Name: 琼脂糖微室的长期钙成像秀丽隐杆线虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学习使用琼脂糖微流控室对秀丽隐杆线虫进行长期钙成像技术，监测其行为发育与神经活动。该方法可在不同生命阶段实时记录钙瞬变信号，为神经科学研究提供高通量成像方案。

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本工作由马克斯·普朗克学会以及哥廷根研究生院青年研究组向 H.B. 提供的奖学金资助。

1. 仪器、培养基和培养皿
<ol>
	<li>使用能够保持样品聚焦的显微镜，并配备自动载物台。自制一个加热盖玻片装置，或购买商用产品。根据制造商的说明，搭建一个LED-EMCCD相机系统，通过TTL信号使相机曝光触发LED照明。 
	注意：参见 讨论 详情请见。</li>
	<li>聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章：
	<ol>
		<li>在微流控实验室中制备PDMS印章，或委托商业代工厂加工PDMS印章。若采用商业代工厂，需向公司发送AutoCAD文件，并注明器件深度（例如15 µm）。收到代工厂交付的PDMS芯片后，使用手术刀将其切割为16个独立的PDMS印章。</li>
		<li>使用空气等离子体将每个独立的印章与载玻片键合。键合时，将PDMS印章和载玻片均暴露于空气等离子体中约1分钟（采用最高等离子体设置，气压为0.5 mbar）。确保在等离子体处理过程中，用于键合的表面朝上。然后，将PDMS印章置于载玻片上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取一个3.5 cm的底部培养皿，使用立式铣床和锋利的旋转切割刀具，从皿底中心切出一个18 × 18 mm的方形区域。切割时应采用较低的转速和缓慢的进给速度，以防止因摩擦生热导致塑料熔化。可一次性制备多个培养皿。 
	注意：实验结束后，若将底部培养皿在纯乙醇中浸泡过夜并清洗干净，则可多次重复使用。</li>
	<li>琼脂糖：
	<ol>
		<li>将3 g高熔点琼脂糖溶于100 ml S-Basal（5.85 g NaCl，1 g K2HPO4，6 g KH2PO4，1 ml 胆固醇（5 mg/ml，溶于乙醇），H2O至1 L，通过煮沸溶解，高压灭菌。将溶解的琼脂糖分装至2 ml离心管中，保存备用。同样，以与高熔点琼脂糖完全相同的方法制备一批低熔点琼脂糖。</li>
		<li>使用前，将3份高熔点琼脂糖置于95 - 98 °C的加热块上。使用前，将1份低熔点琼脂糖置于95 - 98 °C的加热块上，待其完全融化后，再转移至30 - 35 °C的加热块上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物的选择
<ol>
	<li>在接种过的NGM平板上以低密度培养线虫，以获得干净的个体。确保平板上有充足的食物且线虫数量较少。</li>
	<li>若需成像L1幼虫，将约30个处于“豆形”阶段的胚胎卵转移至新的接种NGM平板上。若需转移后期幼虫或成虫秀丽隐杆线虫（C. elegans），则将约30条线虫转移至新的接种NGM平板上。</li>
</ol>
3. 琼脂糖微室的制备
<ol>
	<li>培养皿的制备：
	<ol>
		<li>取一个底部带有 18 × 18 mm 方形开口的塑料培养皿，将其倒置，使开口朝上。用一片 20 × 20 mm 的双面胶带封住开口。将培养皿翻转，使胶带位于底部，并将培养皿放置在坚硬的表面上。使用解剖刀将开口处的胶带切开，露出开口。</li>
		<li>使用 P1000 移液器，向培养皿中加入 2 ml 含 3% 高熔点琼脂糖的 S-Basal 溶液。将琼脂糖加在围绕开口的区域，静置使其凝固。等待琼脂糖完全固化。</li>
		<li>将培养皿翻转，撕去覆盖在双面胶带上的保护膜，使胶带的粘性面保留在培养皿底部并暴露出来。 
		注意：结果是在开口外侧形成一圈细小的粘性胶带环。琼脂糖起到保湿储液的作用，后续将包围样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微腔室的成型：
	<ol>
		<li>将用于成型的 PDMS 表面用空气等离子体处理 20–60 秒。 
		注意：该等离子体处理使 PDMS 表面变为亲水性，可防止气泡滞留，并获得更清晰的印模。</li>
		<li>通过堆叠 5–9 片载玻片，制作两个等高的垫片。将第一个垫片堆叠体、单片载玻片和第二个垫片堆叠体依次平行于其长边放置。将带有 PDMS 印模的载玻片垂直跨放在垫片上。调节垫片高度，使 PDMS 印模的成型面与单片载玻片之间保持约 1.5 mm 的间隙。</li>
		<li>在单片载玻片上靠近 PDMS 印模处滴加一滴热的液态高熔点琼脂糖，迅速将 PDMS 印模垂直插入液态琼脂糖中。静置使其凝固，观察其变为不透明状态，通常需要约 2 分钟。一次性垂直向上提起印模。 
		注意：使用双面胶带将垫片载玻片粘合在一起较为方便。印模的垂直移动可防止气泡被困在琼脂糖中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细铂丝挑取卵或线虫，并连同 OP50 细菌一起转移到琼脂糖表面。用睫毛工具将每个卵或每条线虫连同食物分别分配至独立腔室中。在一块琼脂糖垫上放置约 30 个卵。</li>
	<li>将含有已填充微腔室的琼脂糖块切割成约 15 × 15 mm 的正方形，使其恰好适配培养皿的开口。用镊子夹起该琼脂糖方块，倒置放置在 20 × 20 mm 的玻璃盖玻片上。一旦放置，不要再抬起或移动，以免将细菌和线虫推出腔室。</li>
	<li>培养皿的组装：
	<ol>
		<li>将玻璃盖玻片放置在塑料培养皿的开口上，轻轻按压使其与双面胶带形成的环紧密贴合。注意不要压碎玻璃。</li>
		<li>将培养皿倒置，使用 P1000 移液器将约 30 °C 的液态低熔点琼脂糖注入含有微腔室的琼脂糖块与周围琼脂糖储液区之间的空隙中。等待琼脂糖完全凝固。</li>
		<li>用盖子密封培养皿。对于倒置显微镜，使用加热盖；对于正置显微镜，使用普通盖子，并用 Parafilm 密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成微腔室制备后，在体视显微镜下检查。正确的填充至关重要。详见讨论部分。</li>
</ol>
4. 钙成像
<ol>
	<li>使用表达遗传编码钙离子传感器的转基因品系，例如 HBR16（goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]）27。</li>
	<li>使用配备宽场落射荧光装置的复合显微镜。将 EMCCD 相机的 TTL 输出端连接至 LED 的 TTL 输入端，使每次相机采集图像帧时样本同步被激发照明。曝光时间约为 5 毫秒，EM 增益设置在 50–300 范围内。</li>
	<li>设定连续成像程序，持续 24 小时，每 15–30 分钟对每条线虫成像一次：首先以微分干涉差（DIC）模式采集 20 秒图像，随后以 GFP 荧光模式采集 20 秒图像以记录 GCaMP 信号，最后采集一次 mKate2 信号图像用于校正表达水平。每次成像 burst 阶段的帧速率为每秒 2 帧。</li>
	<li>进行可视化数据检查时，使用伪彩图以增强荧光强度微小变化的可见性。将荧光数据以 ΔF/F 形式绘图，其中 F 表示荧光基线的平均值。钙成像数据分析的详细描述可参见相关文献20。</li>
</ol>
5. 多条线虫的并行 AMI
<ol>
	<li>将含有微室的培养皿置于显微镜载物台上，聚焦样品并启用自动对焦功能。设置软件程序，使相机每隔半小时采集一次图像，每次在20秒内连续获取40帧图像，持续24小时，最终每条线虫获得1,920帧图像，数据量合理。设置扫描程序，通过载物台移动依次访问每个线虫。单次实验建议拍摄约30条线虫。</li>
	<li>通过缩小视野拍摄多条蠕虫的图像， 即， 使用较低放大倍数，使相机芯片覆盖多个微室，并同时拍摄若干相邻的微室。图像采集结束后，通过裁剪出包含单个动物的感兴趣区域，将每个微室的数据分开。</li>
	<li>为快速评估运动数据，使用帧间相减法28-32.</li>
</ol>
6. 成像秀丽隐杆线虫（C. elegans）的不同生命周期阶段
<ol>
	<li>使用琼脂糖微室培养从 L1 到成虫各个生活阶段的秀丽隐杆线虫（C. elegans），包括休眠幼虫（dauer）。不同生活阶段应采用 Table 1 中所示的相应微室尺寸。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>生命阶段</td>
			<td>腔室尺寸</td>
			<td>腔室深度</td>
			<td>典型记录时间</td>
			<td>放大倍数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>190 x 190 μm</td>
			<td>10 - 15 μm</td>
			<td>卵 - 中期L2</td>
			<td>400X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>370 x 370 μm</td>
			<td>15 μm</td>
			<td>卵 - L3</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>滞育幼虫</td>
			<td>370 x 370 μm</td>
			<td>25 μm</td>
			<td>4天</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>700 x 700 μm</td>
			<td>45 μm</td>
			<td>L2 - L4</td>
			<td>200X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>700 x 700 μm</td>
			<td>45 μm</td>
			<td>早期L4 - 年轻成虫</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>年轻成虫</td>
			<td>700 x 700 μm</td>
			<td>45 μm</td>
			<td>12 - 24小时</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 不同生命阶段的腔室尺寸 如图所示 适用于8 x 8 mm相机芯片、针对不同阶段优化的腔室尺寸和放大倍数。

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li>
<li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li>
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<li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li>
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<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li>
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<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li>
<li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons%3A+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li>
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<li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch%2C+regulated+by+Galphas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782(2013).</li>
<li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dauerlarva%2C+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li>
<li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

硬件
在长时间图像采集过程中，显微镜的焦平面通常会发生漂移。对于复式显微镜，可从主要显微镜制造商处购买焦平面维持系统。如果带有焦平面控制功能的复式显微镜价格过高，一种简单的替代方案是使用体视显微镜。复式显微镜可使用高数值孔径（NA）的物镜，并且易于实现自动化。40倍油镜非常适用。水浸物镜并不理想，因为在长时间成像过程中会发生蒸发。微分干涉差（DIC）成像可提供良好的对比度，有助于观察形态学和行为学变化，但也可以使用简单的明场成像。对于DIC或明场成像，可通过在显微镜透射照明光路中插入红色滤光片来使用红光。若需扫描多个微室，则必须配备自动载物台。当使用具有非线性加速和减速功能的载物台，并将其设置为低扫描速度时，可获得最佳性能，从而在扫描过程中避免干扰实验动物。我们在扫描过程中未观察到机械敏感性神经元（ALM 和 PLM）出现行为反应或钙信号升高，表明缓慢扫描确实不会激活线虫的机械敏感系统（数据未显示）。可使用商用LED系统。多家公司提供包含不同波长LED的即用型解决方案。LED应具备通过TTL信号进行外部触发的功能。对运动动物进行钙成像时需要使用高灵敏度相机。EMCCD相机是目前市场上最灵敏的相机。相机在曝光期间需要具备TTL输出（也称为“触发”输出）。如果使用倒置显微镜，则需要使用盖板加热器，以防止盖板上产生冷凝水。在正置显微镜上，培养皿的放置方式使得盖板位于底部，从而避免冷凝水形成，因此无需加热盖板。盖板应紧密封闭培养皿，以防止长时间成像过程中水分蒸发。
PDMS 印模
含有用于 molding 琼脂糖结构的 PDMS 印模表面应背向支撑 PDMS 印模的玻璃载片。有关提供定制微流控芯片公司的列表，可参见 Wikipedia（<a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a>）。
将线虫填充到其培养室中
这是实验方案中最关键的步骤，需考虑以下几点：A）琼脂糖的湿润程度对于线虫的转移和成像至关重要。如果琼脂糖过于湿润， 即， 若有液体覆盖多个微室区域，则无法以受控方式分配细菌食物和线虫，因为液体会导致细菌流失。若琼脂糖过于干燥，则细菌和线虫可能难以从挑针上脱落，这意味着需要施加更大的力来释放线虫和细菌，容易造成琼脂糖损伤。在大量填充线虫时，琼脂糖可能会变干，严重时最终导致琼脂糖过度干燥，微室塌陷。若琼脂糖过干，可通过在芯片侧面无虫区域滴加一小滴（约2 µl）S-Basal溶液进行再水化处理，然后将铂金丝挑针浸入液体中，并将部分液体引导至已填充线虫的微室区域。B）食物量对成功进行长期成像至关重要。若食物不足，线虫可能很快耗尽食物；若食物过多，微室腔体将表现得更像固体而非液体，线虫可通过推动细菌团块而逃出微室。应使细菌悬浮液恰好充满整个微室。实验过程中，线虫大部分体长持续与琼脂和玻璃表面接触，其爬行行为类似于在培养皿表面的运动，而不像在液体中的剧烈摆动。C）机械性损伤琼脂糖会破坏实验。使用精细的挑针至关重要，其末端不应有尖锐棱角。可选用将柔软睫毛固定于移液器吸头上的工具代替铂金丝挑针，以将细菌或线虫移入微室。然而大多数情况下，琼脂糖过度干燥才是造成损伤的主要原因。理想情况下，挑针或睫毛应仅轻微接触琼脂糖表面，依靠琼脂糖表面的水膜将线虫和细菌带走。在封闭微室时，琼脂糖的湿度同样关键。琼脂糖表面不应存在游离液体，否则在封闭过程中可能导致细菌和线虫被冲走。较大的气泡可通过轻轻抬起琼脂块一角的方式去除。小于微室的小气泡常会被困在微室内，但此类小气泡通常无碍，会通过吸收逐渐消失。组装完成后，应再次检查琼脂糖湿度是否适中，既不过干也不过湿。微室应良好密封，各微室之间不应有液体流动。若琼脂糖过湿，微室无法有效密封，线虫可能逃逸或食物被冲走。若样品过湿，可简单打开盖子，让琼脂糖干燥一至两分钟；若琼脂糖过干，微室可能塌陷，导致线虫逃逸。
通过拉远视角实现规模化
对于荧光成像，放大倍数降低时获得的光量较少，限制了视野的扩大。此外，EMCCD相机针对灵敏度进行了优化，通常分辨率相对较低。然而，将成像视野扩大四倍是完全可行的。例如，当使用140倍放大倍数（通过20倍物镜和0.7倍相机接筒实现）以及512 × 512像素、8 × 8 mm的相机时，四个190 µm × 190 µm的腔室可以同时容纳在一个成像画面中。采用具有大芯片的高分辨率相机（如sCMOS相机，芯片尺寸为16.6 mm × 14 mm，分辨率为2560 × 2560像素 = 550万像素）可显著优化微分干涉差（DIC）和明场成像的视野扩展能力。例如，在使用100倍放大倍数时，每帧图像可容纳多达30条位于190 µm × 190 µm腔室中的L1期线虫（见图3）。原则上，还可以结合视野扩大与扫描技术，以实现更高数量的动物成像。大多数神经元能较好地保持在焦平面内，因此通常只需采集单一焦平面的图像即可。若发现神经元偏离焦平面，可在每个时间点使用压电驱动器进行z轴扫描。
适应不同行为
该方案能够较好地反映长时间尺度下的行为特征。显然，爆发性行为的时间安排需要根据不同行为和生命阶段进行调整。
该技术的局限性
多个因素限制了成像的持续时间。其中最重要的是食物的量。一旦食物被消耗完，幼虫就会停止发育。因此，在较小的腔室（190 × 190 µm）中，线虫可发育至L3阶段，随后停止生长。如果需要更长的成像时间，则必须使用更大的腔室。长期成像的最长时间约为2.5至3天。若需更长时间的成像，需将线虫回收并转移至新的腔室中。在对成年线虫进行成像时，另一个限制因素是其后代。成年线虫会产卵，卵孵化为幼虫。这些幼虫也会停留在腔室内，消耗食物，并可能干扰图像分析。如果后代造成问题，解决方案包括使用不育的成年线虫，或反复将线虫转移至新的腔室。回收线虫时，需用解剖刀将含有腔室的琼脂糖块切下，从盖玻片上取下，并转移至NGM平板上，以便回收线虫。另一个限制是线虫被限制在相对较小的区域内。如果需要分析长距离运动，这可能成为一个问题。尽管腔室内的动物可通过机械或光遗传学方法进行刺激21,27,34,35，但由于腔室是密封的，施加可溶性或挥发性刺激物将较为困难。生物上重要的气体（如氧气或二氧化碳）可在琼脂中自由扩散。培养皿中的大气储存空间应能维持腔室内气体浓度在实验所需时间内的稳定。然而需要注意的是，腔室内的局部氧浓度可能更接近液体培养而非平板培养的条件。
相对于现有方法的意义
微流控装置极大地推动了对C. elegans行为与发育的研究。通常，微流控结构由PDMS12制成。本文描述了一种利用琼脂糖制备微流控培养腔的实验方案。该技术的优势在于兼具高成像质量、行为与生理测量之间的相关性、长期成像能力以及相对较高的通量。通过使用高数值孔径（NA）物镜经由玻璃盖玻片进行成像，可实现高质量图像。因此，可进行荧光成像，如钙成像以及亚细胞结构的共聚焦成像。由于动物未被固定，不同于其他系统，因而能够实现行为与生理测量之间的关联分析。由于动物拥有充足的食物，其发育过程得以持续，从而支持长期成像。该系统可在一次运行中同时对多只线虫进行成像，因为动物被限制在各自独立的腔室内。因此，该方法易于实现规模化9,27,34-36。
未来应用
到目前为止，该系统主要用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）L1幼虫的睡眠行为。然而，若将其适应于所有发育阶段，将有望用于研究滞育幼虫和成虫的多种行为。利用该技术可研究一系列行为，从交配到产卵均可涵盖。

Caenorhabditis elegans 已被确立为研究行为的模式系统1。由于其适用于遗传学研究，因此可用来探究行为背后的分子与细胞机制。许多行为发生在较长的时间尺度上。有两种主要方法可用于在长时间尺度上观察运动中的动物。第一种方法是利用自动化的载物台或相机在动物移动过程中对其进行追踪2-8，第二种方法是将动物的活动范围限制在至少不超出相机视野的范围内9-14。这两种方法各有优势。追踪法允许在较大的空间范围内持续观察单个动物，但限制了单次实验中可分辨的动物数量。而限制动物运动的方法则可通过使用多个受限小室的阵列，实现对大量个体的同时观察，从而提高实验通量。
由于线虫是透明的，因此可以对其活体进行无创的荧光成像15。钙成像可作为可兴奋细胞活动的功能性读出手段，并已在C. elegans中建立并广泛应用16-20。钙离子通过质膜上的通道进入细胞，这些通道在去极化时开放。因此，钙信号可作为神经活动的间接指标。钙传感器主要分为两大类：比率型传感器和非比率型传感器。这两类传感器均利用钙结合蛋白在结合钙离子后发生的构象变化。比率型传感器包含两种荧光蛋白，当激发波长较短的荧光蛋白时，部分光能量会以荧光共振能量转移（Förster共振能量转移，FRET）的方式传递给波长较长的荧光蛋白，其能量传递效率取决于两者之间的距离21。非比率型传感器基于环状重排的绿色荧光蛋白（GFP），通过钙离子结合引起荧光基团去淬灭来实现检测22。两类传感器各有优势：比率型传感器对运动或表达异常等干扰因素不敏感，而非比率型传感器通常具有更高的动态范围。在C. elegans中，比率型和非比率型传感器均已成功用于研究可兴奋细胞的活动16-20,23,24。
进行长期荧光成像时，实验人员需要应对若干潜在挑战：1. 激发光对行为的干扰：线虫对短波长的荧光激发光敏感，会回避用于钙成像的紫光至蓝光范围的光照25,26，其反应表现为后退或前进的逃避行为25,26。因此，必须严格控制光照强度。2. 荧光传感器蛋白的漂白：荧光蛋白的漂白常会影响长期成像。然而，通常导致漂白所需的光照强度远高于对动物行为产生干扰的光照强度，因此在此类钙成像中，漂白仅是一个理论上的问题。3. 微室中的线虫未被固定，在清醒状态下持续运动，若不加以固定，图像可能出现模糊。上述所有挑战均可通过极短的曝光时间和低光照强度加以解决。这可通过使用高灵敏度的EMCCD相机配合短曝光时间，并结合发光二极管（LED）的外部触发来实现。为了使线虫暴露于照明光的时间尽可能短（仅在相机曝光期间），利用相机在曝光时发出的晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号对外部LED进行触发，从而使线虫被照亮的时间精确等于相机芯片的曝光时间。这也意味着EMCCD芯片在数据读出期间处于无光照状态，有利于该芯片的最佳读出性能。
此前，已开发出用于对C. elegans幼虫进行长期荧光成像的琼脂糖微室9。本文介绍如何利用琼脂糖微室对C. elegans任意生命阶段进行长期钙成像，如何实施钙成像，以及如何将该方法扩展以实现对多个个体线虫的并行检测。

<table><tbody><tr><td>高熔点琼脂糖</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>低熔点Top Vision琼脂糖</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED照明系统</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>复合显微镜</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>现售型号为iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>盖片加热器</td><td>MPI workshop</td><td>定制制作</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>显微镜Z轴载物台</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>显微镜X-Y轴载物台</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS印章</td><td>Abbott Laboratories</td><td>定制制作</td><td></td></tr><tr><td>红光滤光片</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm培养皿</td><td>Falcon</td><td>Falcon一次性无菌培养皿，Corning</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>双面25 mm × 33 m</td><td>也可使用Rubance Adhesives提供的Advance双面胶带。</td></tr></tbody></table>

用于长期钙成像的琼脂糖微室培养秀丽隐杆线虫 caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

行为由神经系统控制。在透明的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，钙成像是一种测量各种行为期间神经元活动的简单方法。为了将神经活动与行为相关联，动物不应被固定，而应能够自由移动。许多行为变化发生在较长时间尺度上，需要持续记录数小时的行为。这也要求在有食物存在的条件下培养线虫。如何在长时间尺度上培养线虫并成像其神经活动？此前已开发出琼脂糖微室成像技术（AMI），用于培养和观察小型幼虫，目前该技术已被改进，可用于研究从早期L1阶段到成虫阶段的秀丽隐杆线虫（C. elegans）所有发育阶段。AMI可应用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的各个生活阶段。通过使用外部触发的短时间曝光结合电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机记录，可在不固定动物的情况下实现长期钙成像。通过缩小放大倍数或进行扫描，该方法可扩展至同时成像多达40条线虫。因此，本文描述了一种可在秀丽隐杆线虫（C. elegans）所有生活阶段实现长时间尺度下行为与神经活动成像的方法。

琼脂糖微室可应用于 C. elegans 的任何生活阶段。如图1A所示，可观察幼虫发育过程以及L1静息期的睡眠行为。图中所示微室尺寸为190 × 190 µm，深10 µm。若需要更长时间的观察，可使用更大的微室。如图1B所示，使用尺寸更大的微室（370 × 370 µm，深25 µm）可实现 C. elegans 从卵发育至成虫阶段。图1C展示了利用帧差法对微室内从卵发育至成虫的线虫进行长期行为变化分析的结果。图中显示了在清醒期和静息期特定爆发阶段经帧差法处理后的平均强度值。帧差后平均强度值越低，表明线虫活动性越低。图中展示了每个幼虫阶段分别选取的一个清醒状态和一个静息状态的典型爆发轨迹。发育过程中平均强度的升高主要归因于动物个体对比度和体型的增加。图1D展示了一条滞育幼虫（dauer larva），这是在不利环境条件下进入的一种替代生活阶段33。所用微室尺寸为370 × 370 µm，深15 µm。需注意，滞育幼虫被置入微室时未添加细菌食物，以避免其退出滞育幼虫阶段。图1E展示了一条已在微室内产下多个卵的成虫。用于成虫的微室尺寸为700 × 700 µm，深45 µm。最后，图1F展示了一条雌雄同体成虫与雄虫在成虫微室内交配的情景。
利用GCaMP钙离子传感器可对运动中的线虫进行钙成像。图2A,B展示了L1幼虫的指令性中间神经元AVA的钙成像结果27。图2C,D展示了成年个体中同类型神经元的钙活动。
通过扫描和缩小放大倍数，可以实现长期成像的规模化扩展。图3A展示了使用500万像素相机在一个相机芯片上同时对30条线虫进行成像的图像质量。图3B展示了同时对4条线虫进行钙成像的图像质量。
<img alt="C. elegans life stages microscopy images, mobility analysis graph, showing larvae development, 200x-400x." src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. AMI在所有生命阶段的适应性 秀丽隐杆线虫. (A从早期L1阶段到早期L2阶段对幼虫进行成像，放大倍数为190倍 190 µm 腔室。B) 从卵发育至成虫，历时370 x 370 µm 室。C通过帧间减影法评估蠕虫的运动性。图中显示的是在清醒和静息期行为期间，每个幼虫阶段选定的一段爆发性运动视频经帧间减影处理后所有图像的平均强度。D无食物条件下的一条dauer幼虫，大小为370 x 370 µm 室。E) 成年雌雄同体个体，已产下大量卵，置于700 x 700 µm 室。F) 雄性与雌雄同体个体在700 x 700 µm 室。YA 表示年轻成年。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用 AVA/AVE 信号强度图在 400x、100x 下进行荧光显微镜比较分析。" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 使用 AMI 进行钙成像。 （A）利用 nmr-1 启动子在 L1 幼虫的指令中间神经元 AVA 中进行 GCaMP3 钙成像。图中显示了两张伪彩图像。左侧图像中，AVA 的活性较低，线虫未进行后退运动；右侧图像中，AVA 的活性升高，线虫正在向后移动。（B）L1 期线虫随时间变化的钙瞬变。（C,D）成年线虫中的钙瞬变。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微室阵列中秀丽隐杆线虫的显微镜图像，显示L1和L3幼虫，100倍放大。" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通过缩小视野实现多条线虫的并行成像。（A）使用190 × 190 µm的微室和100倍放大倍数（采用10倍物镜）以及16.6 × 14 mm的相机芯片，每帧同时成像30条L1期线虫。（B）使用370 × 370 µm的微室，在100倍放大倍数下，利用16.6 × 14 mm相机芯片的感兴趣区域，每帧同时成像4条L3期线虫。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

在不固定动物的情况下，对行为和神经活动进行长时间尺度的成像，是理解行为的前提。琼脂糖微流控腔成像（AMI）可用于对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）所有生命阶段的神经活动和行为进行成像。

用于长期钙成像的琼脂糖微室培养秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans

行为由神经系统控制。在透明的线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，钙成像是一种用于测量……的简单方法。

以下实验的总体目标是监测多只成年秀丽隐杆线虫的行为发育和神经活动。通过将线虫培养在充满食物的微流控腔室中来实现该目标。使用EMCCD相机并结合TTL触发的短曝光时间进行长期钙成像。该实验可通过依次扫描多个腔室或同时拍摄多个腔室来扩大规模。实验结果可展示幼虫和成虫的行为以及指令中间神经元的钙瞬变。这种微型腔室技术的主要优势在于，能够长期连续观察行为与发育过程，并实现高质量成像。该方法的可视化演示至关重要，因为向微腔室中添加适量的食物和保持适宜温度较难掌握。首先，设置配备有顶盖加热器、自动载物台和电子倍增电荷耦合器件（E-M-C-C-D）相机系统的显微镜。在微流控实验室或通过商用代工厂制备聚甲基戊烯印章。使用手术刀将PDMS芯片切割成16个独立的印章。接着，将印章和载玻片均暴露于空气等离子体中约一分钟，然后将印章贴附到载玻片上。操作时应缓慢进行，以避免熔化塑料。从3.5厘米培养皿底部切出一个方形区域。一次性准备多个培养皿。使用前，准备好高熔点和低熔点琼脂糖的无菌分装 aliquot。将三份高熔点气凝胶置于加热块上。此外，在转移至另一个加热块前，先熔化一份低熔点气凝胶。首先，取之前制备好方形开口的塑料培养皿，将其倒置，使开口朝上。使用一小段双面胶带覆盖开口。将培养皿翻转，使双面胶带位于底部，并将培养皿放置在坚硬的表面上。用手术刀将开口处切割开来。接下来，用 2 mL 高熔点琼脂糖填充开口周围的区域。等待琼脂糖凝固。凝固后，移除覆盖在另一侧双面胶带上的保护膜。这将形成一个细小的粘性胶带环，环绕在开口的外侧。琼脂起到保湿储层的作用，之后会包围样品。在构建微型腔室之前，通过将PDMS印章表面暴露于空气等离子体中20至60秒来对其进行处理。通过堆叠五到九片玻璃片，制备两个等高的垫片。将一片玻璃片放置在两堆垫片之间。随后将带有PDMS印章的玻璃片横跨在垫片上。调整垫片的高度，使成型表面与玻璃载玻片之间保持 1.5 毫米的间隙。准备就绪后，将一滴高温高熔点 aros 滴加到靠近 PDMS 印模的载玻片上，迅速将印模水平滑入液态 aros 中。待 aros 凝固并呈现不透明状态后，一次性垂直向上揭下印模。使用细铂金丝挑取卵或线虫，并连同 OP 50 菌一起转移到 aros 上。用睫毛将每个卵或每条线虫连同食物分配至单独的腔室中。每个 aros 垫上应包含约 30 条线虫。将含有微室的琼脂糖块切成方形，使其恰好适合培养皿的开口。用镊子提起琼脂糖块，并将其倒置放置在玻璃盖玻片上。一旦放下，切勿再次抬起或移动盖玻片，以避免将微室中的内容物推出。现在将小室密封。接下来，将盖玻片放入塑料培养皿的开口中。轻轻按压盖玻片，使其贴合在双面胶带形成的环上。注意不要弄破玻璃。将培养皿倒置，使用低熔点琼脂糖填充琼脂糖凝胶板与琼脂糖贮液池之间的缝隙，待琼脂糖凝固后。用盖子和封口膜密封培养皿。完成微室的制备后，应在体视显微镜下正确检查微室。填充微室并控制湿度是实验成功的关键。开始时，将含有微室的培养皿放置在显微镜上，并对样品进行聚焦，每半小时以20秒时间记录40帧图像，持续24小时。接下来，设置扫描程序，使其通过载物台依次访问每条线虫。每次运行应拍摄约30条线虫。通过缩小放大倍数，可对多条线虫进行成像。使用较低倍率以覆盖多个微室，并同时对多个相邻的微室进行成像。图像采集结束后，通过裁剪覆盖单个动物的感兴趣区域，将每个微室的数据分开。可通过帧间差减法快速评估运动性数据。成像后，在配备宽场落射荧光功能的复式显微镜上进行钙成像。为限制光照暴露，使用晶体管-晶体管逻辑信号触发LED照射样品，同时相机记录一帧图像。进行持续24小时的爆发式成像，每隔15至30分钟拍摄每条线虫一次。首先用微分干涉差显微镜（DIC）记录20秒。然后用 GFP 荧光成像 20 秒。最后，获取 MK2 信号的图像以检测对照组的表达水平。在进行可视化数据检查时，使用伪彩图以增强荧光强度微小变化的可见性。最后，使用标准流程进行钙成像数据分析。本示例展示了幼虫行为。使用尺寸较大的培养室可实现从卵到成虫的长期发育，此处展示了行为的变化。这种dauer幼虫阶段是在不利环境条件下出现的一种替代性生活阶段。这条成虫线虫已在腔室内产下大量卵。最后，这张图片显示了一条成年雌雄同体线虫与一条雄虫在成年虫腔室内进行交配。此处展示了L1幼虫期AVA命令中间神经元的钙成像。这些图像显示了成年动物中同类型神经元的钙活动。通过扩大长期成像规模，可在同一个相机芯片上对30条线虫进行成像。在尝试该实验操作时，重要的是要向小室中加入适量的食物，并确保琼脂糖的正确操作。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对海葵虫不同生命阶段进行微室成像。

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神经元钙处理的亚细胞成像 在体

体内可视化受精及早期发育过程中的钙瞬变 秀丽隐杆线虫

学习使用琼脂糖微流控室对秀丽隐杆线虫进行长期钙成像技术，监测其行为发育与神经活动。该方法可在不同生命阶段实时记录钙瞬变信号，为神经科学研究提供高通量成像方案。

用于长期钙成像的琼脂糖微室培养秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans

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