活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

以下实验的总体目标是近实时观察机械应变对细胞力学生物学作用的影响。首先构建一个带有柔性膜的系统，在该膜上培养细胞并施加拉伸；第二步通过拉伸膜来校准电机计数与膜应变之间的关系。

接下来，对小鼠肺上皮细胞进行拉伸并成像细胞核。为了证明膜上的应变能够传递到细胞，将拉伸装置整合到原子力显微镜（AFM）中，用于在拉伸前后对单个细胞进行纳米压痕以测量其刚度。结果显示，施加的拉伸对细胞造成了直接损伤。

同样基于荧光成像，活性氧的产生随着拉伸而增加。该方法能够回答肺部力学生物学领域中的关键问题，例如上皮细胞在机械通气过程中是否可能受到损伤。该方法可为肺细胞的力学生物学研究提供见解，并且也可应用于其他软组织，如肝脏或生长板切片。

通常，由于本实验方法采用了原子力显微镜等非常规组合工具，初学者可能会遇到困难。首先，按照随附的文字实验方案，制备用于细胞培养的胶原蛋白包被的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。随后，将250万个鼠肺上皮细胞接种至无菌的、柔性的胶原蛋白包被膜上，每孔接种量为250万个细胞。

将细胞在 37 摄氏度和 5%CO2 条件下孵育两天，直至细胞达到汇合状态。若无需预加张力，则使用 1.5 毫米活检打孔器在每个六角夹具标签上打两个孔，孔位距离构建物中心 20.5 毫米。然后移除细胞培养基。

确保机械致动器处于零应变位置，并将膜放置在拉伸装置上，使冲孔与销钉和夹具对齐。安装上部夹具，然后依次逐个拧紧螺丝，交替拧紧不同侧的螺丝。在将装置放置于显微镜载物台前，加入1 mL细胞培养基。

将装置置于光路中心，随后将其固定在载物台上。在目标输入模块中，通过显微镜的载物台控制器调节机械装置的平面内和垂直位置，对膜进行聚焦。

输入一个电机计数值，该值对应于要施加的期望应变水平。接下来，将速度输入框中的值设置为10 RPM或更低，以便在拉伸前后观察同一视野，因为视野相对于显微镜物镜可能会发生偏移，且在拉伸过程中可能需要调整显微镜载物台。一切设置完毕后，点击“开始”。

首先对原子力显微镜进行调整。将原子力显微镜探头在Z方向的高度升至最大位置。然后在支脚上安装延长杆，以抬高原子力悬臂与样品接触的平面。

接下来，从显微镜上取下A FM扫描仪平板和所需物镜。在物镜上添加一个垫片，然后将其重新安装到显微镜上。随后将扫描仪平板放回A FM上。垫片的高度取决于物镜类型和具体的A FM装置，但如果需要进行光学成像，则必须使用垫片，因为观察平面将在Z方向上发生位移。

接下来，启动原子力显微镜（AFM）软件、光学显微镜软件以及所有必要的光源，包括用于荧光测量的光源。将一个带有悬臂梁的芯片安装到原子力显微镜（AFM）上，该悬臂梁的刚度应为200皮牛顿每纳米（pN/nm）或更低，用于测量活细胞的弹性模量。然后调整激光位置，接着将一块玻璃盖玻片安装到装置上，并根据制造商的建议用其校准悬臂梁的刚度。在将膜安装到拉伸装置之前，立即将其壁部切割至约1毫米高。

这可以减少膜壁与负荷传感器之间的相互干扰。然后移除细胞培养基，并将膜安装到机械装置上。使用软件将装有适配器的机械装置放置在扫描仪上。

在进行纳米压痕之前，将膜拉伸至所需的拉伸应变水平。向细胞中加入0.5毫升或更少的培养基以保持其湿润，但需注意避免溢出，以防损坏原子力显微镜扫描仪或显微镜。然后使悬臂梁与膜接触。

按照特定原子力显微镜（AFM）设备的操作规程扫描感兴趣区域。当对种植在膜上的细胞施加20%的应变时，细胞发生20%的位移，如图所示。使用累积型线粒体超氧化物传感器检测支气管上皮细胞中活性氧（ROS）的生成情况，具体方法见随附的文字版实验方案。在未施加机械拉伸的情况下，活性氧的生成在60分钟内未出现显著增加；当施加单次17%拉伸并维持该状态时，活性氧生成亦未显著上升。

将机械拉伸装置整合到原子力显微镜后，线粒体活性氧（ROS）水平升高，并持续长达60分钟。从小鼠肺上皮细胞在施加10%拉伸应变前后所划定的区域获得了弹性模量图。在40×40微米的区域内记录了300条独立的强制偏转曲线，显示施加应变后高模量区域的定位发生了变化。

一旦掌握，细胞拉伸实验可在15分钟内完成。相比之下，进行一次完整的荧光显微镜纳米压痕（FM nano indentation）可能需要耗时两个小时。在实施该操作时，务必注意以谨慎而迅速的手法处理细胞，因为在数据记录之前，剧烈震荡或长时间暴露于室温空气中均可能对实验结果产生不利影响。请勿忘记，使用荧光显微镜（FM）操作可能极具挑战性。

进行此操作时，必须采取预防措施，例如将所有液体远离扫描仪。