Name: 评价疗效小时。幽门螺杆菌蛋白HP-NAP为膀胱癌的治疗在原位小鼠模型的治疗工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 了解如何利用原位膀胱肿瘤小鼠模型评估幽门螺杆菌蛋白HP-NAP的抗膀胱癌疗效。该方法通过组织学和免疫组织化学分析验证治疗效果，为癌症免疫治疗研究提供可靠的实验平台。

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本工作由意大利癌症研究协会、意大利大学与研究部、Prin项目和大学研究项目（资助编号：N）提供支持&#176; CPDA137871，Fondazione Cariplo，资助编号 N&#176; 2011-0485号资助予MdB，以及帕多瓦大学青年学者资助予Gaia Codolo。

所有动物操作程序均已获得意大利卫生部批准（D.M. 204/2011-B）。
1. 动物
<ol>
	<li>培养&#8203; 将C57BL/6J雌性小鼠在带微隔离过滤器的独立通气笼具中饲养至8周龄。 
	注意：优先选择雌性，因为其外泌尿生殖器官的解剖结构使得导管插入比雄性更容易。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>在添加了10%热灭活胎牛血清和50 µg/ml庆大霉素的RPMI 1,640培养基中，于37 °C、湿润的5% CO2条件下培养小鼠膀胱移行细胞癌MB49细胞系。</li>
	<li>将MB49细胞在T-75培养瓶中培养至80%汇合度。消化后重悬于150 μl PBS中，调整细胞密度为0.5 × 105 - 0.5 × 106 个细胞，用于小鼠体内接种。</li>
</ol>
3. 膀胱内肿瘤植入
<ol>
	<li>通过腹腔注射 zoletil（33 mg/kg）和 xylor（20 mg/kg）的混合麻醉剂对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>将动物置于仰卧位，并用透明胶带将其后肢固定在垫子上。足部需充分分开，以便尿道外口清晰可见且易于插入导管。</li>
	<li>注意：对于8至10周龄的小鼠，导管插入可选用24 G儿科静脉导管。导管的选择至关重要，以避免液体在尿道壁与导管之间泄漏。对于体型较大或年龄较大的小鼠，应使用管径更大的导管。</li>
	<li>使用小型镊子夹住尿道外口的一侧边缘，并轻轻向小鼠“头部方向”扭转，以暴露尿道外口。</li>
	<li>取出导管内的金属内芯，将导管以45°角插入尿道，方向略微朝向小鼠“尾部方向”。切勿强行插入导管；如遇阻力，可轻轻旋转导管，直至其顺利滑入尿道。当导管插入约0.5–0.8 cm后，小心地将导管调整至与小鼠尾部平行，并完全插入。</li>
	<li>使用1 ml注射器（针头插入导管中），注入200–300 μl无菌PBS冲洗膀胱内残留尿液，并将所有液体从膀胱中吸出。</li>
	<li>注意：注入PBS时，膀胱会充盈并在小鼠后肢之间出现明显肿胀，表明导管插入位置正确。大多数导管存在死腔体积，在计算注射量时必须予以考虑。</li>
	<li>使用无菌1 ml注射器，向膀胱内注入200 μl 0.1 N HCl，使膀胱充盈以损伤其整个膀胱壁。10秒后，吸出全部酸液，并立即使用无菌注射器注入200 μl 0.1 N NaOH进行中和。若注射细胞数量最多（0.5 × 106），则无需进行酸化步骤。</li>
	<li>吸尽所有残留液体后，立即用300 µl无菌PBS冲洗膀胱腔。</li>
	<li>通过抽吸排空膀胱，然后注入含MB49细胞（数量范围为0.5 × 105 – 0.5 × 106）的PBS溶液150 μl。保持注射器与导管连接，以防止细胞泄漏。建议用透明胶带将注射器固定在垫子上，以确保稳定。</li>
	<li>1小时后，轻柔地将导管从尿道中拔出，将小鼠放回笼中，并在白炽&#160;灯下保温直至苏醒：通常在处理结束后的1至2小时内苏醒。</li>
</ol>
4. HP-NAP 的膀胱内递送
<ol>
	<li>注意：细胞接种后至少3天，可开始治疗。</li>
	<li>按照步骤 3.1 至 3.4 所述进行插管。此阶段无需用 HCl 灼烧膀胱壁。</li>
	<li>使用1 ml注射器，注入200–300 μl无菌PBS冲洗膀胱以去除残留尿液，并将膀胱内的液体全部吸出。</li>
	<li>向膀胱内注入每150 μl PBS含50 μg的HP-NAP。保持注射器与导管连接，以避免蛋白溶液泄漏。使用透明胶带将注射器固定在垫子上以固定。</li>
	<li>1小时后，轻柔地将导管从尿道中取出，并将小鼠放回笼中，置于白炽灯下&#160;灯，直到他们醒来。</li>
</ol>
5. 肿瘤外植体与组织学分析
<ol>
	<li>治疗结束后，处死动物，将其置于仰卧位，并用透明胶带将后肢固定在垫子上。</li>
	<li>使用手术刀，从外生殖器上方开始，沿腹中线向头部方向做一条长约1.52 cm的纵向切口，切开皮肤和腹膜。为尽量降低损伤膀胱的风险，需特别注意切割深度。</li>
	<li>膀胱位于切口的左中央区域，肿瘤则表现为深粉红色/紫红色的肿块。切除后，将整个膀胱放入组织学标本盒中，用10%中性缓冲福尔马林固定，随后进行石蜡包埋。</li>
	<li>用于组织学和免疫组织化学分析时，使用标准切片机对膀胱组织制备连续切片（厚度为46 µm）。</li>
	<li>切片经苏木精/伊红染色后，使用计算机辅助图像分析系统计算肿瘤体积（D × d2），并测定每一切面横截面积中的坏死百分比。</li>
	<li>进行血管计数时，采用标准免疫过氧化物酶技术对切片进行内皮标志物CD31/PECAM染色。先在低倍镜下（4×）扫描切片，确定血管密度最高的区域；然后在该区域内，于高倍镜下（20×）随机选取五个视野，分别计数其中的单个微血管数量。</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).</li>
<li>Saint, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+a+T+helper+1+urinary+cytokine+response+after+intravesical+bacillus+Calmette-Guerin+treatment+for+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer.</a> J Urol. 167, 364-367 (2002).</li>
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<li>Horiguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+orthotopic+mouse+superficial+bladder+tumor+model+for+studies+on+intravesical+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments.</a> Hum Cell. 21, 57-63 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

癌症治疗领域的大多数进展在启动临床试验前都需要经过动物模型的测试。研究肿瘤生物学的可能性 体内利用动物模型，为研究癌症发病机制的研究人员提供了一种关键工具，能够评估不同的治疗策略。原位模型仍是金标准14-15，这不仅因为有大量可用的细胞系可用于建立肿瘤模型，还因为其能够模拟天然肿瘤的微环境16.
此外，如本文所述，在同源小鼠中建立癌的原位模型，对于旨在研究基于免疫疗法的新治疗策略的研究尤其重要，因为此类研究无法在接受异种移植的免疫缺陷小鼠中进行。
本方案中描述的方法涉及对雌性小鼠尿道进行插管，从而允许将肿瘤细胞接种以及将治疗剂注入膀胱腔内。
通过酸性灼伤（如上所述，而非其他方法，如使用胰蛋白酶或聚赖氨酸）对膀胱壁进行预处理的优势在于，能够促进形成体积大且高度侵袭性的肿瘤。相反，使用胰蛋白酶和聚赖氨酸进行预处理则会产生较小且侵袭性较低的肿瘤，这可能是由于这些物质的残留物对肿瘤细胞活力具有不利影响17</...

膀胱癌是泌尿生殖道最常见的癌症之一，美国每年新增病例近7.5万例1。由于复发率高，患者需要终身随访，这使得膀胱癌成为治疗成本最高的癌症之一。对于高级别非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），目前的金标准治疗方案是经尿道膀胱肿瘤切除术，随后进行卡介苗（BCG）膀胱内免疫治疗。尽管BCG抗肿瘤作用的确切机制尚未完全阐明，但普遍认为，激活以辅助性T细胞（Th）1和细胞毒性T细胞（Tc）1为主的细胞介导免疫反应，对治疗成功至关重要2。
尽管卡介苗（BCG）仍是治疗非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的首选疗法，但仍有相当高比例的患者对该治疗无反应；此外，该疗法可能引发多种副作用：约70%的治疗后肿瘤在一段时间后复发，约15%进展为肌层浸润性膀胱癌。与BCG治疗相关的其他副作用包括排尿困难、膀胱炎和肾感染3-6。
新型治疗策略的开发在初始阶段之后，必须考虑采用临床前模型 体外 评估；这一点在肿瘤中尤为相关，因为其微环境可显著影响肿瘤的发展及对治疗的反应性。
在过去十年中，我们研究了幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）产生的一种蛋白质HP-NAP的多种免疫调节活性。该蛋白质最初被发现能够促进多形核细胞（PMNs）与血管内皮的黏附7。从结构上看，HP-NAP属于饥饿条件下保护DNA的蛋白质（Dps）家族8，由12个相同的亚基组成，排列成十二聚体壳状结构。
我们已证实，HP-NAP 是一种 Toll 样受体（TLR）2 激动剂，具有强烈的免疫调节活性，可促进 T 淋巴细胞向 Th1 表型分化， 体外 和 体内9-10由于这一活性，HP-NAP 能够在过敏性哮喘的小鼠模型中将 Th2 免疫反应转化为更有利的 Th1 反应11.
为了评估HP-NAP的Th1依赖性抗肿瘤潜力，我们采用了一种由O’Donnel及其同事多年前建立的膀胱癌小鼠模型12，该模型最初用于评估卡介苗（BCG）给药的影响。
通过本方案，我们证明了HP-NAP对膀胱癌具有显著的抗肿瘤潜力，且HP-NAP的治疗效果与肿瘤组织及区域淋巴结中大量聚集的产生干扰素（IFN）-γ13的Th1和Tc1淋巴细胞密切相关。来自HP-NAP处理小鼠的肿瘤组织表现出较未处理组更明显的坏死和更少的血管生成。
本报告提供了一步一步的操作方案，详细描述了实验动物的准备、尿道插管、为使细胞附着于膀胱黏膜所需的化学灼烧处理，以及肿瘤细胞的注射过程。我们还介绍了HP-NAP的局部给药方法，该方法可作为任何用于膀胱癌治疗的治疗剂开发的原型。通过对对照组和HP-NAP处理组动物中分离出的肿瘤进行比较所获得的证据，不仅强调了HP-NAP可能是膀胱癌免疫治疗的良好候选分子，也验证了该实验体系的整体有效性。

<table><tbody><tr><td colspan="4">材料</td></tr><tr><td>C57BL/6J 雌性小鼠</td><td>Harlan Italy (意大利乌迪内)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB49 细胞</td><td></td><td></td><td>由美国爱荷华大学卡弗医学院 O'Donnel 教授提供，美国爱荷华州</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10X，需用无热原水稀释</td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>Becton Dickinson (美国新泽西州富兰克林湖)</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Life Technologies (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Xilor</td><td>Bio 98 s.r.l. (意大利米兰)</td><td></td><td>2% 赛拉嗪</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac (法国卡罗斯)</td><td>359713301992</td><td>5% 唑拉西泮 + 5% 替来他明</td></tr><tr><td>24G 导管</td><td>Terumo (意大利罗马)</td><td>SR+DM2419PX</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carlo Erba Reagents (意大利米兰)</td><td>403871</td><td>液体</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>JT Baker (美国宾夕法尼亚州森特瓦利)</td><td>10095011</td><td>粉末</td></tr><tr><td colspan="4">设备</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Albion Surgical Limited (英国谢菲尔德)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica Microsystem (德国韦茨拉尔)</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR International (美国宾夕法尼亚州拉德诺)</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>图像分析仪</td><td>Zeiss (德国耶拿)</td><td>Cyres System</td><td></td></tr></tbody></table>

评估以下方法的有效性 h. pylori 蛋白hp-nap在正位小鼠模型中作为膀胱癌治疗工具的研究

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

膀胱癌是泌尿生殖道最常见的恶性肿瘤之一。膀胱内注射卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）是治疗高级别非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的金标准。然而，由于该治疗相关副作用较为显著，因此需要开发具有更佳获益/副作用比的新型生物反应调节剂。
肿瘤微环境可影响肿瘤的发生发展及治疗效果。为了获得良好的模型，最好将肿瘤细胞植入其来源器官中。
在本实验方案中，我们描述了一种在雌性小鼠膀胱腔内建立肿瘤并随后递送治疗剂的方法；后者以我们使用的方法为例说明 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）。首先通过尿道插管对黏膜造成初步化学灼伤，随后经同一途径注入小鼠膀胱移行细胞癌MB49细胞系，使细胞附着于膀胱黏膜。在给予一定时间以允许细胞初始增殖后，通过插管再次给予HP-NAP治疗。通过比较对照组与HP-NAP处理组动物的肿瘤体积、坏死范围及血管化程度，评估HP-NAP的抗肿瘤活性。

图1展示了导管插入技术；小鼠通过导管接种0.5 × 106个MB49细胞。在肿瘤细胞注射后3天开始HP-NAP治疗，以允许肿瘤细胞附着于膀胱壁并增殖。对照组中的所有动物均会形成肿瘤；部分小鼠可能因尿道阻塞而在13天实验周期结束前死亡。
首次注射HP-NAP后，动物每三天接受一次处理，共注射四次。实验第十三天结束时，处死动物并收集膀胱组织用于组织学和免疫组织化学分析。如图2A所示，经HP-NAP处理的小鼠膀胱内肿瘤体积显著小于对照溶剂处理小鼠（220 ± 62 mm3 vs 830 ± 180 mm3）。
有趣的是，在溶剂处理的动物中，肿瘤会侵入下方的脂肪组织，而在8只经HP-NAP处理的动物中的7只，肿瘤被限制在膀胱壁内（图2B）。最后，与对照组动物相比，经HP-NAP处理的小鼠肿瘤血管生成减少，坏死范围增大（图2B</stro...

本文描述了建立同基因型小鼠原位膀胱肿瘤模型的方法，用于评估细菌蛋白HP-NAP的抗肿瘤功效。

评估以下方法的有效性 H. pylori 蛋白HP-NAP在正位小鼠模型中作为膀胱癌治疗工具的研究

膀胱癌是泌尿生殖道最常见的恶性肿瘤之一。膀胱内注射卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）是……

本实验的总体目标是在雌性小鼠的膀胱腔内建立肿瘤，并随后递送治疗剂。该过程首先从培养物中收获肿瘤细胞，并将其重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后对小鼠进行导尿，并将肿瘤细胞注入膀胱腔内。肿瘤植入后三天，向小鼠注射治疗药物，此后每三天重复注射一次，共持续13天。最后，切除膀胱并进行组织学分析。最终，通过组织学分析和免疫组织化学分析验证所注射治疗药物的有效性。该技术相较于现有的腹腔内或皮下肿瘤模型的主要优势在于，原位模型能够模拟肿瘤自然发生的微环境。在按照文本方案将C57BL/6J雌性小鼠饲养至8周龄后，使用添加了胎牛血清（FBS）和庆大霉素的RPMI 1640培养基培养MB49细胞，使其生长至80%融合度。在T75培养瓶中用胰蛋白酶消化细胞，然后将其重悬于每150微升磷酸盐缓冲液（PBS）中含有0.5×10⁵至0.5×10⁶个细胞的溶液中，随后通过腹腔注射Zoletil和Xylazine对小鼠进行麻醉。将动物仰卧置于垫子上，用胶带固定其后肢，确保足部充分分开，以便使用小镊子轻轻夹住尿道外口的一侧边缘，并轻柔地向小鼠头部方向扭转，以暴露尿道口。取出导管的内针，以45度角将导管轻轻插入尿道，方向略微朝向小鼠尾部。切勿强行推进导管，若遇到阻力，应轻柔旋转导管。当导管进入尿道约 0.5 至 0.8 厘米时，小心将导管调整至与小鼠尾巴平行的位置，并完全插入。将装有 200 至 300 微升无菌 PBS 的 1 毫升注射器插入导管，冲洗膀胱中残留的尿液，然后将膀胱内所有液体抽吸干净。接下来，使用无菌的1毫升注射器，注入200微升0.1 N HCl。充盈膀胱以使整个膀胱壁接触酸液。10秒后，吸出全部酸液，并立即注入200微升0.1 N NaOH进行中和。然后吸出所有残留液体，并立即用300 µL无菌PBS冲洗膀胱腔。通过抽吸排空膀胱后，注入150 µL M 49细胞悬液。保持注射器与导管连接，防止细胞泄漏，并用胶带固定。一小时后，轻柔地将导管从尿道中抽出，将小鼠置于加热灯下的笼子中，使其恢复至少三天。在按照上述方法对麻醉后的小鼠进行插管并注射MB49细胞后，使用1毫升注射器，以200至300微升无菌PBS冲洗膀胱中残留的尿液，吸出所有液体后，将50微克幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（H-P-N-A-P）溶于150微升PBS中注入膀胱，并保持注射器与导管连接以避免泄漏。一小时后，轻柔地将导管从尿道中移除，将小鼠置于加热灯下的笼子中，直至其苏醒。第0天进行小鼠植入。对于MB 49模型，在第3、6、9和12天分别给予50微克的H-P-N-A-P或PBS处理。第13天处死动物，收集膀胱组织用于组织学和免疫组织化学分析。如图所示，经 H-P-N-A-P 处理的小鼠膀胱肿瘤明显小于经载体处理小鼠的肿瘤。有趣的是，在载体处理的动物中，肿瘤会侵入下方的脂肪组织；而在八只经 HP NAP 处理的

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Medicine

医学

评价疗效<em&gt;小时。幽门螺杆菌</em&gt;蛋白HP-NAP为膀胱癌的治疗在原位小鼠模型的治疗工具

小鼠膀胱壁注射是一种用于原位研究膀胱干细胞和癌症生物学的有效方法。这种精细的显微外科技术通过严谨的操作和反复练习即可掌握。...

小鼠膀胱壁注射

通过导管插入、局部烧灼以及随后将癌细胞黏附至灼伤部位，可在雌性小鼠体内以微创方式建立膀胱肿瘤模型。...

一种小鼠膀胱癌的原位模型

建立原位膀胱肿瘤模型，以评估经膀胱内递送的saRNA的抗肿瘤效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。...

一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射saRNA治疗的评价

在本视频中，我们介绍了将癌细胞注入小鼠模型膀胱的经膀胱灌注操作。该操作有助于建立正位膀胱肿瘤模型，可用于开发治疗策略。...

建立小鼠正位膀胱肿瘤模型：将癌细胞经膀胱内灌注植入小鼠膀胱的操作步骤

关键词：正位肿瘤模型，膀胱肿瘤，小鼠模型，膀胱内灌注，癌细胞植入

本视频展示了一种在小鼠膀胱癌模型中评估幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白（Helicobacter pylori neutrophil-activating protein，简称 HP-NAP）抗肿瘤活性的技术。HP-NAP 与肿瘤细胞周围的中性粒细胞相互作用，促进促炎性细胞因子的产生，诱导初始 T 细胞分化为 1 型辅助性 T 细胞（Th1）和 1 型细胞毒性 T 细胞（Tc1）表型。Th1 和 Tc1 细胞分泌干扰素-γ，抑制肿瘤血管生成，并促进细胞毒性 T...

评估一种细菌免疫调节蛋白在小鼠模型中的抗肿瘤疗效

将肿瘤细胞植入其起源器官可作为评估新型疗法的一种有效临床前模型。MB49...

用于基因递送研究的原位膀胱癌模型

为了测试靶向MUC1的免疫疗法，在人黏蛋白1（MUC1）转基因小鼠中建立了由N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺诱导的膀胱癌模型。给予MUC1靶向多肽疫苗后，通过检测血清细胞因子水平和T细胞特异性活性，证实了针对MUC1的细胞毒性T淋巴细胞反应。...

在免疫系统完整的人源MUC1转基因小鼠中诱导侵袭性移行细胞膀胱癌：一种用于免疫治疗开发的模型

一种高产率的一步法负向纯化重组蛋白方法 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌中过表达的中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP） 大肠杆菌 通过使用二乙氨基乙基树脂进行批次纯化的方法进行了描述。采用该方法纯化的HP-NAP有助于开发针对幽门螺杆菌的疫苗、药物或诊断试剂 H. pylori相关疾病.

一步法负向色谱纯化 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白过表达于 大肠杆菌 批量模式

本方案描述了在雌性C57BL/6J小鼠中建立原位膀胱肿瘤并监测肿瘤生长的方法。...

一种小鼠原位膀胱肿瘤模型及肿瘤检测系统

一种尿路致病性小鼠模型 E. coli (UPEC) 经尿道接种以建立潜伏性胞内膀胱储存库及随后的膀胱暴露于 G. vaginalis...

复发性 大肠杆菌 由尿路感染引发的 Gardnerella vaginalis 小鼠膀胱暴露术

了解如何利用原位膀胱肿瘤小鼠模型评估幽门螺杆菌蛋白HP-NAP的抗膀胱癌疗效。该方法通过组织学和免疫组织化学分析验证治疗效果，为癌症免疫治疗研究提供可靠的实验平台。

评估以下方法的有效性 H. pylori 蛋白HP-NAP在正位小鼠模型中作为膀胱癌治疗工具的研究

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