微升即可达到效果。文本方案中提供了故障排除指南。最后，用无血清培养基将体积补至45微升，预留空间用于加入10倍浓度的细胞悬液。首先，向胶原溶液中加入5微升10倍浓度的细胞悬液，并充分重悬细胞，确保溶液中无气泡产生。接着，向预热的玻璃底培养板中央加入20微升该悬液。若形成气泡，应迅速将其戳破或吸走，避免造成混乱，使凝胶形成圆顶状液滴。浇铸凝胶时务必注意方法，尤其对于胶原蛋白等高黏性溶液而言，操作尤为困难。应尽可能避免产生气泡，且在溶液即将聚合时切勿搅动，因为溶胀可能导致纤维出现人为的取向排列。将培养皿放回培养箱中孵育45分钟，使内层在孵育结束前聚合15分钟。在冰上准备200微升外层胶原蛋白凝胶溶液。首先，分装所需体积的胶原蛋白储备液。其次，缓慢加入 20 微升 10 倍浓度 PBS，轻轻旋转混匀。然后如前所述将 pH 值调节至 7.4，并用 Milli-Q 水将溶液体积补至 200 微升。现在从培养箱中取出培养皿，将 180 微升外层凝胶溶液轻轻加至内层凝胶圆顶的上方。应完全覆盖内层溶液并填满小孔。不要搅拌溶液，避免触碰内层凝胶溶液。若在注入外层溶液时产生气泡，需迅速刺破气泡或将气泡吸回移液枪中。另一个重要步骤是确保获得合适的凝胶界面。此步骤的关键在于加入外层凝胶溶液。当内层凝胶尚未凝固时。凝胶化动力学可能随聚合条件而变化，因此必须事先优化该条件。为使外层凝胶聚合，将培养皿放回培养箱中孵育45分钟。45分钟后，凝胶应已较为坚固，但仍需小心操作；加入2毫升预热的培养基，完全浸没凝胶。至此完成同心凝胶培养，每隔两到三天更换新鲜培养基。数天内，细胞将开始迁移到外层基质中。为观察其迁移情况，使用荧光示踪剂对细胞进行染色。将两毫升培养基替换为含有五微升染料的新鲜培养基，孵育30分钟。孵育结束后，用一毫升磷酸盐缓冲液（PB S）洗涤培养物3次，每次洗涤2至3分钟。洗涤完成后，向培养皿中重新加入正常培养基。然后将培养皿置于环境可控的显微镜上。接着使用设定的体积参数，扫描凝胶界面附近的外层凝胶区域。通常采用647微米见方、100微米厚的视野进行扫描，Z轴堆栈间隔为5微米。然后扫描凝胶的中间区域，最后扫描凝胶的边缘区域。排除距离底部、顶部或侧面表面50微米以内的区域，以避免受到边缘效应影响的细胞。要分析从收集的数据中得到的细胞运动情况，首先在图像分析软件（如imas）中打开图像文件。首先选择命令“surpass”，然后选择命令“surface”。这将弹出跟踪表面的选项。随着时间推移，在数据集中选择感兴趣的区域，即笛卡尔坐标和时间范围。接下来，从目标区域中减去背景。为避免细胞在背景消除过程中丢失，请选择能够完全拟合到对象内部的最大球体。随后，通过设定种子点直径来分离相连的对象，并对所有种子点进行分类。下一步是手动对表面进行分类。将指向同一对象的种子点进行分组。在感兴趣区域内的所有时间点之间执行此操作。最后，在完成追踪后对目标进行追踪，对目标轨迹进行分类，然后输出定量数据集，以便使用电子表格进行分析。经过数天的同心凝胶培养后，细胞突破了内层与外层凝胶的界面，并开始侵入外层凝胶。细胞群体主要沿径向向外扩散。比较了细胞在不同胶原蛋白密度的外层凝胶中的运动情况。成像持续八小时，从每个样本中计算出约200条细胞轨迹。在最稀疏基质中的细胞移动距离最短。该计算考虑了所有细胞，而不仅仅是径向向外迁移的细胞。在所有情况下，细胞移动的总距离均大于其净位移。按照预期，持续性被计算为位移与移动距离之间的比值。0.4 的持续性值表明这些细胞具有较弱的内在定向迁移能力。平均速度计算显示，胶原蛋白密度并未影响细胞的迁移速度。基质孔径大小与胶原蛋白密度呈负相关关系，可能对迁移速度产生相反的影响，从而相互抵消。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建同心凝胶系统，以及如何在三维环境中研究细胞的迁移过程。通过该实验流程，您还可开展其他多种后续实验，例如细胞提取、微阵列分析等，以进一步探究细胞迁移过程中特定蛋白质在不同时间点的表达水平等问题。

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科研

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Bioengineering

生物工程

同心凝胶系统来研究基质微环境的三维细胞迁移的生物物理作用

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。...

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

本文介绍了一种可对胶原蛋白进行荧光标记的方法，该方法可用于3D细胞培养物的固定后成像和活细胞成像。我们还提供了一种优化的实验方案，用于可视化在3D环境中培养的细胞内源性细胞骨架蛋白。...

揭示三维环境中侵袭性癌细胞的细胞骨架组织

本文描述了一种在二维受限微环境中定量研究细胞自发迁移的方法。该方法利用微加工通道，可在单次实验中于不同条件下研究大量细胞的迁移行为。...

微加工通道中细胞迁移的研究

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。...

三维胶原基质中细胞迁移的分析

细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。...

用于在三维胶原基质中研究趋化性的平面梯度扩散系统

以下方案描述了用于构建三明治样培养物的步骤，该培养物可作为二维（2D）与三维（3D）细胞环境之间的中间阶段。这种人工构建的系统可应用于显微镜观察、生物力学、生物化学以及细胞生物学检测。...

三明治样微环境用于调控细胞/材料相互作用

胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的核心组分，为从细胞迁移、分化到增殖等多种细胞过程提供关键信号。本文提供了一种将细胞包埋于三维胶原蛋白水凝胶中的实验方案，以及一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道生成随机或定向排列胶原基质的进阶技术。...

用于研究三维相互作用的3D胶原凝胶与微通道的制备 在体 内

本实验方案的目的是评估促迁移和抗迁移因子对细胞在三维纤维蛋白基质中迁移的影响。...

在三维环境中表征细胞迁移 体外 伤口环境

本文介绍了一种用于定量评估细胞在颗粒状水凝胶内部及其界面处三维迁移的实验方案。...

量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

学习同心凝胶系统研究三维细胞迁移的方法，通过内外层胶原蛋白凝胶构建生理相关环境，定量分析细胞在基质微环境中的生物物理行为变化。该方法有助于深入理解细胞动力学机制。

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

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