用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

本实验的总体目标是研究细胞在三维生理相关环境中的迁移特性。该目标通过以下步骤实现：首先将细胞接种于内层胶原凝胶中，然后将其包埋于具有特定基质特性的无细胞外层胶原凝胶中。随后，允许细胞向外层凝胶中侵袭并迁移，在此过程中可对细胞进行实时监测和定量分析。

最终，这种同心凝胶实验用于展示细胞迁移行为如何受到细胞外基质生物物理特性的影响。与现有的转移实验或划痕实验等方法相比，该技术的主要优势在于，细胞迁移发生在一个生理相关性较高的三维环境中，且该环境的结构和生物物理特性非常易于控制。该方法的可视化演示至关重要，因为同心内层凝胶系统的形成过程十分精细。

良好的凝胶界面对于本实验的成功至关重要，而有时要达到理想的界面可能会有一定挑战。首先准备处于 T-25 培养瓶中、汇合度达 80% 的 MD-MBA-231 细胞培养物，准备收获。先用每瓶 1 毫升的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化。

然后以200 × g的离心力离心四分钟收集细胞沉淀，弃去上清液，并将细胞重悬于五毫升培养基中。现在使用血细胞计数板测定细胞密度，并确定每毫升含一亿个细胞所需的体积。然后以200 × g离心力离心四分钟沉淀细胞。

移除上清液，并将沉淀物充分重悬于所需体积的无血清培养基中。此悬液的浓度为最终铺板浓度的10倍。开始前，将所需的储存液收集于冰桶中，包括10× PBS、无菌水和0.1 M氢氧化钠。

在生物安全柜中将数个微量离心管预冷，保持无菌操作技术，分装所需量的胶原蛋白，用于制备50微升浓度为2.4毫克/毫升的内层凝胶溶液。然后向量取的胶原蛋白中缓慢加入5微升10倍浓度的PBS（10× PBS）。在加入PBS时轻轻涡旋混匀管内液体，但避免产生气泡。

接下来，用碱性溶液将混合物的 pH 值调节至 7.4。通常加入五微升即可完成。文本方案中提供了故障排除指南。

最后，用无血清培养基将体积补至45微升，预留空间用于加入10倍浓度的细胞悬液。首先，向胶原溶液中加入5微升10倍浓度的细胞悬液，并充分重悬细胞，确保溶液中无气泡产生。接着，向预热的玻璃底培养板中央加入20微升该悬液。

当形成圆顶状液滴时，若迅速产生气泡，应立即刺破或吸除，避免造成混乱。浇铸凝胶时务必注意方法，尤其对于胶原蛋白等高黏性溶液，操作尤为困难。应尽可能避免产生气泡，且在溶液即将聚合时切勿搅动，因为溶胀可能导致纤维出现人为的定向排列。

将培养皿放回培养箱中孵育45分钟，使内层在孵育结束前聚合15分钟。在冰上准备200微升外层胶原凝胶溶液。首先，分装所需体积的胶原储备液。

第二步，缓慢加入20 µL的10× PBS，轻轻涡旋混匀。然后同前法调节pH至7.4，并用Milli-Q水将溶液定容至200 µL。现在从培养箱中取出培养皿，将180 µL外层凝胶溶液轻轻加至内层凝胶圆顶的上方。

应完全覆盖内层溶液并填满小孔。不要搅拌溶液，避免触碰内层凝胶溶液。若在注入外层溶液时产生气泡，需迅速刺破气泡或将气泡吸回移液枪中。

另一个重要步骤是确保获得合适的凝胶界面。此步骤的关键在于加入外层凝胶溶液。当内层凝胶尚未凝固时。

凝胶化动力学可能随聚合条件而变化，因此必须事先优化该条件。为使外层凝胶聚合，将培养皿放回培养箱中孵育45分钟。45分钟后，凝胶应已较为坚固，但仍需小心操作；加入2毫升预热的培养基，完全浸没凝胶。至此完成同心凝胶培养，每2至3天更换新鲜培养基。

数天内，细胞将开始迁移至外层基质中。为观察其迁移情况，使用荧光示踪剂对细胞进行染色。将两毫升培养基替换为含有五微升染料的新鲜培养基，孵育30分钟。孵育结束后，用一毫升磷酸盐缓冲液（PB S）洗涤培养物3次，每次洗涤2至3分钟。洗涤完成后，向培养皿中重新加入正常培养基。

然后将培养皿置于环境可控的显微镜上。接着使用设定的体积扫描模式，对凝胶界面附近的外层凝胶区域进行扫描。通常采用647微米见方、100微米厚的视野，以5微米的Z轴步长进行扫描。

然后扫描凝胶的中间区域，最后扫描凝胶的边缘区域。排除距离底部、顶部或侧面表面50微米以内的区域，以避免受到边缘效应影响的细胞。为了分析从收集的数据中得到的细胞运动，首先在图像分析软件（如imas）中打开图像文件。

首先选择命令 surpass，然后选择命令 surface。这将弹出跟踪表面的选项。随着时间推移，在数据集中选择感兴趣的区域，即笛卡尔坐标和时间范围。

接下来，从感兴趣区域中减去背景。为避免细胞在背景消除过程中丢失，请选择能够完全拟合到对象内部的最大球体。随后，通过设定种子点直径来分离相连的对象，并对所有种子点进行分类。

下一步是手动对表面进行分类。将指向同一对象的种子点进行分组。在感兴趣区域内的所有时间点之间执行此操作。

最后，在完成追踪后对目标进行追踪，对目标轨迹进行分类，然后输出定量数据集，以便使用电子表格进行分析。经过数天的同心凝胶培养后，细胞突破了内层与外层凝胶的界面，并开始侵入外层凝胶。细胞群体主要沿径向向外扩散。

比较了细胞在不同胶原蛋白密度的外层凝胶中的运动情况。成像持续八小时，每个样本计算出约200条细胞轨迹。在最稀薄基质中的细胞移动距离最短。

该计算考虑了所有细胞，而不仅仅是径向向外迁移的细胞。在所有情况下，细胞移动的总距离均大于其净位移。按照预期，持续性被计算为位移与移动距离之间的比值。

0.4 的持续性值表明这些细胞具有较弱的内在定向迁移能力。平均速度计算结果显示，胶原蛋白密度并未影响细胞的迁移速度。基质孔径大小与胶原蛋白密度呈负相关关系，可能对迁移速度产生相反的影响，从而相互抵消。

观看本视频后，您应能充分理解如何构建同心凝胶系统，以及如何在三维环境中研究细胞的迁移过程。在此实验流程基础上，您还可开展其他多种后续实验，例如细胞提取、微阵列分析等，以进一步探究细胞迁移过程中特定蛋白质在不同时间点的表达水平等问题。