Name: 病毒介导的标签和内侧神经节隆起移植（MGE）细胞在体内研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 了解病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记与移植技术，用于GABAergic中间神经元亚群的体内研究。该方法支持神经精神疾病机制探索与神经修复研究。

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本研究得到了以下机构对 JLRR 的资助：Autism Speaks、Nina Ireland、Weston Havens 基金会、NIMH R01 MH081880 和 NIMH R37 MH049428。PRW 获得了中国台湾国家科学委员会资助的博士后奖学金。SFS 获得了 F32（MH103003）项目的资助。

伦理声明：以下操作步骤已获得本机构及动物实验方案的批准。在开始实验前，务必确保所有涉及存活手术的操作均已获得批准，并核实所有方案均为最新有效版本。
1. 慢病毒制备（可选步骤）
<ol>
	<li>将每种待制备的慢病毒分别接种于三块10 cm培养板的HEK293T细胞中，每板加入10 ml DMEM/10% FBS，培养至细胞融合度达约60–70%。将细胞置于37℃培养箱中培养。 &#176;C，5% CO₂2.</li>
	<li>转染以下DNA质粒（10 &#181;g 总量）加入到每个孔板中，可使用任何转染试剂：6.4 &#181;g CAG-Flex-GFP 慢病毒载体（DNA 载体序列见表 1），1.2 &#181;pMD2.G（编码VSV-g），1.2 μg &#181;g pRSV-Rev 和 1.2 &#181;g pMDLg/pRRE。这三种慢病毒包装载体可商业获得（表 
	注意：本特定方法使用第三代慢病毒载体，但第二代载体及相关质粒同样适用。</li>
	<li>在BSL2级认证的生物安全柜中准备一个含有10%次氯酸钠溶液的废液容器，用于灭活接触过或含有慢病毒的溶液或器械。随后，在4–6小时后完全移除培养基&#160;转染后放入漂白溶液中，随后替换为等体积的新培养基，并让细胞继续生长。</li>
	<li>4 天后，将培养基收集到 50 ml 锥形管中，在 1,000 × g 离心 15 分钟，以沉淀所有细胞碎片。接着，将上清液通过 0.45 μm 滤膜过滤 &#181;膜。任何低蛋白结合力的滤膜（如PVDF）均适用。注意：固体和液体的病毒废弃物均需放入漂白液中。</li>
	<li>将30 ml过滤后的上清液加入超速离心管中，置于超速离心机内。在4℃条件下以100,000 × g离心2.5小时 &#176;C. 在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中打开离心管，将上清液移至含10%次氯酸钠的容器中。加入约100 μL裂解缓冲液。 &#181;加入适量 PBS 至沉淀，得到滴度为 1×10^7–8 感染单位/毫升的病毒悬液。次日分装并保存于 -80 ℃ &#186;C. 慢病毒分装样品在 -80℃ 下稳定 &#176;至少六个月的 C。</li>
	<li>重要考虑事项：目前许多机构均设有病毒核心实验室。请获取滴度不低于1×10⁸的浓缩病毒。7 每毫升感染单位，以获得最佳结果。</li>
</ol>
2. 用于MGE解剖的供体小鼠
<ol>
	<li>首先，将一种表达 Cre 的目标品系与野生型（WT）小鼠或一种在 Cre 介导的重组后可表达报告基因的小鼠进行定时交配。 
	注意：许多 Cre 驱动品系为转基因品系，通常以半合子状态维持和繁育。因此，仅有一半的胚胎会携带 Cre 转基因。可从胚胎中快速提取 DNA 并进行短片段 PCR 以检测 Cre 等位基因。随后可收集 Cre+ 胚胎，从而确保仅使用目标基因型的MGE组织。或者，也可使用 Cre 依赖性报告基因小鼠，以筛选出用于 MGE 分离和移植的胚胎。</li>
	<li>计算出相当于胚胎发育第 13.5 天（E13.5）的具体日期。若动物于前一日晚上配对，则发现阴栓当日记为 0.5 天。订购已定时妊娠的小鼠，或准备带有出生后第 1 天（P1）幼崽的野生型雌鼠，以便在供体组织处于 E13.5 时，获得相应日期的 P1 小鼠。或者，可在配对供体动物前一周内在本实验室自行设置上述交配。 
	注意：同一天获得 E13.5 胚胎和 P1 幼崽的前述策略通常难以稳定可靠地实现。</li>
</ol>
3. 培养基、工具和设备的准备。
<ol>
	<li>准备MGE细胞制备所需的试剂和工具（表2）。
	<ol>
		<li>准备一个洁净的操作台面，并将洁净的镊子、剪刀以及显微手术刀或精细镊子（用于精确组织解剖）放置于台面上。</li>
		<li>准备用于解剖的Hank's平衡盐溶液（HBSS），以及用于转导的含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。</li>
		<li>在37 °C组织培养箱中预孵育20–30 ml DMEM/10% FBS，约1小时。培养瓶盖应略微松开，以利于气体交换和培养基pH值的平衡。 
		注意：培养基的预孵育可在开始解剖前立即进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. MGE 细胞制备
<ol>
	<li>根据批准的动物实验方案处死怀孕小鼠，并将胚胎取出置于含有冰冻HBSS的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在解剖显微镜下逐个取出每个胚胎的脑组织（一次处理一个，其余胚胎保持在冰冻HBSS中），然后进行MGE组织的分离。 
	注意：以下详细描述了如何分离MGE的关键步骤，并在图1中展示。此外，图2为完整解剖过程的视频演示。
	<ol>
		<li>将脑组织腹面朝上放置（图1A, A'）。注意：背侧朝上亦可接受。沿矢状面将脑组织切成两半，得到两个半脑。示例半脑如（图1B, B'）所示，可见脑组织的背侧（覆盖的皮层）和腹侧包裹并包围着神经节隆起（GE）组织。</li>
		<li>接下来，用主手持极细镊子或解剖刀（表2），同时用非主手的镊子固定半脑（半脑的内侧应朝上）。用镊子和解剖刀展开背侧和腹侧组织，以暴露下方的GE组织（见图&#160;1C及示意图图&#160;1C'）。 
		注意：从解剖培养皿中移除部分液体有助于在MGE解剖过程中更稳定地固定组织。</li>
		<li>使用解剖刀或细镊子做直线切割，分离CGE、LGE和隔区组织（参见红色虚线所示的示例切割位置，图1D 和 D'）。这些切割顺序可任意进行。 
		注意：可将MGE想象成一个被从周围组织中“切出的盒子”。这种方法有助于在每次解剖时重复进行相似的切割，从而减少组织解剖的变异性。</li>
		<li>最后，将MGE侧置，并修剪掉底部（即脑组织的外侧部分）。此步骤可去除MGE的套层区（见图1E 和 1E'中丢弃部分），保留下来的MGE部分主要包含脑室区和脑室下区，其中几乎含有全部的MGE前体细胞。后续实验使用此部分组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重要提示：在培养皿底部添加硅胶凝胶可提供极佳的解剖操作表面，既能保护镊子的精细尖端，又能为用镊子固定组织提供柔软的支撑面。</li>
</ol>
4.3&#160;MGE解剖的其他策略。
<ol>
	<li>使用镊子像剪刀一样剪开胚胎的皮肤，以快速取出脑组织。将胚胎侧放，用镊子夹住头部基部以固定组织。首先在脑前方腹侧和脑后方腹侧分别剪开，然后沿胚胎侧面将两处切口连接。接着抓住皮肤瓣并将其拉过脑组织上方，即可迅速将脑组织从剩余组织中分离出来。</li>
	<li>或者，将整个脑组织的后部在皮层后方固定。同时，用手抓住每个半球皮层最背侧的尾端，将皮层从前端方向从固定组织上撕离。通过这种方式，可去除两侧皮层，暴露出仍附着于其余组织上的双侧神经节隆起，从而保留内侧-外侧解剖结构。</li>
	<li>切换至刺切刀，在每侧半球的MGE周围进行精确切割。可使用另一套干净的镊子收集MGE，或使用带大口径吸头的移液器即，P1000） 
	注意： 将收集的组织与其他所有已解剖的材料分开存放，因为在收集MGE时不可避免地会转移部分培养基。</li>
	<li>收集MGE，并将组织放入含有DMEM/10% FBS的1.5 ml收集管中（体积为500 &#181;l&#160;足以收集MGEs）。对另一侧大脑半球重复上述操作，并放入同一收集管中。在所有组织收集完毕前，将样品保持在冰上。</li>
</ol>
5. 慢病毒标记与移植
<ol>
	<li>将MGE组织管移至BSL2级认证的生物安全柜中，并移除培养基。 
	注意：MGE组织足够大，肉眼可见，会沉降至管底，便于轻柔地移除冷培养基。</li>
	<li>加入约500 µl&#160;预热至37 °C组织培养孵箱中的DMEM/10% FBS培养基。随后，向每管中加入polybrene，使其终浓度为8 µg/mL，以促进转导。使用P1000移液枪头反复吹打MGE组织，制成单细胞悬液。最后，向每管中加入约15–20 µl浓缩的慢病毒液。</li>
	<li>重要注意事项：对单个胚胎来源的MGE组织，吹打10–12次通常足以将其充分解离；若多个MGE组织合并处理，则可能需要更多次吹打。建议尝试不同的吹打条件，以确定最佳操作参数。</li>
	<li>将每管盖紧，轻轻颠倒混匀后，置于37 °C孵箱中。细胞与慢病毒共孵育时间至少30分钟，最长不超过1小时；孵育时间过长会导致细胞活力下降。每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次，直至孵育结束。</li>
	<li>慢病毒感染孵育结束后，从孵箱中取出各管，于约700 × g离心3分钟以收集细胞。在BSL2级生物安全柜中吸除上清液，并将其弃入10%漂白剂溶液中。随后，向每管加入1 mL DMEM/10% FBS培养基，吹打2–3次以洗涤细胞，再以相同转速离心收集细胞。重复此洗涤步骤2–3次，以彻底去除残留病毒。 
	注意：建议所有离心步骤在4 °C进行，但在室温下进行短时间离心未观察到细胞活力明显下降。</li>
	<li>最后一次洗涤后，尽可能吸除培养基，并将各管置于冰上。由于管壁残留少量培养基，在开始移植操作时，约有2–3 µl液体将覆盖在细胞沉淀表面。</li>
</ol>
6. 移植与验证
<ol>
	<li>获取宿主P1幼鼠，并用70%乙醇喷洒操作区域以进行准备。为在操作过程中维持无菌状态，建议在专用的洁净操作室中进行这些操作。此外，使用经过高压灭菌的手术器械，并用70%乙醇对幼鼠将接触的表面进行消毒。进行移植操作所需的代表性设备及代表性操作区域示例见图3。</li>
</ol>
注意：尽管该操作仅涉及小体积注射，并非需要切口、开放性伤口或缝合的外科手术，但仍建议为每只待注射小鼠使用新的微量移液器。微量移液器在拉制和修尖时经过加热灭菌，操作表面已喷洒70%乙醇，并将其存放于密封容器中。
<ol>
	<li>制备微移液管，使其尖端直径在 40–80 µm 之间。按照此尺寸制备可获得最佳效果。在拉制和修整微移液管后，对其进行热灭菌，并在存放于密封容器前用 70% 乙醇喷洒。 
	注意：如果无法获得制备此类针头所需的设备（表 2），可使用其他注射装置作为替代。但由于直径不同，这些装置可能不如微移液管适用。</li>
	<li>用 1 ml 注射器吸取矿物油，并使用 30&#160;1/2 G 针头将玻璃移液管完全充满矿物油。接着，将推杆安装到立体定位仪上，然后将玻璃移液管连接至立体定位仪并装入推杆。使用液压驱动装置，将推杆推入玻璃移液管约一半深度，并用干净的纸巾擦去溢出的矿物油。
	<ol>
		<li>作为使用注射器的替代方法，可将移液管后端浸入矿物油中，通过毛细作用充满。为防止移液管中产生气泡，在完全退出玻璃移液管前应保持注射器内的正压。 
		注意：其他设备也可成功移植 MGE 细胞14。任何能够输送小于或接近 100 nl 体积的装置均适用于本操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，使用无菌纸巾或其他吸水材料，将其一角拧成细尖，轻柔地去除 MGE 细胞沉淀上方多余的培养基。此步骤可提高细胞密度，从而实现更小的注射体积。随后，使用低容量移液器（推荐使用 P2）缓慢吸取细胞沉淀，并吹打 1–2 次，再将细胞悬液转移至疏水表面。体积应略小于 1 µl。将针头插入细胞悬液中，利用液压驱动装置将细胞悬液吸入移液管内。</li>
	<li>&#160;通过低温麻醉法对出生后第 1 天（P1）的幼鼠进行麻醉（用乳胶手套包裹后置于冰上约 2–4 分钟）。通过有害刺激检查麻醉效果：用精细镊子夹捏脚趾间的皮肤，幼鼠应无反应。随后，将幼鼠放置于注射装置下方的模具上，向后拉紧头部皮肤并用普通实验室胶带固定，使皮肤绷紧。 
	注意：尽管低温麻醉对新生小鼠非常有效且死亡率低，但操作必须迅速，因为幼鼠在不到 10 分钟内即开始恢复。此外，冰上放置 4 分钟为耐受上限。若需更长时间注射，应尽量仅诱导一次低温麻醉。然而，若幼鼠过早恢复，应先让其完全恢复后再进行第二次低温麻醉。此外，最多仅可再诱导一次低温麻醉以完成注射。幼鼠通常在低温麻醉后 5–10 分钟内恢复&#160;，可通过将其放回同窝幼鼠和母鼠身边，或置于温暖表面以促进恢复。</li>
	<li>使用立体定位仪，将玻璃移液管尖端置于幼鼠头部表面，与头部表面垂直。当移液管接触头部时，记为“0”位置。接着，将移液管穿过皮肤和颅骨进入皮层，并前后插入和回撤约 2 次后停止。为最佳靶向新皮层，注射应在微移液管深度为 0.1 mm 时进行。然而，用户应根据实际情况优化该深度（见下文注释）。 
	注意：尽管上述设备在此深度下可可靠靶向新皮层深层，但仍应通过实验经验测试多个深度。此外，应在不同的前后位和内外侧位置测试一系列深度，以确定每个位点的最佳深度。同时，初始穿刺应迅速进行，因为缓慢进入新皮层会降低组织穿透的清晰度。初次操作时可尝试不同速度，以找到最佳效果。此外，在测试坐标时，使用标记细胞是无可替代的方法，因为染料在标记位置方面并不可靠。</li>
	<li>当针头到位后，旋转液压装置，推动推杆进入玻璃移液管，将设定体积的细胞悬液注入皮层。每个位点注射 50–70 nl。若目标是在整个新皮层实现广泛的细胞分布，则在 3–6 个不同前后位水平的位点重复此操作。 
	注意：单次注射体积达 100 nl 或更大时可能造成损伤，并导致大量细胞聚集在注射部位，无法有效迁移出去。因此，若时间允许，应在更多位点使用较小注射体积（约 70 nl 或更少）为最佳。</li>
	<li>注射完成后，将幼鼠从操作台上移开并做标记（剪趾是一种可靠的后期识别方法）。待幼鼠恢复自主活动能力后（通常在移下操作台后几分钟内发生），将其放回母鼠和同窝幼鼠中。 
	注意：由于该操作为微创，一旦幼鼠能够自由活动并回暖，无需进行术后护理。但不仅应在操作后检查幼鼠，次日也应继续观察，确保其无健康恶化的迹象。</li>
	<li>在开始下一只幼鼠的操作前，用 70% 乙醇喷洒操作区域&#160;，以维持无菌工作环境。让注射后的幼鼠继续发育，并在适当的发育阶段评估组织。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

来自胚胎期纹状体隆起（GEs）的GABA能皮层中间神经元前体细胞在基于细胞的治疗多种疾病方面已展现出良好前景12–14。为了追踪特定中间神经元亚群并使其表达目的基因，需要精确的分子技术。本文提供了一种在移植前利用慢病毒标记胚胎期MGE细胞的详细方案，并展示了该技术如何用于在特定皮层中间神经元亚群中表达目的基因，以进行体内分析。
本文所述方案可被可靠地使用，但为了获得最佳的可重复性，必须遵循几个关键步骤。首先，为了实现高效的病毒转导，必须维持生理温度和pH值。若满足这些条件，MGE细胞可在约30分钟内完成转导。其次，在进行移植前，务必确保获得致密的MGE细胞沉淀。这一点非常重要，因为在不造成组织损伤的前提下，每次注射至新生小鼠脑内的体积有限，且细胞会从注射部位迁移出去，因此移植时细胞的密度并不像预期那样关键。最后，可使用表达荧光报告基因的MGE细胞进行若干预实验，以确定最佳的注射深度。尽管本方案使用了MGE细胞，但CGE细胞也可采用相同的方法进行操作。一个局限性在于，目前尚缺乏能够特异性限制在全部CG...

GABA能皮层中间神经元约占哺乳动物新皮层神经元的20-30%，其余为兴奋性谷氨酸能主神经元。中间神经元在电生理特性、轴突和树突形态以及突触靶向上具有高度多样性 1，且兴奋性/抑制性张力失衡被认为是一些神经/神经精神疾病（包括自闭症、精神分裂症和癫痫）表型的潜在机制 2本方案的总体目标是在移植前高效地对GABA能皮层中间神经元前体进行遗传学修饰 体内 分析。
皮层GABA能中间神经元起源于内侧和尾侧神经节隆起（MGE和CGE）3,4，以及视前区5。皮层中间神经元前体细胞首先经历长距离的切向迁移，随后进行径向迁移，以到达其最终靶区。到达目的地后，这些中间神经元必须正确整合到已有的神经网络中，而每个独特的中间神经元亚群将以特定方式参与皮层环路的构建。根据分子标记可区分出四个主要亚群：MGE来源的生长抑素（SST）+和小清蛋白（PV）+亚群，以及CGE来源的血管活性肠肽（VIP）+和Reelin+;SST-亚群6。不同的皮层中间神经元亚群在胚胎发育不同时段由MGE和CGE产生7,8。这些及其他皮层GABA能中间神经元标记物已被用于构建多个亚群特异性的Cre驱动小鼠品系9-11。
MGE前体细胞的移植已成为一种潜在的细胞治疗策略，可用于治疗由兴奋/抑制失衡引起的疾病 12–24。这些治疗益处可能部分归因于MGE前体细胞（能够弥散、分化并整合到宿主大脑中）的独特能力，或可能是因为许多围绕胞体的抑制性PV+ 细胞来源于MGE。MGE细胞在移植前也可快速高效地通过慢病毒进行转导。 15，使经过基因改造的细胞 体外 待研究 体内该方法的开发旨在克服研究GABA能皮层中间神经元发育与成熟过程中的障碍。特别是，MGE移植使研究人员能够研究突变细胞的发育过程 体内，而突变小鼠在此时间点本应已死亡。此外，通过在移植前引入目的基因，可高效评估特定基因对突变表型的影响。
本文提供了一种在移植前用慢病毒转导MGE细胞的详细方案。此外，我们展示了如何结合Cre依赖性表达慢病毒与现有的Cre驱动小鼠品系，将目的基因特异性地表达于异质性皮层中间神经元前体细胞中的特定中间神经元亚群。该方案还为研究人员提供了一种独特的方法和平台，用于对GABA能皮层中间神经元前体细胞进行遗传学改造，以开展in vivo研究。相比其他现有方法，该技术的一个优势在于移植后的MGE细胞会从注射部位向外迁移扩散。此外，与局灶性病毒注射不同，在MGE细胞分散后，其形态更易于观察和评估。该方法可用于研究将目的基因导入野生型或突变型细胞的影响，引入细胞类型特异性报告基因以评估细胞形态，或有望用于在in vivo条件下研究疾病等位基因的作用。

<table><tbody><tr><td colspan="4">MGE细胞移植所需的试剂与设备</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>30 1/2 G 针头</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson and company</td><td></td></tr><tr><td>精密微量注射针头，用于递送 5 &amp;micro;l（附带推杆）</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond scientific company</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>带臂式支架的体视显微镜 **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>数字式小鼠立体定位仪 **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>单轴油压精细操纵器 **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>金刚石涂层旋转切削仪</td><td></td><td>自制</td><td></td></tr><tr><td>针状移液器拉制仪</td><td>730</td><td>Kopf instruments</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td></td><td>任意药店或药房</td><td></td></tr><tr><td>可准确量取 1 &amp;micro;l 体积的移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** 上述为本研究中使用的特定型号，但其他类似设备亦可适用</td></tr><tr><td colspan="4">可选试剂（用于制备慢病毒）</td></tr><tr><td>25 mm，0.45 &amp;micro;m 滤膜</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管（25 x 89 mm）</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&amp;reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine &lt;sup&gt;2000 &lt;/sup&gt;（1.5 ml 规格）</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">其他市售试剂</td></tr><tr><td>编码 gag/pol 的 pMDLg/pRRE 质粒</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>编码 Rev 的 pRSV-Rev 质粒</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>编码 VSVG 的 pMD2.G 质粒</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

病毒介导的内侧神经节隆起（mge）细胞标记与移植 体内 研究

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

源自胚胎期内侧和尾侧神经节隆起（MGE 和 CGE）的 GABA 能皮层中间神经元在功能和形态上具有高度多样性。尽管在理解不同皮层中间神经元亚群的作用方面已取得进展，但仍有许多机制尚未阐明，这些机制可能参与不同类型 GABA 能细胞的发育与成熟过程。此外，GABA 能信号通路的异常可能与自闭症、精神分裂症和癫痫等疾病的表型相关。特异性的 Cre 驱动小鼠品系已开始用于解析独特中间神经元亚群的功能。然而，尽管小鼠模型取得了进展，利用分子生物学方法高效研究 GABA 能皮层中间神经元前体细胞仍面临挑战。

关键词：GABA 能神经元，皮层中间神经元，神经节隆起，MGE，CGE，Cre 驱动小鼠模型，自闭症，精神分裂症，癫痫，前体细胞，分子机制 体内一种用于研究这些细胞自主编程的重要技术是将MGE细胞移植到宿主大脑皮层中。这些移植的细胞能够广泛迁移、分化并实现功能性整合。此外，MGE细胞在移植前可高效地通过慢病毒进行转导，从而支持多种分子生物学研究方法。本文详细描述了一种在移植前高效转导MGE细胞的实验方案 体内 分析，利用现有的Cre驱动小鼠品系和Cre依赖性表达载体。该方法的优势在于，它将精确的遗传操作与这些细胞在移植后的广泛分布能力相结合，从而实现更高细胞类型特异性的解析度 体内.

由于MGE细胞在移植到宿主新皮层时具有独特的迁移和整合能力 16，它们为遗传操作提供了极佳的模型系统 体内 研究中。在此，我们展示了如何从E13.5胚胎中分离MGE组织（图1和图2），随后可用慢病毒进行转导 体外 或在移植前快速进行 体内 研究。此前已通过慢病毒对MGE进行标记，利用增强子在GABA能神经元中驱动GFP表达 15然而，在移植前于异质性细胞群体中特定亚群内表达基因的能力，将极大促进对这些细胞扩散与整合特性的研究。本文旨在建立一种方法，实现荧光蛋白在特定中间神经元亚群——即表达生长抑素（SST）的中间神经元——中的靶向表达。+.
我们首先亚克隆了一种市售的Cre依赖型GFP报告载体（载体信息， 表2将包含两侧带有 loxP 位点的 GFP 表达盒插入慢病毒载体骨架中。该载体的构建首先通过亚克隆从 AAV 载体中获取两侧带有 loxP 位点的 GFP 表达盒，随后将其连接至慢病毒载体骨架...

GABA能皮层中间神经元前体细胞在移植后可扩散、发育并突触整合到宿主皮层中。这些细胞在移植前易于进行转导，可用于基因修饰GABA能前体细胞的体内研究。本文展示了利用现有的Cre品系和Cre依赖型报告基因，通过病毒标记技术靶向特定中间神经元亚群的方法。

病毒介导的内侧神经节隆起（MGE）细胞标记与移植 体内 研究

源自胚胎期内侧和尾侧神经节隆起（MGE 和 CGE）的 GABA 能皮层中间神经元，在功能和形态上具有……

本实验的总体目标是在将GABA能神经元前体细胞（MGE细胞）移植到宿主体内进行体内研究之前，快速通过病毒转导对其进行标记。该过程首先从表达Cre的供体胚胎中分离MGE细胞；第二步是利用经过特定目的改造的病毒，对分离的MGE细胞进行快速而高效的标记，例如用于标记特定类型的细胞。接下来，将转导后的细胞移植到宿主体内，并使其在体内发育。最终可在适当的时间点利用气味显微镜或其他技术来评估被转导并移植的细胞。与直接注射病毒等其他技术相比，该方法的主要优势之一在于，MGE细胞会从注射部位（即损伤部位）迁移到较远的距离，从而使得研究人员能够在更接近正常生理的环境中对这些细胞进行研究。由于MGE细胞是皮层中间神经元的前体细胞，而这类细胞与自闭症、精神分裂症和癫痫等神经精神疾病相关，因此我们认为，本文所述技术将有助于揭示这些神经精神疾病的部分生物学基础。此外，该技术为在体研究提供了快速遗传修饰这些细胞的方法。按照书面实验方案中的指示，制备慢病毒并分离MGE后，收集双侧半球的MGE组织，并将组织放入两个含有500 µL含10% FBS的DMEM的1.5 mL收集管中。在所有组织收集完毕前，将样品保持在冰上。然后将试管转移至BSL二级认证的生物安全柜中。小心吸除上清液，避免扰动沉降至试管底部的MGE组织。随后加入约500 µL预热的含10% FBS的DMEM培养基。加入多聚脑至终浓度为每毫升8微克，并使用P1000移液器枪头吹打至形成单细胞悬液。然后向每管中加入15至20微升浓缩的慢病毒。接下来，将每管盖紧后轻轻颠倒混匀，随后将所有管子置于37摄氏度培养箱中。将细胞与慢病毒孵育至少30分钟，但不超过1小时，因为孵育时间过长会导致细胞活力下降。孵育结束后，每10分钟轻轻颠倒试管一次。从培养箱中取出试管，在4°C条件下以700 × g离心3分钟。在生物安全二级柜中沉淀细胞，移除上清液并弃入10%次氯酸钠溶液中。随后，加入1毫升含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基和retro。离心后，以重悬洗涤沉淀物两到三次。同前，重复此洗涤步骤两到三次，以去除过量病毒。最后一次洗涤后，尽可能吸除上清液，并将每支试管置于冰上，以避免管壁残留的培养基影响后续操作。在移植手术开始时，约有两到三微升的培养基会覆盖在细胞沉淀上。在整个操作过程中需确保无菌操作，用1毫升注射器吸取矿物油，然后使用30½号针头将玻璃移液管完全充满矿物油。接下来，将玻璃移液管连接至立体定位仪，并在助手协助下通过液压驱动装置将其装入推注器中。将活塞推入玻璃移液管约一半位置，用干净的纸巾擦去溢出的矿物油。接着，将无菌纸巾的一角捻成细尖，用其轻轻吸除mge细胞沉淀上方多余的培养基。这样可提高细胞密度，从而实现更小的注射体积。接下来，使用 P-2 移液器缓慢吸取细胞沉淀，并来回吹打一至两次，然后将其滴加到疏水表面上。体积应略小于 1

viral-mediated-labeling-transplantation-medial-ganglionic-eminence

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

病毒介导的标签和内侧神经节隆起移植（MGE）细胞<em&gt;在体内</em&gt;研究

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

在此，我们开发了所需的工具 离体...

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

本视频展示了内侧神经节隆起（MGE）细胞的病毒标记及其移植，用于体内研究。该方法概述了使用病毒报告基因转导MGE细胞、将转导后的细胞移植到幼鼠大脑皮层，以及在特定中间神经元亚型中实现报告基因表达的各个步骤。...

病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记及其体内研究中的移植

来源：Pereira, M. et. al., 通过脑内注射病毒载体在体内直接重编程常驻胶质细胞为中间神经元。J. Vis. Exp.

小鼠模型中胶质细胞重编程的立体定位病毒载体注射

来源：Denaxa, M., et al.，化学遗传学改造的皮层中间神经元前体移植至出生后早期小鼠大脑。J. Vis. Exp.

琼脂糖包埋电穿孔辅助的基因转移技术在小鼠皮层中间神经元前体细胞中的应用

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

本文提供了一种低成本且可靠的方法，可从小鼠胚胎制备适用于共聚焦显微镜和活体成像技术的电穿孔脑组织切片培养物。...

Ex Utero 电穿孔及胚胎小鼠脑组织切片培养用于迁移性GABA能中间神经元的活体成像

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。...

通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。...

高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究G蛋白偶联受体介导的T细胞在多种组织微环境中的定位

了解病毒介导的内侧神经节隆起细胞标记与移植技术，用于GABAergic中间神经元亚群的体内研究。该方法支持神经精神疾病机制探索与神经修复研究。

病毒介导的内侧神经节隆起（MGE）细胞标记与移植体内研究

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