Name: 与气孔导度，以叶功能性状 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 了解植物叶片气孔导度与形态性状的关联方法，通过显微测量和统计分析提取气孔调控参数。该方案为功能生物多样性研究提供了将易测叶片性状与生态系统功能相联系的技术框架。

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感谢杨雪飞、Sabine Both、Lin Chen 和 Kaitian Wang 为协调野外工作以及建立 BEF-China 实验所做出的贡献。我们还感谢整个 BEF-China 研究团队提供的全面支持。BEF-China 主要由德国研究基金会（DFG FOR 891/1 和 2）资助，本项目的专项经费由德国研究基金会提供给 H.B.（DFG BR 1698/9-2）。此外，我们感谢由北京中德科学中心资助的旅行基金和暑期学校项目（GZ 524、592、698、699 和 785）。同时，我们还要感谢 David Eichenberg、Michael Staab、Katja Grotius、Silvana Tornack、Lin Chen 和 Shouren Zhang 在野外和实验室工作中提供的支持。

1. 气孔导度
<ol>
	<li>气孔导度的测量 
	注意：作者使用了一种简单的稳态式气孔计（Decagon SC1）。该气孔计具有体积小、操作直观、可靠性高的优点。在野外测量气孔导度时，应尽量缩短重复测量循环中各测定个体之间的距离，以实现最高的测量效率。</li>
	<li>根据可重复的模式选择不同物种和个体的叶片（相同高度、相同光照条件、植株内相同位置，尽可能仅来自同一节位，且仅限一种类型：阳生叶或阴生叶）， 等等。).
	<ol>
		<li>仅测量健康、无损伤且完全展开的叶片。在个体上标记待测叶片（例如， 使用扎带或彩色胶带标记，以确保重复测量在同一片叶片上进行。 
		注意：测量气孔导度时，应仅在叶片表面进行，避免中脉和明显的叶脉。</li>
		<li>在日出前的清晨开始测量，重复测定5到10次，直至中午时分气孔导度值明显下降。 
		注意：每日连续测量可获得用于分析VPD与气孔导度之间关系的良好数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vpd 测量
	<ol>
		<li>每次给药S 测量，建议使用便携式记录仪记录温度和相对湿度，以直接测量同一叶片位置的环境条件。计算水汽压差时，采用August-Roche Magnus公式15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="饱和蒸气压方程，es(T)=6.1094^(17.625T/T+243.04)，公式分析。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">
es=饱和水蒸气压 [hPa]
T=温度 [°C]
<ol start="4">
	<li>建立气孔导度（gS）对水汽压差（vpd）响应的模型
	<ol>
		<li>将每个物种的所有 gS 数据按物种分别对 vpd 作图，将单个叶片的所有日变化过程数据合并，每个物种进行一次统一分析。通过查找气孔导度数据中的最大值，提取观测到的最大值。为了使模型具有物种间的可比性，将观测值除以该物种观测到的最大值（gS/gSMAX）进行标准化。</li>
		<li>对每个物种，使用具有二项误差分布的广义线性模型，将 gS（gS/gSMAX）的 logit 值对 vpd 及其二次项进行回归分析（其中 a、b 和 c 代表回归参数）：</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="气孔导度模型方程，ln(gs/gmax)=a vpd²+b vpd+c，数学分析。" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 2">
<img alt="气孔导度与蒸气压差关系图；数据模型分析，植物生理学研究。" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. gS - vpd 的实测值与拟合模型示例。 气孔导度作为蒸气压差的函数，针对物种 Liquidambar formosana 绘制。空心圆点表示观测值。(A) 从绝对（未标准化）气孔导度（gS）数据中提取最大气孔导度、达到最大气孔导度时的蒸气压差以及平均气孔导度。(B) 标准化气孔导度数据（gS/gSMAX）被用于提取相对参数（以实心圆点表示）20。经许可重印自20。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="气孔导度与蒸气压差关系图；生理过程分析；数据趋势。" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 所有物种的拟合模型。 所有物种的气孔导度数据对蒸气压差（vpd）回归的模型图。常绿物种以黑色线条表示，落叶物种以红色线条表示20。经许可转载自20。
注意：使用logits而非直接将gS对vpd进行回归，可确保模型模拟的最大值不超过gSMAX，并在高vpd条件下使gS趋近于0。
<ol start="5">
	<li>提取每个物种的气孔调节参数
	<ol>
		<li>计算建模得到的绝对 gSMAX 值（即 图 1B 中的 MaxFit）。具体方法为：将 1.4.2 节公式的一阶导数设为零，求得气孔导度最大时对应的水汽压亏缺（vpd），即 vpdgsMaxFit = -b/2a。将该 vpdgsMaxFit 值代入 1.4.2 节的公式，并对结果取自然指数 e 的幂，得到 MaxFit。然后计算每个物种所有导度测量值的平均值（见 图 1A）。 
		注：使用统计软件 R（http://www.r-project.org）进行计算。</li>
		<li>为计算相对值，从标准化模型（gS/gSMAX）中提取以下两个点的气孔导度和 vpd 值：（1）模型峰值处的气孔导度和 vpd（MaxFit）；（2）曲线上第二个拐点处的 vpd 值（见 图 1B）。将这些值乘以 gSMAX，得到这两个点对应的绝对 gS 值。所有 39 个分析物种的单个模型完整叠加结果见 图 2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 气孔性状的测量
<ol>
	<li>尽可能从用于气孔导度测量的同一叶片上取样。如果无法做到，则采用与选择气孔导度测量叶片时相同的筛选方法，最好在相同的个体上进行。</li>
	<li>在新鲜样品上涂抹一层无色、快干的指甲油（可测试不同品牌，部分品牌比其他品牌更适用）。若样品无法立即处理，应将其保存在70%酒精中。待指甲油完全干燥后，轻轻将印模从叶片上剥离，并按常规叶片样品的处理方法进行显微分析。   
	注意：对于毛状体密度较高的叶片，可先使用氢氧化钠或乙酸与过氧化氢的1:1溶液处理，以获得更佳效果。</li>
	<li>光学显微镜分析
	<ol>
		<li>将相机连接至光学显微镜，该显微镜应具备40X至400X的放大倍数。相机连接显微镜后，需将所拍摄图像与显微镜的光学放大倍数及图像分辨率相对应。 例如， 借助天平。</li>
		<li>使用开源图像处理软件（如 ImageJ） 16 分析这些图片。
		<ol>
			<li>使用图像分析工具中的形状工具，在无污垢、指纹、破损区域或粗大叶脉的区域绘制一个形状。统计该区域内的气孔数量，总计至少 50,000 µm2 每样本</li>
			<li>测量气孔保卫细胞长度和气孔孔径长度。计算每平方毫米的气孔数量。2. 按每平方毫米气孔密度与表皮细胞数量的比值计算气孔指数2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 叶脉性状的评估
注意：对于叶脉性状的评估，采用了 Sack 与 Scoffoni17 的改良方案。
<ol>
	<li>样品制备 
	注意：为了优化叶脉的可见度，需先对叶片进行漂白，然后用番红和固绿染色。
	<ol>
		<li>为使叶片褪色，将其置于50%的脱色剂溶液中至少72小时（可测试不同品牌，某些品牌效果可能更佳）。也可选用5% NaOH溶液、10% KOH溶液或25% H2O2 溶液</li>
		<li>将溶液加热至 30° C 或根据具体物种的叶片特征，将步骤3.1.1中的不同溶液组合使用以获得更佳效果，之后用清水冲洗数次。 
		注意：较厚的叶片可能需要更长的溶液浸泡时间或使用更强效的溶液。较薄且较嫩的叶片可能在72小时之内即可达到满意的漂白程度。</li>
		<li>将叶片置于100%乙醇中进行脱色。随后在1%沙黄溶液中染色2–30分钟。为增强染色效果，可仅用1%孔雀石绿溶液处理数秒。根据物种不同，调整染色时间与强度以获得最佳效果。之后用清水多次漂洗。若叶片染色过深，可适当在乙醇或脱色剂中处理一段时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品分析
	<ol>
		<li>使用背光扫描仪以指定分辨率扫描叶片 约 1,200 dpi。扫描时应使分辨率与图像分辨率相匹配， 例如， 借助标尺，确保像素长度可追溯至扫描叶片的绝对长度测量值。</li>
		<li>测量叶片的面积、周长、长度和宽度，计算多个指数， 例如， 长度/宽度和周长2/区域。从图片中央裁剪出一个1 cm × 1 cm的矩形。测量一级和二级叶脉的直径（不包括主中脉）。测量该样方内所有一级叶脉的总长度（叶脉密度）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 其他叶片性状的评估
注意：评估典型叶片性状，如比叶面积（SLA）、叶片干物质含量（LDMC）、叶面积、元素含量、叶习性、叶羽裂、叶复叶类型、叶缘类型 等等。 遵循既定方案 18,19.
<ol>
	<li>观察性叶片性状
	<ol>
		<li>通过野外观察评估叶片的羽裂情况、复叶类型、叶缘类型以及是否存在腺外蜜腺18,19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析性叶片性状
	<ol>
		<li>采集新鲜叶片样品，最好来自用于其他测量的同一植株，用于测定比叶面积（SLA）、叶面积和叶干物质含量（LDMC）18,19。在80 °C烘箱中干燥48小时后，最好使用相同叶片测定元素含量及其比值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schulze, E. -D., Kelliher, F., Körner, C., Lloyd, J., Leuning, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+maximum+stomatal+conductance%2C+ecosystem+surface+conductance%2C+carbon+assimilation+rate%2C+and+plant+nitrogen+nutrition%3A+a+global+ecology+scaling+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Relationships among maximum stomatal conductance, ecosystem surface conductance, carbon assimilation rate, and plant nitrogen nutrition: a global ecology scaling exercise.</a> Annual Review of Ecology and Systematics. 25 (1), 629-662 (1994).</li>
<li>Chaturvedi, R. K., Raghubanshi, A. S., Singh, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+tree+seedlings+in+a+tropical+dry+forest+in+relation+to+soil+moisture+and+leaf+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Ecology%22%5BJournal%5D)">Growth of tree seedlings in a tropical dry forest in relation to soil moisture and leaf traits.</a> Journal of Plant Ecology. 6 (2), 158-170 (2013).</li>
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<li>Oren, R., Sperry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+and+synthesis+of+intra-+and+interspecific+variation+in+stomatal+sensitivity+to+vapour+pressure+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Survey and synthesis of intra- and interspecific variation in stomatal sensitivity to vapour pressure deficit.</a> Plant, Cell and Environment. 22 (12), 1515-1526 (1999).</li>
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<li>Wong, S. C., Cowan, I. R., Farquhar, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+conductance+correlates+with+photosynthetic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomatal conductance correlates with photosynthetic capacity.</a> Nature. 282 (5737), 424-426 (1979).</li>
<li>Sobrado, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+conductance+and+water+potential+differences+inside+leaves+of+tropical+evergreen+and+deciduous+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Hydraulic conductance and water potential differences inside leaves of tropical evergreen and deciduous species.</a> Biologia Plantarum. 40 (4), 633-637 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -J., Meinzer, F. C., Qi, J. -H., Goldstein, G., Cao, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midday+stomatal+conductance+is+more+related+to+stem+rather+than+leaf+water+status+in+subtropical+deciduous+and+evergreen+broadleaf+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Midday stomatal conductance is more related to stem rather than leaf water status in subtropical deciduous and evergreen broadleaf trees.</a> Plant, Cell and Environment. 36 (1), 149-158 (2013).</li>
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<li>Murray, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+computation+of+saturation+vapor+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Meteorology%22%5BJournal%5D)">On the computation of saturation vapor pressure.</a> Journal of Applied Meteorology. 6 (1), 203-204 (1967).</li>
<li>Basic Concepts. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/docs/concepts.html">http://imagej.nih.gov/ij/docs/concepts.html</a> (2015).</li>
<li>Scoffoni, C., Sack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+leaf+vein+traits%5BTitle%5D)+AND+%22PrometheusWiki%22%5BJournal%5D)">Quantifying leaf vein traits.</a> PrometheusWiki. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://prometheuswiki.publish.csiro.au/tiki-index.php?page=Quantifying+leaf+vein+traits">http://prometheuswiki.publish.csiro.au/tiki-index.php?page=Quantifying+leaf+vein+traits</a> (2011).</li>
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<li>Kröber, W., Bruelheide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpiration+and+stomatal+control%3A+A+cross-species+study+of+leaf+traits+in+39+evergreen+and+deciduous+broadleaved+subtropical+tree+species%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Transpiration and stomatal control: A cross-species study of leaf traits in 39 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species.</a> Trees. 28 (3), 901-914 (2014).</li>
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<li>Juhrbandt, J., Leuschner, C., Hölscher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+maximal+stomatal+conductance+and+leaf+traits+in+eight+Southeast+Asian+early+successional+tree+species%5BTitle%5D)+AND+%22Forest+Ecology+and+Management%22%5BJournal%5D)">The relationship between maximal stomatal conductance and leaf traits in eight Southeast Asian early successional tree species.</a> Forest Ecology and Management. 202 (1-3), 245-256 (2004).</li>
<li>Brodribb, T. J., Holbrook, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+physiology+does+not+predict+leaf+habit%3B+examples+from+tropical+dry+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Trees%22%5BJournal%5D)">Leaf physiology does not predict leaf habit; examples from tropical dry forest.</a> Trees. 19 (3), 290-295 (2005).</li>
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<li>Kröber, W., Heklau, H., Bruelheide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf+morphology+of+40+evergreen+and+deciduous+broadleaved+subtropical+tree+species+and+relationships+to+functional+ecophysiological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Leaf morphology of 40 evergreen and deciduous broadleaved subtropical tree species and relationships to functional ecophysiological traits.</a> Plant Biology. 17 (2), 373-383 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过本文提出的方法提取的气孔调节参数凸显了气孔性状的重要性，例如气孔密度和气孔指数。这些新发现的关系表明，将生理模型中的参数与叶片的形态学、解剖学和化学性状相联系具有重要潜力20。与其他方法相比，本方法的优势在于能够捕捉到一个独特且明确的水汽压亏缺（vpd）值，在该值下气孔导度被下调至模型预测的最大气孔导度（gs）的一半。
在本实验方案所列的所有步骤中，最关键的步骤是气孔导度的测量。由于气孔导度受到多种因素的调控，环境气象条件对其具有显著影响。在高相对湿度和低光照强度下测得的气孔导度（gS）可能不可靠21-23。针对形态学和解剖学性状，该实验方案应始终根据研究中所包含的目标物种进行相应调整。特别是在叶脉密度分析中，叶片的漂白和染色时间应根据叶片结构和坚韧程度进行适当调整。该方法可能存在的局限性包括某些因叶片形态特殊而导致气孔导度测量困难或易出错的物种，例如针叶树和叶片极窄的禾本科植物。
我们的结果部分证实了气孔导度参数与叶片经济谱（LES）的叶片性状之间存在关联的第一条假设，这与其他多项研究结果一致。例如，Poorter 和 Bongers（2006）24 报道了 gS 与 LES 所代表的性状之间存在密切关联，e.g.，随着叶片寿命的增加，gS 降低。相应地，Schulze et al.（1994）1 证明了叶片氮含量与 gSMAX 之间存在明确的关联。类似地，Juhrbandt et al.（2004）25 发现 gSMAX 与叶面积及叶片氮含量之间存在显著关系。
我们关于常绿与落叶习性之间存在明显差异的第二个假设未能得到证实。常绿和落叶习性内部在所测参数和性状上表现出的高度变异表明，叶习性并不是叶片经济谱（LES）的良好描述指标。Brodribb 和 Holbrook（2005）26 指出，叶习性与叶片生理策略之间可能并非必然关联，因为在各类叶习性中，广泛的性状变异均十分常见。
该方法可扩展至叶片以外的植物器官性状和生理特征，例如与木质部水力相关的性状，如木质部比导水率和显微木材性状27。类似地，也可纳入由显微技术获得的其他类型的叶片性状，如栅栏组织结构和表皮蜡质层结构28。
综上所述，本研究证实了叶经济谱（LES）与气孔调节之间的密切关联。此外，本文所采用的方法揭示了与叶经济谱无关的气孔调节模式的若干方面。特别是叶片的特定性状，如气孔大小、密度和指数，以及叶脉长度，值得在未来的功能植物研究中予以更多关注。

为了深入理解植物叶片的功能，近年来许多研究尝试将叶片的形态学、解剖学和化学性状与生理响应（如叶片气孔导度（gS) 1-4此外，除了叶片性状外，气孔导度还受到光合有效光子通量密度、空气温度和水汽压差（vpd）等环境条件的强烈影响。 5已提出多种方法来模拟 gs 与 vpd 的关系曲线6-8 主要基于 gs 对 vpd 的线性回归 6相比之下，本研究提出的模型回归了相对气孔导度的logits值（即， g 的比值S 至最大气孔导度 gSMAX) 对 vap（水汽压差）进行建模，并通过将 vap 作为二次回归项引入以考虑其非线性效应。
与其他模型相比，新模型能够推导出描述在水分亏缺条件下气孔导度（gS）下调时的水汽压差（vpd）参数。同样，也可获得气孔导度（gS）达到最大值时对应的水汽压差（vpd）。由于这些生理参数预计与碳同化过程密切相关9,10，因此这些模型参数与叶片经济谱（LES）所反映的关键叶片性状在养分和资源分配策略上的关联也应十分紧密3,11。因此，气孔调节策略与LES性状之间也应存在密切关系。这种关系尤其可能体现在叶片习性（常绿与落叶）上，因为叶片习性既与叶片经济谱相关，也与水分利用效率相关12,13。常绿物种通常生长较慢，但在养分贫瘠的环境中具有更高的利用效率14。因此，叶片习性应表现为不同的气孔调节模式，常绿物种相较于落叶物种会采取更为保守的水分利用策略。
在共同园艺条件下对大量阔叶树种进行比较，检验了以下假设：1）气孔导度（gS）与水汽压差（vpd）模型的参数与叶片经济谱相关的叶片性状存在关联。2）常绿树种的平均气孔导度（gS）和最大气孔导度（gSMAX）值低于落叶树种。

<table><tbody><tr><td>SC 1 突变孔计</td><td>Decagon</td><td></td><td>其他任何型号的突变孔计均可使用</td></tr><tr><td>用于标记叶片的扎带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料样品袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸质样品袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>湿度计</td><td>Trotec</td><td></td><td>其他任何型号均可使用</td></tr><tr><td>指甲油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 plus 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>其他任何型号均可使用</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% KOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>孔雀石绿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>沙夫兰</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

关联气孔导度与叶片功能性状

Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

叶片功能性状之所以重要，是因为它们反映了植物的生理功能，例如蒸腾作用和碳同化作用。特别是，叶片的形态性状能够综合概括植物在水分利用效率、生长模式和养分利用等方面的战略策略。叶片经济谱（LES）是功能植物生态学中一个公认的研究框架，它体现了一个梯度变化趋势：比叶面积（SLA）、叶片氮、磷和阳离子含量逐渐增加，而叶片干物质含量（LDMC）和碳氮比（CN）则逐渐降低。LES描述了从单位叶质量具有高光合能力的短寿命叶片到单位质量碳同化速率较低的长寿命叶片的不同生存策略。然而，未被纳入LES的性状可能为物种生理特征提供额外信息，例如与气孔调控相关的性状。本文介绍了一系列广泛的叶片功能性状测定方案，既包括属于LES的性状，也包括独立于LES的其他性状。特别地，本文引入了一种新方法，用于描述植物气孔导度对水汽压差（vapor pressure deficit, vpd）的调节行为。由此获得的气孔调节参数可与LES及其他植物功能性状进行比较。结果表明，LES中的叶片功能性状同样能有效预测气孔调节参数。例如，叶片碳浓度与导度-vpd曲线拐点处及最大值处的水汽压差呈正相关关系。然而，未包含在LES中的性状在解释气孔调控参数方面提供了额外信息：在气孔密度较高和气孔指数较高的物种中，导度-vpd曲线拐点对应的水汽压差更低。总体而言，气孔和叶脉相关性状在解释气孔调节机制方面比LES所使用的性状具有更强的预测能力。

气孔导度和气孔调节的多个参数被发现与叶片的形态、解剖和化学性状相关。以下重点讨论在拐点处的水汽压差（vpd）与各性状的关系，该值随气孔密度的增加而降低（p=0.04），随气孔指数的增加而降低（p=0.03），并随叶片碳含量的增加而升高（p=0.02，见图3）。结果表明，在拐点处vpd降低的同时，气孔密度和气孔指数也随之降低。相比之下，气孔导度的任何参数均未显示出与叶习性之间的明确关系。两种叶习性组内均表现出较高的变异，说明常绿和落叶叶习性组内均存在不同的调控机制。

<img alt="气孔导度调节模式与叶片性状关联的散点图，显示相关性。" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 气孔导度调节模式与叶片性状之间关系的结果图。 气孔导度（gS）- 气压亏缺（vpd）曲线拐点处的气压亏缺值（VpdPoi）与（A）气孔密度、（B）气孔指数及（C）叶片碳含量的关系20。经许可重印自20。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

解析生理学与形态学之间的关联，有助于深入理解植物叶片的机制性功能。本文介绍了一种从气孔导度测量中推导气孔调节参数的方法，并探讨了这些参数与传统叶片功能性状之间的相关性。

叶片功能性状之所以重要，是因为它们反映了植物的生理功能，例如蒸腾作用和碳同化。特别是……

本实验的总体目标是将叶片的生态生理特性与形态学特性相关联，以更深入地理解不同植物群落中的生态系统功能。首先通过测定气孔导度的日变化过程，提取描述不同物种气孔调控特征的相关参数；第二步是利用显微镜测量气孔的大小和密度。接下来，评估叶脉性状。最后一步是将形态学和解剖学特征与植物物种的生态生理特性联系起来。这使得我们能够更深入地从机制上理解植物叶片，例如在此展示的不同叶性状物种在空气变干燥时的气孔关闭现象。本研究的总体思路是利用易于测量的叶片性状作为关键植物功能的代理指标，这些功能若直接测量则需要大量工作。本实验方案的主要目标是将多个山谷中评估的叶片性状与某些调控机制关联起来，这是植物在平衡水分利用与生长策略中的关键方面。该方法有助于回答功能生物多样性研究领域中的关键问题，即在一个多样化的树木群落中，不同物种的生态生理过程如何贡献于生态系统的功能。应根据可重复的模式，选择不同物种和个体的叶片。例如，尽可能选择植株上高度相同、受光条件相同、在植株内位置相同、仅来自同一节位且仅属于同一类型（如阳生叶或阴生叶）的叶片。仅测量处于健康且完全发育状态的叶片。在个体植株上标记所选叶片，以确保重复测量在同一片叶上进行。使用稳态参数，仅在叶片表面进行气孔导度测量，避免叶中脉和粗大叶脉区域。在日出前的清晨开始测量。重复测量5到10次，直至中午时分气孔导度值明显下降。每日进行一次测量，可获得用于分析蒸气压差与STO金属电导率之间关系的优质数据。每次测量dooma电导率时，应记录温度和相对湿度，最好使用便携式记录仪，直接测量同一叶片所处位置的环境条件。采用August-Roche-Magnus公式计算蒸气压差。现在，按物种分别将所有气孔导度数据对蒸气压亏缺作图。将每片叶子的所有日变化过程合并，按物种进行单个分析。通过查找气孔导度数据中的最大值，提取观测到的最大值，以用于模型的尺度化。为实现物种间的可比性，将观测值除以该物种的最大观测值。对每个物种，使用二项误差分布的广义线性模型，将气孔导度的对数值对蒸气压差及其二次项进行回归分析。接下来，通过计算每种物种模拟的最大气孔导度（GS max）的绝对值，提取气孔调节参数。为此，将该曲线的一阶导数设为零，以计算最大气孔导度对应的水汽压差，得到 A VPD GS max fit 等于负的 B 除以 2A。将 VPD GS max fit 代入曲线公式，并对结果取 E 次幂，从而获得 max fit。根据缩放模型，计算每个物种所有电导测量值的平均值，以获得相对值。提取以下两个点的气孔电导和水汽压差值：模型最大值处的气孔电导和水汽压差值，以及曲线第二个拐点处的水汽压差值。将这些值乘以GS max，以获得绝对气孔电导值。针对这些要点，应优先从用于测量气孔导度的同一叶片上取样。如果无法做到，则需采用与选择用于气孔导度测量的叶片时相同的筛选程序，最好在相同的个体植株上进行。如果样品无法立即处理，请将其保存在70%酒精中。在新鲜样品上涂抹一层无色快干的透明指甲油。待指甲油干燥后，轻轻将印模从叶片上剥离，并进行显微分析。与普通叶片样本相同，在将相机连接到光学显微镜后，使用放大倍数为40倍至400倍的显微镜进行观察。借助开源图像处理软件（如Image J）中的标尺，将所拍摄图像与对应的光学放大倍数和图像分辨率相匹配，对这些图像进行分析。在图像中选择无污垢、指纹、破损区域或大型叶脉的区域，使用图像分析工具中的形状工具绘制一个区域。在此区域以及每个样品至少 50,000 平方微米的范围内计数 S 气孔。测量 S 气孔保卫细胞长度和孔口长度。计算每平方毫米 S 的数量以漂白叶片。将它们置于50%的脱色剂溶液中至少72小时，并将溶液加热至30摄氏度。之后用清水多次冲洗叶片。根据具体物种的叶片特征调整漂白过程，以实现对叶片的染色。将它们放入99%乙醇中，在1%番红溶液中染色2至30分钟。染色后，用清水多次冲洗叶片。如果叶片染色过深，可适当延长脱色时间。乙醇或脱色剂可能有助于分析样品。使用背光扫描仪以大约每英寸1,200点的分辨率对叶片进行扫描。借助标尺比对扫描图像与图片的分辨率，以确保像素长度能够追溯到被扫描叶片的绝对长度测量值。测量叶片的周长、长度和宽度。计算多个指数，例如长度与宽度的比值，或周长与面积的比值。然后从图像中央裁剪出一个 1×1 厘米的矩形区域。测量一级和二级叶脉的直径。测量所有一级叶脉的长度。在此象限中，显示了所有物种的气孔导度数据对水汽压亏缺回归的拟合模型图。不同颜色的线条代表不同的叶型，其中黑色线条代表常绿物种，红色线条代表落叶物种。探究气孔导度调节模式与叶片性状之间的关联表明，在拐点处的水汽压亏缺随土壤密度和气孔指数的增加而降低，随叶片碳含量的增加而升高。相比之下，气孔导度的各个参数均未显示出与叶型之间存在明显的关系。两种叶习性组之间的高度差异表明，常绿和持久叶习性组内均存在不同的调控机制。在应用此流程时，重要的是根据具体的叶片特性调整处理细节。由于不同物种间的叶片性状存在较大变异，通过此流程，我们的形态学叶片性状也可与其他生态生理特征（如xim）相关联。对空穴现象的敏感性或特定的水分传导连接性，有助于理解植物对干旱的预设响应机制。我们希望本视频能够推动利用叶片形态性状和功能性生物多样性研究，旨在通过易于测量的性状来预测生态系统的功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

与气孔导度，以叶功能性状

我们已开发出一种简单且可重复的实验方案，用于检测气孔对活细菌的响应。与先前报道的表皮撕片法相比，该方法最大限度地减少了对叶片的损伤和操作。...

利用全叶片成像技术评估活体细菌细胞诱导的气孔响应

我们介绍一种相对较快速（30 分钟）且适用于蒸腾状态下离体叶片的叶水力导度（Kleaf）与气孔导度（gs）同步测定的实用方法。该方法可经修改后用于测定 Kleaf 和 gs...

利用蒸发通量法（EFM）测定叶片水力导度和气孔导度及其对光照和脱水的响应

生物量的液压电容是植被水分预算的关键组成部分，可作为抵御短期和长期干旱胁迫的缓冲机制。本文介绍了一种用于校准和使用土壤水分电容传感器以监测大型树木茎干含水量的实验方案。...

利用电容传感器监测树木茎干水分含量的校准与使用

我们提供了一种通过大规模筛选化合物文库来鉴定叶片蒸腾作用调节剂的方法。...

通过大规模热成像筛选鉴定向日葵（Helianthus annuus）中植物蒸腾作用的新调控因子

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。...

通过表皮表型评分鉴定参与气孔发育的基因 via

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。...

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

本文介绍一种简单的方法，用于直接观察和自动测量细菌侵染下拟南芥（Arabidopsis...

气孔响应的直接观察与自动测量 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 在 拟南芥

本方案展示了利用数字叶形态学和单位叶面积质量重建方法，对化石叶片的连续叶形态特征进行数字化测量与分析，以重建古气候和古生态环境。...

利用数字叶形态学和单位叶面积质量通过化石叶片重建陆地古气候与古生态

本实验方案介绍了一种利用表皮撕片、透明化技术及人工智能辅助图像分析，对两个不同物种的气孔和表皮性状进行比较研究的方法。其目标是实现对气孔功能相关细胞结构的高通量、可重复定量分析，以服务于农业应用及广泛的植物学研究。...

利用表皮撕取、透明化处理及基于人工智能的图像分析表征气孔与表皮性状

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。...

小鼠明暗转换实验

了解植物叶片气孔导度与形态性状的关联方法，通过显微测量和统计分析提取气孔调控参数。该方案为功能生物多样性研究提供了将易测叶片性状与生态系统功能相联系的技术框架。

关联气孔导度与叶片功能性状

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