Name: 在锝-99m在马腱末端标记的骨髓间充质干细胞的体内成像和跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学习利用伽马闪烁扫描技术对马骨髓间充质干细胞进行体内成像与追踪的方法，以评估细胞存活及组织分布情况。该技术为兽医再生医学研究提供了重要的非侵入性监测手段。

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作者感谢英国赛马博彩征收委员会（资助编号 721）、英国 VetCell BioScience 公司以及西班牙安达卢西亚自治区创新、科学与企业理事会提供的资金支持。

本文所述病例均在获得西班牙马拉加兽医协会动物伦理与福利委员会以及英国北迈姆斯皇家兽医学院伦理许可后进行。对马匹实施的操作基于已批准的临床方案，这些方案用于接受基于干细胞治疗的马匹，包括镇静、骨髓抽吸、肌腱内注射、区域灌注、静脉注射、术后治疗以及植入后的疼痛管理和监测。
1. 需提前完成的关键准备工作
<ol>
	<li>在开始工作前，须获得机构伦理和动物福利审批，并遵守当地的法律法规要求。</li>
	<li>根据当地法律法规，申请使用电离辐射的机构许可，包括对人员和环境的适当保护措施，以及污染废弃物的处理。</li>
	<li>采用以下纳入标准：马匹患有非创伤性过度劳损损伤（屈肌腱病或韧带病），累及前肢浅层屈指肌腱（SDFT），且病变导致肌腱内出现缺损，缺损周围由完整的肌腱和/或腱周组织包绕。 
	注：此类损伤的检查与诊断，以及马匹细胞植入前的临床准备，已在其他文献中详细描述6,15。 
	注：从马骨髓中分离并体外扩增骨髓间充质干细胞（BMMSC）的方法此前已有报道6,16。目前针对马SDFT损伤植入BMMSC的方案采用每毫升自体骨髓上清液（BMS）16含1000万个细胞4。</li>
	<li>用于体内植入的细胞传代次数不得超过4代，以避免高代次细胞可能出现的细胞表型或遗传特性改变。</li>
	<li>将所需数量的细胞置于BMS中（置于冷藏箱内，4–8 oC，24小时内）运送至实施细胞植入的兽医诊所。 
	注：使用骨髓上清液中的间充质干细胞进行临床治疗是ReCellerate Inc（美国）拥有的专利技术，其使用可能需要授权。 
	注：Tc-99m是一种伽马射线发射体（140 keV），半衰期相对较短（6.0058小时，因此24小时内约94%衰变为稳定的99Tc）。其伽马射线能量适合伽马相机（闪烁扫描）检测，而短半衰期使得马匹及操作人员所受辐射暴露时间极短。本方案描述的是在现场使用Tc-99m-HMPAO [以Tc-99m（高锝酸钠）标记的HMPAO] 对细胞进行标记的方法。</li>
	<li>向供应商订购新鲜的Tc-99m，确保其从Tc-99m发生器洗脱后2小时内送达并用于细胞标记。确保Tc-99m以1 GBq溶于1 ml溶液的形式提供（供应商标准缓冲液）。</li>
	<li>所有缓冲液均在室温下使用。细胞标记、细胞植入及成像（伽马闪烁扫描）均应在同位素 containment 房间内进行，所有设备在操作开始前须用酒精擦拭清洁。</li>
</ol>
2. 马匹准备及前肢肌腱超声检查

<ol>
	<li>在受伤后首次入院时（骨髓抽吸时）记录超声扫描，然后在注射放射性标记细胞的时间点再次进行超声扫描。</li>
	<li>在马匹站立于马厩中并接受站立镇静（而非全身麻醉）的情况下进行超声检查和细胞植入。通过静脉注射盐酸地托咪定和酒石酸布托啡诺的混合物进行镇静，剂量均为0.01至0.02 mg/kg。 
	注意：恢复迅速，术后治疗无需特殊处理。&#160;</li>
	<li>在患肢实施周围神经麻醉（步骤2.6）后，使马匹在镇静状态下保持静止，以减少治疗期间的移动。通过观察马匹头部位置降低、行为状态以及在细胞注射和γ相机采集闪烁显像图像过程中是否舒适，来直观评估镇静程度是否适当。 
	注意：无需涂抹兽用眼膏（防止眼睛干燥），因为在镇静状态下眨眼功能不受影响，马匹能够自行维持眼部湿润。细胞植入后的监测为非侵入性（超声和γ闪烁显像）。</li>
	<li>使用马用剪毛器将肌腱表面的毛发紧密剪除，然后用氯己定外科洗手液清洁剪毛区域，最后用酒精擦拭。</li>
	<li>在检查区域涂抹声耦合凝胶，并系统性地进行扫描，依次记录掌侧前肢掌骨区域标记为1–7级17的完整图像，使用线阵探头（12 MHz或类似频率），获取连续的垂直入射横断面和纵断面图像。将图像以数字形式存储，以便借助图像分析软件测量横截面积和最大损伤区域4。</li>
	<li>准备腕关节远端掌侧神经走行区域，进行无菌局部麻醉注射，以确保肌腱表面皮肤及浅层屈指肌腱完全去敏感化。在肢体两侧、腕关节远端、屈肌腱与悬韧带之间的掌侧神经周围（位于筋膜下），分别皮下及邻近神经注射2 ml甲哌卡因。</li>
	<li>完成初步扫描后，用浸有氯己定外科洗手液的纱布对该区域进行至少5分钟的擦洗，最后用酒精棉纱擦拭，以准备植入部位。后续所有操作均应以无菌方式进行。</li>
</ol>
3. 马源间充质干细胞的锝-99m标记
注意：细胞标记步骤可在前肢超声检查期间进行，因为这样可以最大限度地减少细胞标记与标记细胞植入肌腱之间同位素的衰变。
<ol>
	<li>移除细胞中的BMS，因为它会干扰同位素的摄取。操作方法如下：从冷藏盒中取出装有BMMSC的西林瓶（1 ml BMS中含有1000万个细胞），在室温下以350 × g离心5分钟收集细胞。使用18G或19G针头（连接2 ml注射器）小心吸除上清液，管内保留少量液体（≤0.1 ml），以利于后续细胞重悬。将上清液（即BMS）保存至无菌微量离心管中，置于冰上以备后续重复使用。</li>
	<li>通过手指轻弹管壁（而非涡旋振荡）使细胞在残留的上清液滴中充分重悬，并将管子置于室温下的试管架中。确保细胞完全分散，无可见的细胞团块。</li>
	<li>按以下步骤制备Tc-99m：使用1 ml注射器和针头将1 ml高锝酸盐转移至HMPAO西林瓶中。轻轻但彻底混匀，置于铅屏蔽后静置5分钟。注意：此步骤可在步骤3.1中细胞离心时同步进行。</li>
	<li>使用1 ml注射器和针头将全部Tc-99m-HMPAO混合液加入细胞中，轻轻混匀。在铅屏蔽后室温孵育30分钟。</li>
	<li>进行后续操作时，使用镊子或一小块纸巾打开微量离心管盖，以尽量减少同位素对（戴手套的）拇指的污染，进而避免其他设备的交叉污染。使用2 ml注射器和21G针头添加或移除洗涤缓冲液。 
	注意：建议使用现场同位素监测仪检测表面和设备的污染情况。</li>
	<li>向Tc-99m-HMPAO-细胞混合物中加入1 ml PBS，盖紧管盖，轻轻混匀，然后按步骤3.1条件离心收集细胞。</li>
	<li>小心将PBS转移至新管中（将此液体保存在铅屏蔽后，并标记为W1）。用1 ml新鲜PBS重悬细胞沉淀。再次离心后，按上述方法移除上清液（保存此液体并标记为W2）。</li>
	<li>通过测量W1和W2管以及细胞沉淀中的计数来计算标记效率。将各管依次放入井式同位素活度计中，记录每分钟计数（CPM）。标记效率计算公式为：（细胞的放射性CPM值）/（细胞放射性CPM值 + 上清液放射性CPM值）× 100。</li>
	<li>用残留的PBS充分重悬细胞，然后加入步骤3.1中保存的BMS。细胞即可用于病灶内移植。</li>
</ol>
4. Tc-99m-HMPAO 标记细胞的植入
<ol>
	<li>在超声引导下将细胞植入肌腱病灶内
	<ol>
		<li>将一根1.5或2英寸（50 mm）的20 G穿刺针沿纵向缓慢插入病灶的最大损伤区域，超声探头覆盖无菌铺巾，与穿刺针保持同一直线，以便在超声图像中清晰识别针的全长，并准确确认针尖位于病灶中心。</li>
		<li>在适当屏蔽条件下，使用20 G穿刺针将细胞收集至2 ml注射器（Luer-lock接头，以尽量减少外部污染，并置于铅屏蔽注射器保护套中）。弃去穿刺针，注意避免液体丢失。随后将含有标记细胞的注射器连接至预先置于肌腱内的穿刺针上。</li>
		<li>将超声探头置于穿刺针下方，确保针道在组织中清晰可见。以缓慢而稳定的速度将细胞注入病灶，确保注射过程中无阻力。若遇阻力，应在超声引导下小心调整针的位置。通过超声图像确认注入病灶的液体为无回声液体，并含有强回声的微小气泡。</li>
		<li>拔出穿刺针后，立即对针孔施加压力，以防止注入的细胞流失，并减少同位素在肢体表面扩散。立即使用一层自粘性绷带包扎患肢。此时马匹已准备好进行γ闪烁显像，应立即进行。 
		注意：在将细胞注入肌腱后，应对空注射器和针头进行放射性计数，以评估可能残留在注射器中的细胞损失量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tc-99m-HMPAO标记细胞的区域性灌注
	<ol>
		<li>执行步骤2.4。</li>
		<li>在近端掌骨区域应用一条100 mm的橡胶止血带，并在内侧和外侧各放置一条100 mm的棉卷纱布垫。</li>
		<li>以无菌操作方式准备近端籽骨外侧水平的外侧掌侧数字静脉区域皮肤：使用氯己定外科洗手液擦洗至少5分钟，最后用浸有酒精的纱布擦拭。&#160; 后续所有操作均应以无菌方式进行。</li>
		<li>准备一条100 mm的延长管，连接一个21 G × ¾”（0.8 × 19 mm）蝶形针，先用肝素化无菌生理盐水充满延长管，然后将蝶形针插入外侧掌侧数字静脉。一旦进入静脉，血液将部分填充延长管。在Luer-lock接头处连接一个Luer-lock橡胶帽，以便后续注入标记细胞。</li>
		<li>将MSCs收集至预装有PBS的20 ml注射器中，用PBS稀释至总体积19 ml。&#160; 使用18 G（1.2 × 40 mm）皮下注射针经橡胶帽以缓慢而稳定的速度（30–40秒）注入细胞。&#160; 随后用预装在注射器中的1 ml PBS冲洗导管。</li>
		<li>拔出穿刺针后，立即在针孔皮肤处覆盖五层4×4纱布并施加压力。然后在近端籽骨区域覆盖轻质弹性粘性绷带&#160;，并在注射后保持止血带原位30分钟。</li>
		<li>30分钟后松开止血带。此时马匹已准备好进行γ闪烁显像。 
		注意：在将细胞注入后，应对空注射器和针头进行放射性计数，以评估可能残留在注射器中的细胞损失量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 伽马闪烁显像
<ol>
	<li>闪烁扫描图像
	<ol>
		<li>使用配备低能平行孔准直器的γ相机（设置为140 KeV光电峰，采用20%对称窗）获取平面闪烁扫描图像。
		<ol>
			<li>在时间0之后，对按照步骤2.2进行镇静的站立马匹获取所有图像。在时间0的闪烁扫描图像采集后，将植入部位的轻质绷带更换为带衬垫的绷带。每次进行闪烁扫描检查前，需移除该绷带。</li>
			<li>使用处理软件中的“采集”–“研究选择”–“骨静态”选项，以256×256矩阵分别采集每幅静态图像，持续60秒。在图像采集期间，必须确保马匹保持静止，因为静态模式选项不具备运动校正模块。</li>
			<li>对于病灶内注射，从腕关节至远端肢体的病灶区域、对侧肢体相应区域、左肺野及左甲状腺获取侧位图像。在前肢图像采集过程中，应在两腿之间放置铅屏蔽板，以避免对侧肢体成像。在注射后5分钟（时间0）开始采集图像，随后在1、3、6、12、24、36和48小时进行采集。</li>
			<li>对于区域灌注，获取与5.1.1.3相同的侧位和背位γ图像。在止血带松开后5分钟开始采集图像，此时间为时间0。在注射细胞后立即对肢体成像，以评估止血带松开前的计数，可能具有参考价值。在细胞给药后1、3、6、12、24、36和48小时获取γ图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>图像采集完成后，使用软件的“处理”选项，选择“Sokoloff”颜色和“反相”颜色进行手动图像处理。随后选择“感兴趣区域”（ROI）和“椭圆”工具，以便调整选择掩膜的形状并将其移动至病灶区域。通过选择“添加至统计”选项，获取ROI内的计数。确保在不同时间点为每只动物记录大小相同的感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>接下来，根据各时间点锝的预期衰变对计数进行校正。使用以下公式进行衰变校正：A = Aoe-(0.693t/T1/2)，其中Ao为同位素的初始活度，A为时间0时衰变校正后的放射性，t为经过的时间，T1/2 为同位素的半衰期。然后将各时间点的校正后计数表示为时间0时ROI计数的百分比，以计算残留细胞的百分比，使用以下公式：</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
剩余细胞百分比（t）= 100 – {[(预测衰减速率(t) – 实际衰减速率(t)) / 预测衰减速率(t)]} &#160;× 100
decay(t) = ROI(t) / ROI(0) × 100。

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</ol>

JD 和 RKS 是 ReCellerate 公司的科学顾问委员会成员。

除了骨髓外，从脂肪组织等来源分离的干细胞也适用于本方案的标记。此外，处于冷冻状态的细胞可复苏并在培养中扩增至标记研究所需的数量12。
决定BMMSC标记效率的一个关键因素是放射药房从钼发生器洗脱Tc-99m、制备Tc-99m-HMPAO以及在临床使用该放射性药物之间的时间间隔。标记效率与从发生器洗脱Tc-99m后的时间呈负相关，因此超过该时间间隔会显著降低细胞标记效率。因此，在细胞进行放射性标记并植入的当天，必须在实验室向临床运送细胞与Tc-99m送达临床之间进行密切协调。因此，运输至临床的时间是一个重要因素。供应商的数据表指出，Tc-99m在洗脱2小时后因衰变导致放射性化学纯度下降，可能干扰HMPAO与Tc-99m的结合，进而影响细胞对Tc-99m-HMPAO的摄取量。我们还注意到，在实验室环境中对培养的细胞进行标记比在临床环境中标记效率更高。另一项在马匹中开展的研究5也报告了在实验室环境中标记细胞的结果。此外，根据我们的经验，与培养后获得的细胞相比，从血液或组织样本分离后立即标记的细胞对示踪剂的摄取效率更高。然而，即使标记效率较低，仍...

修复病变或受损组织的再生策略基于来源于多种组织的多能干细胞，并将其植入受损区域。近年来，自体骨髓间充质干细胞（BMMSC）在治疗马匹肌腱和韧带损伤中的应用取得了进展，在实验研究1-5和临床研究6中均显示出更优的治疗效果。马是评估干细胞相关治疗疗效的理想模型，因其会自然发生与年龄和过度劳损相关的前肢远端肌腱损伤，且马属于运动型动物，体型较大，便于进行骨髓采集和精确的细胞植入。肌腱损伤在自然愈合过程中会形成纤维化组织，但愈合后的肌腱功能较差7，且再损伤风险较高8。其中最常受累的是浅支指深屈肌腱（SDFT），该肌腱在进化中被优化为弹性能量储存结构，以实现高效节能和高速运动，因而承受极高的负荷应力。因此，损伤后恢复其功能至关重要。这类损伤与人类中发挥类似功能的跟腱损伤具有相似性9。目前尚无有效的治疗方法可实现此类损伤的良好修复，因此基于细胞的再生治疗策略为改善疗效和降低再损伤风险提供了极具前景的途径。
在大多数研究中，将500万至2000万个自体骨髓间充质基质细胞（BMMSC）直接注射到病变部位，这些病变通常位于肌腱体的核心区域，因此该区域可作为细胞的容纳部位。细胞注射后的归宿尚不明确，近期已有多种细胞标记方法被用于追踪细胞。使用荧光标记的细胞被证实仅能以相对较少的数量（&#60;10%）存活10,11。荧光标记需要进行组织取材和切片以完成组织学分析，这一过程耗时较长，且难以在大型动物模型或临床病例中实现时间序列的动态分析。在近期的研究中，我们采用放射性同位素99mTc对细胞进行标记，并通过γ闪烁显像追踪其归宿1。该方法可快速比较不同细胞递送途径的效果，包括病灶内注射、经颈静脉静脉注射1，或通过动脉内12或静脉内1,12途径的区域灌注。随后可通过γ闪烁显像观察细胞在各个器官中的持续存在情况和分布模式。研究显示，病灶内注射的细胞在24小时后仅有24%仍保留在病灶内1，另一项使用实验性诱导病变并采用相同放射性标记的研究也支持这一结果5。此外，当通过区域灌注或静脉注射途径递送时，细胞向肌腱病变部位的归巢能力有限，且经后两种途径递送的细胞主要分布至肺部4。
用铁纳米颗粒标记的BMMSC是一种用于追踪植入前肢肌腱细胞的替代方法13尽管铁纳米颗粒标记的细胞可用于细胞示踪 体内 由于需要反复麻醉以进行MRI扫描，大型动物的MRI时间序列研究在实施次数上受到限制。此外，铁纳米颗粒在MRI上呈低信号，这限制了对标记细胞向肌腱内部迁移情况的信息获取。其他可用的放射性同位素包括铟-111，但其半衰期较Tc-99m更长（2.8天 vs 6.0小时），且γ射线发射能量更高，存在明显劣势。此外，已有报道显示，细胞标记铟-111后其活力会降低14然而，Tc-99m 常规用于马科和人类核医学中，以标记外周血单个核细胞并追踪其分布情况 体内 通过闪烁扫描法进行检测。利用HMPAO作为连接分子将锝-99m（Tc-99m-HMPAO）结合到细胞上，细胞可相对容易地摄取该标记物。经Tc-99m-HMPAO标记的骨髓间充质干细胞（BMMSC）表现出良好的存活率，并能够增殖 体外4本方案详细描述了将自体骨髓间充质干细胞（BMMSC）植入前肢浅屈肌腱自然发生损伤部位后的标记与追踪方法。
需要注意的是，该实验方案仅 intended 作为研究工具使用。由于放射性标记对细胞表型的影响尚未完全阐明，因此不推荐将其用于临床治疗手段。

<table><tbody><tr><td>锝&lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>请根据当地法律法规，咨询本地电离辐射供应商。&amp;nbsp;该同位素必须在从钼-99发生器洗脱后2小时内使用</td></tr><tr><td>Ceretec - 六甲基丙二胺肟（HMPAO）&amp;nbsp;</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>请直接联系GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心机，Minispin/Minispin Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>18 G 和 19 G 针头</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G)；&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; NN1938R (19 G)</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 和 2 ml 注射器</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml)；SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - 磷酸盐缓冲液</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布敷料</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>CoflexVet 自粘绷带</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>超声成像软件</td><td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicasXplus 闪烁图处理软件</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>用于同位素监测的现场同位素计数器</td><td>John Caunt U.K.</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/</td></tr><tr><td>用于同位素测量的井型计数器、剂量校准仪</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像与追踪锝-99m标记的马骨髓间充质干细胞治疗肌腱病

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

近年来，骨髓间充质干细胞（BMMSC）在治疗马匹肌腱和韧带损伤中的应用取得了进展，在实验和临床研究中均显示出改善的疗效指标。尽管将大量BMMSC（通常为1000万至2000万个细胞）植入肌腱病灶，但仅有相对较少的细胞能够存活（&#60;10%），尽管这些存活细胞可在植入后持续存在长达5个月。这一现象在其他物种中将BMMSC植入其他组织时也普遍存在，因此了解细胞丢失发生的时间、有多少细胞能够耐受初始植入过程，以及细胞是否被清除至其他器官显得尤为重要。通过在植入前对BMMSC进行放射性标记，可实现对细胞命运的追踪，从而进行细胞定位的无创体内成像以及细胞数量的定量分析。
本方案描述了一种使用锝-99m（Tc-99m）对细胞进行标记的方法，并在将这些细胞植入损伤的马屈肌腱后对其进行追踪。Tc-99m 是一种短半衰期（t1/2 为 6.01 小时）的同位素，可发射γ射线，在脂溶性化合物六甲基丙二胺肟（HMPAO）存在的情况下可被细胞内化。这些特性使其非常适合用于核医学临床，以诊断多种不同疾病。通过γ闪烁显像，可在短期内（最长36小时）追踪标记细胞的去向，定量分析滞留在病灶中的细胞数量，以及细胞在肺、甲状腺和其他器官中的分布情况。该技术改编自血液白细胞标记方法，也可用于对其他器官中植入的骨髓间充质干细胞（BMMSC）进行成像。

Tc-99m-HMPAO 掺入骨髓间充质干细胞（BMMSs）后，不会对其黏附组织培养塑料的能力产生不利影响；尽管这些细胞显示出形成单层的增殖能力（图1），但我们尚未完全确定其增殖速率或其他细胞表型是否受到影响。其形态与未标记细胞相似，呈典型的梭形。细胞标记效率（即，标记物摄取率）通常在约1.5%至25%之间波动。标记效率较低的主要原因是99mTc从Mo-99/Tc-99m发生器洗脱地点运送到临床场所的时间延迟。若延迟超过2小时，细胞标记率将显著下降。然而，细胞内掺入的同位素足以支持长达36小时的γ闪烁显像（图2）。可提高标记效率的因素详见讨论部分。
标记的细胞可通过病灶内植入1（直接植入病灶）或经由指静脉1或动脉12进行区域灌注的方式植入。当损伤位于肌腱核心且被完整的肌腱组织包围时，可采用病灶内植入，因为完整的肌腱组织可作为细胞的容纳结构。区域灌注是一种更简便的给细胞途径，因为细胞被注射入血管中，但该方法依赖于...

本方案描述了马源间充质干细胞的放射性标记及其向马肌腱损伤部位的植入，以通过伽马闪烁显像技术确定细胞存活率和组织分布情况。

近年来，骨髓间充质干细胞（BMMSC）在马匹肌腱和韧带损伤治疗中的应用取得进展，提示……

本实验方案的总体目标是通过γ射线闪烁扫描技术，无创地追踪标记的骨髓间充质干细胞注射后的分布及归宿。目前对干细胞注射后的归宿仍了解甚少。该技术的主要优势在于，可在给药后无创追踪干细胞在多个器官中的分布，且由于A骨显像剂的半衰期较短，可在48小时内完全清除。尽管这为干细胞在自然发生的肌腱病治疗中的应用提供了见解，但该方法也可用于骨科和心脏疾病治疗的研究。通常，对于初次使用该技术的研究人员而言，挑战主要在于细胞的协调、标记操作的准备以及患者的设置。为了立即应用这些细胞，首先在已剪毛的肢体上涂抹超声耦合凝胶，然后使用线性探头系统地扫描整个掌侧掌骨区域，获取一系列横向和纵向的横断面图像，以确定损伤最严重的区域。局部麻醉给药后，使用氯己定外科洗手液对植入部位进行至少五分钟的擦洗，随后用浸有乙醇的纱布擦拭。首先，在动物准备就绪后戴上一副手套，取1毫升骨髓上清液中的骨髓间充质干细胞等分试样（浓度为1×10⁷个细胞），通过离心形成细胞沉淀。然后，使用配备18或19号针头的2毫升注射器吸除上清液，保留约100微升溶液在离心管中。将上清液转移至预冷的微量离心管中，置于冰上，然后轻轻弹击管壁，用残留的100微升上清液重悬细胞。注意确保细胞完全重悬，无可见的组织团块。随后将细胞置于室温下。现在，将一毫升锝标记的Protec Nutate与一支H-M-P-A-O小瓶混合。五分钟后，使用一毫升注射器和针头将全部等分试样的锝-99m标记的H-M-P-A-O加入间充质干细胞中。然后盖紧管盖，轻轻弹击混匀细胞，并将试管置于铅屏蔽后方的室温环境中。30分钟后，用镊子打开离心管，使用配备21号针头的1毫升注射器向细胞中加入1毫升PBS。盖上管盖并混匀细胞。接着，离心细胞，并用2毫升注射器小心地将上清液转移至标记为“洗涤1”的带防护管中。然后如上所述，用另一毫升 PBS 清洗沉淀。第二次清洗后，将清洗液转移至标记为 W2 的所谓屏蔽管中。充分重悬细胞于残留的 PBS 中，并加入一份冰冷的骨髓上清液，操作时保持换能器与针头平行。将一根1.5或2英寸、20号针头沿纵向缓慢插入病灶中心的最大损伤区域。接着，在适当防护下，用配备20号针头的2毫升鲁尔锁型注射器抽吸细胞，随后弃去针头，注意避免任何液体丢失。将注射器连接至肌腱内预先放置的针头后，调整超声探头位于针头下方，使针头在组织中的行进路径清晰可见，并以缓慢而稳定的速度将细胞注入病灶内。当所有细胞均已注入后，确认在超声图像上可见液体注入病灶区域，表现为含有强回声气泡的关节液，随后拔出针头。在处理软件中使用“采集研究选择”和“骨静态”选项，分别采集持续60秒的静态图像。接下来，在指定时间点获取病灶区域的侧位图像，范围包括从腕关节至远端肢体、对侧肢体的相应区域、左肺野以及左甲状腺。然后选择感兴趣区域和椭圆工具，并根据需要在病灶区域上重新调整选择掩膜的形状。最后，选择“添加两项统计”选项，以获取感兴趣区域的计数结果。注意在不同时间点对每只动物记录的感兴趣区域大小应保持一致。局部病灶内递送后，细胞会表现为一个局灶性信号区域，随着时间推移，细胞向周围肌腱组织的扩散范围有限。相比之下，当通过指掌静脉进行区域性灌注给药时，注射部位的信号会逐渐减弱。通常情况下，局部病灶内注射后肺部区域的信号为阴性，但在早期时间点偶尔可检测到非常局限的信号，且该信号可能随时间推移而变得更为广泛。通过此种给药途径，甲状腺仍呈阴性。区域灌注还显示肺部存在局灶性信号，该信号随时间推移变得更为弥散，尽管与瘤内给药途径相比，其信号强度显著增强。当甲状腺也常表现出局灶性信号时，需记录细胞在注射前即刻（零时）的总初始放射性核素计数，以及感兴趣区域初始伽马显像的计数结果。注射后零时的数值可用于计算每次注射后各时间点计数值相对于初始计数值的下降百分比，从而确定锝-99m（TC 99 M）的预测衰变情况。随后还可计算每次注射后各时间点残留在注射部位的细胞存留情况。通过该方法，可应用其他细胞迁移途径，进一步探究间充质干细胞在发育后归巢能力的相关问题。该技术为区域医学领域的研究人员探索改善肌腱损伤中细胞滞留的方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何标记细胞，并记录其在不同器官系统中的分布与浓度。请务必注意，操作电离辐射可能具有极高危险性，在执行该操作时，必须采取个人防护装备、辐射监测仪、铅屏蔽以及妥善处理污染废弃物等必要防护措施。

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在锝-99m在马腱末端标记的骨髓间充质干细胞的体内成像和跟踪

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NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像

本文介绍了一种在创伤性脑损伤小鼠模型中进行非侵入性间充质干细胞（MSC）递送与示踪的实验方案。采用超顺磁性氧化铁 纳米颗粒作为磁共振成像（MRI）探针，对MSC进行标记，并通过实时MRI技术在经鼻递送后实现非侵入性的活体示踪。...

通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

局部注射线粒体染料可标记终末施万细胞的线粒体 体内...

方法 原位 小鼠肌肉和终末施万细胞中线粒体形态的定量分析

学习利用伽马闪烁扫描技术对马骨髓间充质干细胞进行体内成像与追踪的方法，以评估细胞存活及组织分布情况。该技术为兽医再生医学研究提供了重要的非侵入性监测手段。

体内成像与追踪锝-99m标记的马骨髓间充质干细胞治疗肌腱病

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