在机械拉伸活细胞成像
2015年8月19日
使用定制的电机驱动机械致动器开发了一种新的成像方案，以允许测量活细胞对机械应变的实时响应。与机械生物学相关，该系统可以施加高达 20% 的应变，同时允许使用共聚焦或原子力显微镜进行近乎实时的成像。
以下实验的总体目标是近乎实时地观察机械应变对细胞力学生物学的作用。这是通过首先构建一个具有柔性膜的系统来实现的，细胞在其上生长和拉伸。作为第二步，拉伸膜以校准具有膜应变的电机计数。
接下来，拉伸小鼠肺上皮细胞并对细胞核进行成像。为了显示膜应变传递到细胞，然后将担架整合到 A FM 中进行纳米压痕，以测量拉伸前后单个细胞的刚度。结果显示，由于施加的拉伸，细胞会受到直接损伤。
同样基于荧光成像，活性氧的产生显示随着拉伸而增加。嗯，这种方法可以回答肺力学生物学领域的关键问题，例如机械通气是否会损伤上皮细胞。这种方法可以提供对肺细胞、机械生物学的见解，也可以应用于其他软组织，如肝脏或生长板切片。
一般来说，刚接触这种方法的人会因为这些实验中使用的非常规工具组合（例如原子力显微镜）而感到困难。首先，按照随附的文本方案中所述，准备经修饰的胶原蛋白包被的 PDMS 膜以用于细胞培养。接下来，以每孔 250 万个细胞的密度将小鼠肺上皮细胞接种到无菌、柔性胶原蛋白包被的膜上。
将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育两天，直到细胞达到融合。然后使用 1.5 毫米的活检打孔器在六个夹片中的每个夹片上打两个孔，如果不需要预紧力，则距离结构中心 20.5 毫米。并去除细胞培养基。
确保机械致动器处于零应变位置，并将膜放置在拉伸器上，使打孔与销和夹具对齐。将顶部夹具放到位，然后交替交替不同侧面一次拧紧一颗螺丝。在将设备放在显微镜载物台上之前，添加 1 毫升细胞培养基。
将设备置于光路的中心。接下来，将设备固定到舞台上。通过使用目标输入块中显微镜的载物台控制器调整机械设备的平面内和垂直位置来聚焦在膜上。
输入电机计数值，该值对应于要施加的所需应变水平。接下来，将速度输入块中的值设置为 10 RPM 或更低，以观察拉伸前后的相同场，因为场可能会相对于显微镜物镜发生偏移，并且可能需要在拉伸期间调整显微镜载物台。一切就绪后，单击 go。
首先对原子力显微镜进行调整。将 FM 头的高度增加到 Z 方向的最大位置。然后在支腿上放置延长杆，以抬起 FM 悬臂接触样品的平面。
接下来，从显微镜中取出 A FM 扫描仪板和所需的物镜。在物镜上添加垫片，然后将其重新安装回显微镜上。然后将扫描仪板放回 A FM 上。垫片的高度将取决于物镜和特定的 FM 设置，但如果需要光学成像，则必须使用垫片，因为观察计划将沿 Z 方向移动。
接下来，启动 A FM 软件、光学显微镜软件和所有必要的光源，包括用于荧光测量的光源。安装一个刚度为每纳米 200 皮牛顿或更低的悬臂梁芯片，用于测量 A FM 上活细胞的弹性模量。然后对准激光器，然后将玻璃盖玻片安装在设备上，并根据制造商的建议使用它来校准悬臂刚度。在将膜安装到拉伸装置之前，将壁切割成约 1 毫米高。
这减少了膜壁和称重传感器之间的干扰。然后取出细胞培养基并将膜安装在机械装置上。使用软件将带有适配器的机械设备放在扫描仪上。
在纳米压痕之前将膜拉伸至所需的拉伸应变水平。在细胞上添加 0.5 毫升或更少的培养基以保持细胞水分，但也要注意避免溢出，这可能会损坏 FM 扫描仪或显微镜。然后将悬臂梁与膜接合。
按照特定 A FM 设备的协议扫描感兴趣的区域。当对接种在膜上的细胞施加 20% 的菌株时，细胞置换 20%，如此处所示，使用累积线粒体超氧化物传感器在支气管上皮细胞中测量细胞对活性氧产生的影响，如随附的文本方案中所述。在没有机械拉伸的情况下，当应用并保持单个 17% 拉伸时，ROS 的产生在 60 分钟内没有显着增加。
线粒体 ROS 增加，随着机械拉伸器掺入原子力显微镜，线粒体 ROS 又持续了 60 分钟。从此处概述的区域获得 10% 拉伸应变前后小鼠肺上皮细胞的弹性模量、图谱。在 40 x 40 微米的区域上记录了 300 条单独的强迫挠度曲线，显示随着应变的施加，高模量区域的定位发生了变化。
一旦掌握，细胞拉伸可以在 15 分钟内完成。虽然 FM 纳米压痕可能需要两个小时才能正常执行在尝试此程序时，重要的是要记住小心而迅速地处理细胞，因为在报告数据之前，结果可能会受到搅动和长时间室内空气暴露的不利影响。不要忘记，与 FM 合作可能极具挑战性。
执行此过程时，必须采取预防措施，例如使所有液体远离扫描仪。
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概述
本研究提出了一种新颖的成像协议，能够实时观察活细胞中的机械应变响应。利用自定义电机驱动的机械执行器，该系统施加高达20%的应变，同时促进使用共聚焦或原子力显微镜进行近实时成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 力学生物学
- 细胞成像
- 活细胞力学
背景
- 了解机械应变对细胞的影响对力学生物学至关重要。
- 实时成像技术增强了对细胞响应的研究。
- 机械应变可以影响细胞行为和完整性。
- 以前的方法缺乏有效测量实时响应的能力。
研究目的
- 在近实时观察机械应变对细胞力学生物学的作用。
- 开发一个系统，允许校准施加在细胞上的应变。
- 测量机械拉伸前后细胞的刚度。
使用的方法
- 构建一个具有灵活膜的系统用于细胞生长和拉伸。
- 用膜应变校准电机计数。
- 拉伸小鼠肺上皮细胞并成像细胞核。
- 将拉伸器整合到原子力显微镜中进行纳米压入。
主要结果
- 由于施加的机械拉伸，观察到细胞直接受损。
- 实时成像提供了对细胞应变响应的洞察。
- 开发的系统有效地将膜应变传递到细胞。
- 刚度测量显示了机械拉伸前后细胞性质的变化。
结论
- 这种新颖的成像协议允许详细研究力学生物学响应。
- 实时观察增强了对细胞在应变下力学的理解。
- 这种方法可以应用于进一步研究各种情况下的细胞响应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Real-time live cell imaging during mechanical stretch enables direct observation of mechanobiological responses, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This approach provides actionable insights into cellular injury mechanisms relevant to respiratory and soft tissue disease models, informing risk-adjusted portfolio decisions. Integration of confocal and atomic force microscopy (AFM) with mechanical actuation advances the precision and reproducibility of mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular responses to mechanical strain, clarifying mechanistic pathways.
- Supports functional target validation by quantifying changes in cell stiffness and reactive oxygen species (ROS) production.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant targets for further development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live cell systems for downstream screening of mechanobiology-modulating compounds.
- Standardizes quantitative outputs such as elastic modulus and ROS levels for reproducible assay development.
- Enables reliable evaluation of compound effects under physiologically relevant mechanical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical injury models with disease-relevant endpoints for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement of injury phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular damage and stress responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies by enabling real-time, quantitative assessment of cellular responses to mechanical stimuli.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanotransduction and injury pathways in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Provides high-content measurements of cell stiffness and ROS production for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant injury mechanisms in lung and other soft tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple tissue types and mechanobiology research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing early mechanistic insights.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, AFM operation, and mechanical actuation systems.
- Demands specialized instrumentation including confocal microscopy and AFM with compatible actuators.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible strain calibration and data acquisition.
- Adaptable to various cell and tissue models with protocol modifications for substrate and actuator compatibility.
- Careful handling and rapid execution are critical to minimize artifacts from cell agitation or environmental exposure.
