小鼠初始型CD4⁺ T细胞分离与 体外 T细胞亚群的分化

以下实验方案的总体目标是将从小鼠淋巴结和脾脏中分离出的初始型CD4阳性T细胞极化为不同的辅助性T细胞亚群。体外实验中，首先处理从成年野生型小鼠中获取的脾脏和淋巴结；第二步，通过磁珠分选富集CD4阳性细胞群体，再根据其初始T细胞标志物的表达进一步分选。

最后一步中，细胞经T细胞受体激活因子和极化细胞因子处理，以诱导其分化为不同的辅助性T细胞亚群。最终通过流式细胞术、ELISA和实时PCR检测辅助性T细胞分化的效率。

该方法有助于解答T辅助细胞研究领域中的关键问题，例如特定分子的表达或特定药物的处理如何影响T细胞应答的性质。首先，将一只5至10周龄的C57BL/6小鼠的四肢固定在解剖板上，然后从肛门至下巴沿纵轴剪开皮肤，注意不要刺破下方的腹膜组织。接着，将皮肤展开并用固定针固定，用一把镊子夹住淋巴结，另一把镊子分离图像中所示各个位置的周围组织。

每获取一个淋巴结后，立即将其放入含有添加1% FBS的PBS或PBS plus的收集皿中，然后小心打开腹膜并取出脾脏。将脾脏也放入收集皿中，并将整个收集皿转移至冰桶中，以富集CD4阳性细胞。使用无菌镊子将淋巴结和脾脏分别放入两个独立的60毫米培养皿中，每个培养皿含有3毫升PBS plus。

接下来，将一片无菌尼龙网覆盖在脾脏上，用注射器活塞的拇指侧轻轻将脾脏压碎，使其紧贴尼龙网，直至几乎所有组织进入悬液状态。将悬液上下吹打数次，以分散残留的可溶性团块，然后将一片新的尼龙网覆盖在15毫升锥形管的管口。通过尼龙网过滤悬液，以去除任何残留的碎片。

随后对淋巴结重复进行机械解离操作，并用含PBS的溶液填充两支已过滤细胞的离心管。然后轻轻颠倒混匀数次，离心收集细胞。将淋巴结细胞沉淀重悬于2毫升PBS中。

每只小鼠的脾细胞沉淀中加入一毫升冰上预冷的CK溶液。一分钟后，加入十毫升含钙镁的磷酸盐缓冲液终止红细胞裂解。倒置混匀试管，再次离心收集细胞。

然后用额外的 10 毫升含钙镁 PBS 重悬脾脏沉淀，加入淋巴结细胞，离心收集混合细胞悬液。此次将沉淀用每只小鼠 85 微升含钙镁 PBS 中稀释的 15 微升 CD4 磁珠在 4 摄氏度下孵育 15 至 30 分钟。然后用 10 毫升含钙镁 PBS 稀释细胞。

将悬液通过尼龙滤网过滤至新的15毫升离心管中，离心收集细胞。再次将沉淀重悬于每只小鼠100微升含PBS的溶液中，并根据生产商说明书，利用磁珠分选法富集CD4阳性细胞。获得CD4阳性细胞组分后，用10毫升含PBS的溶液洗涤细胞，以分选出CD4阳性T细胞组分。

随后，在四摄氏度避光条件下，用适当的荧光标记抗体对细胞进行标记，孵育时间为15至30分钟。洗涤后，过滤标记的细胞以去除任何碎片，并将细胞转移至预冷的流式管中，置于冰上并避光。分选CD4阳性、CD25阴性、CD62L阳性、CD44阴性细胞群体至完全RPMI培养基中。待所有细胞收集完毕后。

用新鲜的完全培养基洗涤初始T细胞。然后重悬细胞沉淀，用完全RPMI培养基计数初始T细胞，并将细胞浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞，以诱导体外T辅助细胞亚群分化。接着，用1毫升无菌、不含FBS的PBS洗涤预先包被抗CD3和抗CD28的细胞培养板各孔，随后进行细胞接种。

根据表格所述，细胞最终向培养基中添加适当的细胞因子和阻断抗体，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养4至5天，即在体外培养共8至10天后。可对体外分化的TH1、TH2、可诱导性调节性T细胞（treg）和TH17培养物中CD4阳性T细胞进行胞内细胞因子染色，以确认每种T细胞亚群均表现出预期的细胞因子谱型。

事实上，在使用抗CD3 EISs再刺激24小时后，A图显示这些亚群也表现出与细胞内表达的细胞因子蛋白相对应的细胞外分泌。针对谱系特异性转录因子的实时PCR进一步验证了体外分化所得CD4阳性T细胞亚群具有相应的转录因子表达谱。观看本视频后，您应能充分理解如何分离和处理小鼠淋巴结和脾脏细胞，以获得初始的CD4阳性辅助性T细胞。

此外，您将能够将这些T细胞分化为TH1、TH2、TH17或调节性T细胞（ireg细胞）。