Name: 发现疾病相关的α突触核蛋白通过增强ELISA在转基因小鼠表达人A53T的突变脑α突触核蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 学习使用定量ELISA方法检测转基因小鼠模型中疾病相关α-突触核蛋白的积累情况。该技术可快速可靠地量化中脑、脑干和脊髓等脑区中的蛋白质水平，为研究突触核蛋白病提供重要工具。

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作者感谢 Damien Gaillard 在动物实验接种及后续工作中的协助。本研究由 ANSES（法国食品、环境与职业健康安全局）资助。 &amp;#38; 安全）以及法国帕金森基金会的资助。

所有涉及动物的实验程序和方案均符合欧盟指令86/609/EEC，并经法国动物实验伦理审查国家委员会（ComEth）批准（方案编号11-0043）。动物饲养和护理均在里昂ANSES批准的实验设施内进行（批准号B 69387 0801）。
1. 小鼠的准备
<ol>
	<li>通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠处死小鼠。</li>
	<li>从小鼠颅骨中取出完整脑组织，置于冰上预冷的35 mm塑料培养皿中，待提取。</li>
	<li>分离颈段脊髓。 
	注意：αS可从矢状面切开后的一侧脑半球提取，或从实验（见表1所列）完成后已解剖的小鼠脑组织中获取。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>实验</td>
			<td>小鼠 
			接种物（脑组织当量）</td>
			<td>存活期 
			（感染后天数）</td>
			<td>中位数/最长生存期 
			（天龄）</td>
			<td>αSd ELISA检测 
			/WB/IHC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>未接种小鼠</td>
			<td>441 ± 166</td>
			<td>419/736</td>
			<td>8/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>接种的小鼠（0.2 mg）</td>
			<td>150 ± 52</td>
			<td>140/241</td>
			<td>9/9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 在M83小鼠上进行的实验列表。 实验2在6周龄时进行，将20 µl病鼠脑匀浆（1% wt/vol，溶于5%葡萄糖）接种至纯合M83小鼠的纹状体皮层区域，接种前使用3%异氟烷吸入麻醉6周龄小鼠。d.p.i.：接种后天数。
2. 从脑半球中提取αS
<ol>
	<li>将脑组织进行矢状切分，得到两个半脑。将每个半脑放入含有研磨珠的肋裂解管中称重。</li>
	<li>配制高盐（HS）缓冲液，含 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、750 mM NaCl、5 mM EDTA、1 mM DTT 以及 1% 磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液。向半脑中加入高盐缓冲液，制成 20%（质量/体积）的匀浆液。</li>
	<li>使用机械匀浆器对半脑样品进行处理，以 6.0 m/s 速度匀浆 23 秒，重复两次。第一次 23 秒匀浆后，将含有匀浆液的管子置于冰上静置 2 分钟，再进行第二次 23 秒匀浆循环。</li>
	<li>将样品以 1,000 ×g 离心 5 分钟，以去除未充分研磨的脑组织碎片。收集上清液，分装为每份 200 µl，于 -80 °C 保存，用于后续 ELISA 分析。</li>
</ol>
3. 从分离的脑区提取αS
<ol>
	<li>在冰上的35 mm塑料培养皿中，使用低倍放大镜（8倍放大）和两把镊子进行全脑解剖，除解剖海马体时外，两把镊子的尖端应保持并拢。解剖过程不得超过10分钟，以保持脑组织完整性。将脑组织腹面朝上放置，并按以下顺序分离下列脑区：
	<ol>
		<li>使用镊子夹住其中一个嗅球后方位置，将两个嗅球分开。通过向下移动将其从脑组织上剥离。对另一个嗅球重复此操作。</li>
		<li>用镊子轻轻插入两个皮层之间，并向前移动以促进两个皮层的分离。用一把镊子固定脑组织，另一把镊子将皮层与海马体分开。</li>
		<li>将镊子置于皮层下方2 mm处。保持对镊子的轻柔压力，直至海马体顶部可见。剥离第一部分皮层，随后对第二部分重复此操作。使用镊子从海马体开始，向脑前部方向分离两部分皮层。</li>
		<li>将打开的镊子置于其中一个海马体周围，从海马体底部闭合镊子，然后轻轻取出，尽可能完整回收。对另一侧海马体重复此操作。</li>
		<li>将打开的镊子置于其中一个纹状体下方，轻轻将其与脑组织分离。用镊子清除纹状体上残留的任何皮层组织。对第二个纹状体重复此操作。</li>
		<li>用镊子轻轻下压小脑轮廓约2毫米，以利于将小脑与脑组织分离。将镊子置于小脑后方，向前移动镊子以移除小脑。</li>
		<li>用镊子的宽部抬起中脑，以便清楚地看到其与脑干的连接处。在连接处做一垂直切口，然后移除脑干。</li>
		<li>用镊子置于中脑后方，中脑由四个圆形结构组成。垂直剪切，直至中脑完全与脑的其余部分分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据可获得的组织量，用 HS 缓冲液制备不同百分比（质量/体积）的匀浆， 即， 组织重量在10至30 mg之间制备5%匀浆，30至80 mg之间制备10%匀浆，超过80 mg则制备20%匀浆。
	<ol>
		<li>向分离的脑区加入适量的HS缓冲液，以获得预期浓度的匀浆。</li>
		<li>涡旋并检查组织是否完全浸没在HS缓冲液中。</li>
		<li>使用由硼硅酸盐玻璃管和两个研杵（A 和 B）组成的组织研磨器，对从脑区或颈段脊髓分离制备的样品进行匀浆处理。</li>
		<li>将待破碎的每个脑区直接倒入管中。插入研杵A并抽出，重复该操作约10次以解离组织。随后使用研杵B继续研磨组织，再进行约20次操作。用1 ml移液器将匀浆液转移至1.5 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，以去除未破碎的脑组织碎片。收集上清液，分装为每管200 µl，于-80 °C保存，用于后续ELISA分析。</li>
</ol>
4. 通过 ELISA 检测 αS
<ol>
	<li>将包被抗体稀释至 0.01 ng/ml。使用抗-αS 兔多克隆抗体或单克隆抗体 clone 42，溶于 50 mM Na2CO3/NaHCO3 缓冲液（pH 9.6）中。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 上述包被液，于 4 °C 过夜孵育。在使用检测抗体 syn514、clone 42、LB509、AS11、4D6 或 8A5 的 ELISA 实验中，包被液应使用抗-αS 兔多克隆抗体。当与抗-pSer129 αS 检测抗体联用时，包被液应使用抗-αS 单克隆抗体 clone 42。 
	注意：如有需要，包被后的酶标板可在 4 °C 保存一周后再进行 ELISA 检测。</li>
	<li>使用酶标板洗板机，每孔加入 300 µl 含 0.05% Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBST），洗涤 5 次。自此步骤起，所有孵育均在室温下进行。</li>
	<li>每孔加入 200 µl T20 PBS 封闭缓冲液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。</li>
	<li>将脑组织匀浆液用含 1% BSA 的 PBST 缓冲液稀释（20% 匀浆液稀释 1:100，10% 匀浆液稀释 1:50，5% 匀浆液稀释 1:25），每孔加入 100 µl。于 150 rpm 振荡孵育 2 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。</li>
	<li>将不同的 αS 检测抗体按材料列表中所述稀释比例溶于含 1% BSA 的 PBST 缓冲液中，每孔加入相应抗体溶液，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。</li>
	<li>根据检测抗体种属来源，选择抗小鼠或抗兔 IgG-HRP 二抗，用含 1% BSA 的 PBST 缓冲液按 1:8,000 稀释，每孔加入适量，于 150 rpm 振荡孵育 1 小时。用 PBST 洗涤酶标板 5 次。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液，于 150 rpm 振荡避光孵育 15 分钟。</li>
	<li>每孔加入 100 µl 1 N HCl 终止反应，随后使用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度。</li>
	<li>数据分析时，以不含任何小鼠脑组织样本的孔（空白孔）所测得的 OD 值为基准，从各待测样本的 OD 值中减去该空白值，进行校正。</li>
</ol>
5. 表位作图
<ol>
	<li>根据 Osman 所述方法进行表位作图16。简言之，将包含 12 个氨基酸的人源 α-突触核蛋白序列的肽段点样于硝酸纤维素膜上，相邻肽段之间重叠 10 个氨基酸。</li>
	<li>用含 0.05% Tween 20 和 5% 脱脂奶粉的 50 mM Tris/150 mM NaCl 缓冲液（pH 10）封闭膜。将抗体以每毫升 2 µg 的浓度溶于封闭液中，在 2–10 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>使用含 0.05% Tween 20 的 50 mM Tris/150 mM NaCl 缓冲液（pH 10）洗涤膜三次。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体进行孵育。再用相同缓冲液洗涤五次，随后使用 Western blot TMB 显色试剂盒进行染色。</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>使用 R 软件及 nlme 包进行混合效应回归分析，以建模光密度（OD）。针对每次比较，构建一个混合效应回归模型。采用固定效应来区分有症状组与无症状组。</li>
	<li>采用随机效应以反映同一只小鼠重复测量间的变异性。通过检查残差来验证同方差性；如有需要，参照 Pinheiro 和 Bates17 的方法，使用方差函数对组内误差的方差结构进行建模。将显著性阈值 P 设定为 0.05。</li>
</ol>

<ol><li>Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Lewy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">100 years of Lewy pathology.</a> Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).</li>
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<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+alpha-synuclein+seeds+do+not+invariably+induce+rapid%2C+widespread+pathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice.</a> Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).</li>
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<li>El-Agnaf, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oligomeric+forms+of+alpha-synuclein+protein+in+human+plasma+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Faseb J. 20, 419-425 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assays+for+alpha-synuclein+with+species+and+multimeric+state+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities.</a> J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).</li>
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<li>Betemps, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+spreading+in+M83+mice+brain+revealed+by+detection+of+pathological+alpha-synuclein+by+enhanced+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA.</a> Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).</li>
<li>Osman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+that+recognizes+a+potential+coeliac-toxic+repetitive+pentapeptide+epitope+in+gliadins%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins).</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).</li>
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<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+monoclonal+antibody%2C+against+human+alpha-synuclein%2C+in+a+subpopulation+of+C57BL%2F6J+mice%2C+presenting+a+deletion+of+the+alpha-synuclein+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neruosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus.</a> J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

在 M83 转基因小鼠模型的疾病过程中，通过 ELISA 方法可直接从鼠脑匀浆中特异性检测 αSD。事实上，该 ELISA 方法仅使用高盐缓冲液中的全脑匀浆，即可轻松区分患病 M83 小鼠与健康 M83 小鼠。
使用该ELISA方法获得成功结果的最关键步骤包括：通过培养必要的手动技巧来准确解剖小鼠脑部的不同区域，以防止在解剖过程中造成组织损伤；仅使用HS缓冲液进行样本稀释；以及抗体的选择，因为并非所有抗体都适用于ELISA实验体系。
尽管如此，不同小鼠之间的αSD水平仍表现出一定变异性。这些结果相当于通过抗Ser129磷酸化αS15抗体检测去污剂不溶性组分时，在患病M83小鼠中观察到的典型αSD条带的Western印迹检测结果。这表明ELISA免疫反应性对应于αSD的特异性检测。
与先前的蛋白质印迹分析结果一致15该ELISA在解剖病理性M8...

目前，在帕金森病（PD）的实验模型中检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）的方法（如免疫组织化学或蛋白质印迹）大多耗时且无法实现定量分析。这种神经退行性疾病的特点是α-突触核蛋白聚集，主要表现为包涵体形式，其中含有通常可溶性的突触前蛋白αS1,2的聚集态（即路易小体和路易神经突）。正常情况下仅有轻微磷酸化的αS，在这些包涵体中其丝氨酸129位点出现过度磷酸化3，可通过特异性靶向Ser129磷酸化αS的抗体进行检测，从而为该病理过程提供一个可靠的标志物。
最近的研究表明，在受累患者的神经系统中，αS 聚集的传播可能涉及一种“类朊病毒”机制4,5。这些研究报道，通过将含有αSD的脑组织提取物接种到表达A53T突变型人源αS蛋白的转基因小鼠模型（M83）中，可加速突触核蛋白病的发展，该模型随年龄增长出现严重的运动功能障碍6。同样地，在相同的M83小鼠模型中接种聚集态的重组αS，也证实可加速αS的聚集过程5。此外，将纤维状重组αS或来自人类DLB患者脑组织的提取物接种至C57Bl/6野生型小鼠后，也观察到磷酸化αS沉积物的形成7,8。Sacino 等9最近指出，在注射纤维状人源αS后，可在M83小鼠中诱导出广泛且进行性的脑内αS包涵体形成，但在E46K转基因小鼠或非转基因小鼠中则未见此现象，后两类小鼠中诱导出的αS包涵体仅为一过性，且主要局限于注射部位。近期在灵长类动物中的研究进一步证实，在更接近人类的物种中接种源自帕金森病（PD）患者的提取物后，αS聚集体可发生传播10。
αS 的改变与帕金森病之间的关联表明，αSD 可能是帕金森病的潜在生物标志物11。最近一项研究表明，基于使用同一抗体进行捕获和检测 αS 的传统夹心法 ELISA，可在人脑脊液（CSF）和血浆中检测到α-突触核蛋白的寡聚可溶性聚集体，该聚集体可作为帕金森病的潜在生物标志物12。基于相同方法，由于组装形式中存在多个表位拷贝，可在包括脑组织在内的生物样本中识别出多聚体蛋白13。最近，通过使用针对 αSD（5G4）的高特异性抗体 ELISA 试剂盒以及免疫沉淀法，在经证实具有路易小体病理特征的患者脑脊液中检测到了病理性的 αS14。这些方法能够区分帕金森病/路易体痴呆（PD/DLB）患者与其他类型的痴呆患者。
使用转基因小鼠模型M83，通过一种专门用于特异性识别αSD15的ELISA方法，进一步研究了αS聚集的“类朊病毒样”传播。在本研究中，我们报告了用于定量检测患病小鼠（无论是否接种了来自患病M83小鼠的αSD）中αSD的详细ELISA实验方案，尤其是针对该M83转基因小鼠模型中病理过程特异性累及的脑区4。

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>检测抗体 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Anses 实验室制备</td><td></td><td>检测抗体 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>检测抗体 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>检测抗体 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&amp;nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>检测抗体 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>检测抗体 1/500</td></tr><tr><td>克隆 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>包被抗体与检测抗体（1/2,000）</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Anderson 博士提供</td><td></td><td>检测抗体 1/2,000</td></tr><tr><td>多克隆抗-&amp;alpha;突触核蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>包被抗体</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG HRP 偶联物</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG HRP 偶联物</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG HRP 偶联物</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HS 缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>调节至 pH 7.5，并于 4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;Tris-HCl 50&amp;nbsp;mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;NaCl 750 mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;EDTA 5 mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;DTT 1 mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PBS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>调节至 pH 7.5</td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;1&amp;nbsp;mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;1.5&amp;nbsp;mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;NaCl&amp;nbsp; 137 mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;KCl 2.7 mM &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>100 mM 储存液，有毒</td></tr><tr><td>1% 磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>04&amp;nbsp;693&amp;nbsp;132&amp;nbsp;001</td><td>50 倍浓缩</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;碳酸盐缓冲液 50 mM，pH 9.6&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td>&lt;ul&gt;
&lt;li&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; &lt;/li&gt;
&lt;/ul&gt;</td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L，pH&amp;nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS 封闭缓冲液</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10 倍浓缩</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>用于 ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>用于表位定位</td></tr><tr><td>HCl 1&amp;nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>此步骤需保持在冰上</td></tr><tr><td>研磨管</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>洗板机</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>低倍放大镜&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8 倍放大</td></tr><tr><td>镊子 Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>用于解剖步骤</td></tr><tr><td>1 ml 移液吸头 Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

检测过表达人源a53t突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型elisa法

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

除了 Western blot 等既定方法外，目前仍需开发新的方法，以快速、简便地在突触核蛋白病（synucleopathies）的实验模型中定量与疾病相关的 α-突触核蛋白（αSD）。本研究采用了一种转基因小鼠品系（M83），该小鼠过表达人源 A53T 突变型 α-突触核蛋白（αS），并在 8 至 22 月龄期间自发出现显著的临床表型，表现为体重减轻、虚脱及严重运动功能障碍。为对这些小鼠中的 αSD（即疾病相关型 αS）进行分子分析，本研究设计了一种 ELISA 方法，用于特异性定量病鼠体内的 αSD。对该小鼠模型中枢神经系统的分析显示，αSD 主要存在于脑干尾部区域及脊髓中。在不同导致临床疾病的实验条件下，αSD 的分布无明显差异，即在未接种的自然衰老转基因小鼠与接种了病鼠脑组织提取物的小鼠之间，其分布模式一致。i.e.，通过 ELISA 使用抗 Ser129 磷酸化 αS 的抗体特异性检测 αSD 的免疫反应性，其结果与 Western blot 和免疫组织化学所获得的结果基本一致。出乎意料的是，使用多种针对 αS C 末端区域的其他抗体也观察到了类似结果。因此，在该小鼠模型中，可通过 ELISA 方法便捷地监测和定量 αSD 的播散过程，提示其可能涉及“类朊病毒”机制。

在本研究中，ELISA 特异性地检测了来自发病 M83 小鼠脑组织匀浆液中的疾病相关性 αS（αSD），该匀浆液使用高盐缓冲液制备。利用一种特异性识别 pSer129 αS 的抗体（p = 0.0074），ELISA 能够清晰区分年老发病小鼠（&gt; 8 月龄）与年轻健康 M83 小鼠（2–5 月龄）（图 1）。其他几种抗体也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号值（&gt; 0.6 OD）。这些抗体包括针对蛋白 C 末端不同序列区域（分别为 124–134、115–122 和 129–140）的 4D6（p = 0.01）、LB509（p = 0.0047）和 8A5（p &lt; 0.001），以及针对蛋白 N 末端（2–12）区域的 syn514，后者信号升高程度相对较小（p = 0.0003）。此外，我们实验室通过用缺失 α-syn 基因座的 C57BL/6S（B6 αS-null）19 小鼠免疫人纤维状重组 αS18 所制备的 AS11 单克隆抗体，也仅在发病小鼠的脑匀浆液中显示出同样高的信号（p &lt; 0.01）。目...

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

除了 Western blot 等既定方法外，还需要新方法来快速、简便地定量与疾病相关的 α-synuclein (αSD)……

以下实验的总体目标是利用定量ELISA方法，在帕金森病的转基因小鼠模型中监测与疾病相关的α-突触核蛋白的累积情况。该目标通过以下方式实现：首先让未接种的小鼠正常衰老，或通过脑内接种将患病M83小鼠的脑组织提取物注入小鼠体内。待小鼠出现临床疾病症状并被处死后，分离其脑组织的不同区域。接下来，使用高盐缓冲液制备各脑区的匀浆，随后对匀浆进行ELISA，以定量各脑区中与疾病相关的α-突触核蛋白。ELISA结果显示，与疾病相关的α-突触核蛋白主要在后脑区域（包括中脑和脑干）以及小鼠的脊髓中积聚。与此前可用的方法（如Western印迹或免疫组织化学）相比，该ELISA技术的主要优势在于能够快速且可靠地定量与疾病相关的α-突触核蛋白。在此实验模型中，该方法有助于监测这种蛋白在三只MA小鼠中枢神经系统中的聚集和传播，这表明该过程可能涉及类似脑部的机制，并与临床科学的发展相关。未来可进一步改进该方法，用于研究多种生物样本，例如脑脊液或血液，这些样本中也可能含有构象异常的α-突触核蛋白。演示本实验操作的人员将由本实验室的一名技术人员完成。所有涉及动物的操作和方案均符合欧盟指令 86/609/EEC，并经法国国家委员会（comm ETH）批准。出于伦理与动物实验考量，动物安乐死后，在里昂青年（Leon Young）经 A 和 S'S 认证的实验设施中进行饲养和护理，并取出小鼠的脑和脊髓。根据文本方案，将完整脑组织置于冰上低倍放大镜下的培养皿中。首先，用镊子置于其中一个嗅球后方，将其与另一个嗅球分离。通过向下的动作，将该嗅球从脑组织上剥离，随后以相同方式移除第二个嗅球。接着，用镊子固定脑组织，轻轻将另一对镊子插入左、右皮层之间，并向前移动，以分离脑的两半部分。现在继续固定脑组织。将第二把镊子置于皮层后方两毫米处，并向上施加压力，以将皮层从海马体上抬起。然后从海马体开始，向前脑方向剥离皮层的第一部分。对另一半重复上述操作。接着，将打开的镊子置于其中一个海马体周围，然后轻轻在器官底部闭合镊子，并轻柔地将其取出。对第二个海马体重复上述操作。将镊子置于其中一个纹状体后方，轻轻将其与脑组织分离。使用镊子清除纹状体上残留的任何皮层组织，然后移除第二个海马体，用镊子将小脑与其余脑组织分离，同时轻轻按压小脑的轮廓。然后将镊子置于小脑后方，向前移动镊子，利用镊子较宽的部分将脑组织抬起，以显露头端，该区域由四个圆形结构组成，可清晰观察到脑干连接的位置。随后，在移除脑干前，于连接处进行垂直切口，将镊子置于中脑后方，并沿垂直方向操作，以将其与剩余脑组织完全分离。为制备脑组织匀浆，向分离的脑区加入适量 HS 缓冲液，使匀浆浓度达到预期百分比，具体参见下表所示。使用由硼硅酸盐玻璃管及研磨杵 A 和 B 组成的组织研磨器，将待破碎的脑区组织倒入管中。随后用研磨杵 A 匀浆组织 10 次以使其充分解离，然后更换为研磨杵 B 再额外匀浆 20 次。使用移液管将匀浆液转移至1.5毫升离心管中，并对剩余脑组织样本重复匀浆操作。将样本在4°C条件下以1000 G离心5分钟，随后收集上清液并分装为每份200微升。于-80°C保存，用于后续ELISA分析以检测脑匀浆中的目标分子。首先，使用 50 微摩尔碳酸盐缓冲液将包被用抗 α-突触核蛋白兔多克隆或单克隆克隆 42 抗体稀释至 0.01 纳克/毫升，取 100 微升抗体包被液加入 96 孔微孔板的孔中，于 4 摄氏度孵育过夜。次日，向孔中加入 300 微升 PBST，使用酶标板洗板机在室温下洗涤 5 次。接下来，向每个孔中加入 200 µL T20 PBS 封闭缓冲液，在 150 rpm 条件下振荡孵育 1 小时，然后用 PBST 洗涤 5 次。按照此处列出的指南，用含 1% BSA 的 PBST 稀释脑组织匀浆液，每孔加入 100 µL。室温下于 150 rpm 振荡孵育 2 小时，之后用 PBST 洗涤 5 次。最后一次洗涤后，根据文本方案中表 2 所列比例，将相应的 α-突触核蛋白检测抗体用含 1% BSA 的 PBS BST 稀释，每孔加入适量稀释后的抗体溶液，在室温下于 150 rpm 振荡孵育 1 小时，然后同前法洗涤 5 次。随后，将抗小鼠或抗兔IgG-HRP二抗用含1% BSA的PBST按1:8,000稀释后加入，于150 RPM条件下孵育1小时，然后洗涤5次。接着每孔加入100微升TMB显色液，于150 RPM避光孵育15分钟。每孔加入100微升1 N盐酸终止反应。然后使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度，用于数据分析。用空白孔的光密度值（仅含缓冲液和试剂）从光密度中减去。根据本研究中的文本方案，对脑组织样本测定的数值进行统计分析，ELISA 特异性检测到老年病鼠 M83 的脑匀浆中存在与疾病相关的 pSer129 α-突触核蛋白，而在年轻的 M83 小鼠中未检测到。其他抗体（如 LB509）在病鼠中显示出强信号，但在健康小鼠中未检测到。本视频中所述ELIZA方法的分析灵敏度与先前描述的蛋白质印迹法进行了比较。大约10微克的脑组织当量足以从患病小鼠中产生阳性P或129位磷酸化α-突触核蛋白ELIZA信号。然而，通过蛋白质印迹法检测患病及年老M83小鼠的129位磷酸化α-突触核蛋白，则至少需要200微克脑组织样本。来自中脑、脑干和脊髓的脑匀浆样本均显示出对LB509和PSER129抗体明显的免疫反应性。然而，在其他检测的脑区中，ELISA 未检测到信号。在注射了患病 M 83 小鼠脑提取物后出现加速临床症状的 M 83 小鼠不同脑区中，免疫反应性与未接种的年老 M 83 小鼠中观察到的结果无差异。这些结果与 Western blot 和免疫组织化学获得的结果完全一致，均显示在脑和脊髓的尾侧区域存在更多的 pSer129 α-突触核蛋白沉积。一旦完成该脑区的取材，样品的制备便成为一个相当漫长且关键的步骤。需要使用高盐缓冲液来正确识别与疾病相关的纤维蛋白在临床样本中的矿物反应活性。ELISA 方法可在数小时内检测出异常的错误折叠蛋白及其外周分布。本实验步骤表明，与疾病相关的蛋白主要在脑部的特定区域以及脊髓中聚集，这一发现与此前利用蛋白质印迹法或免疫组织化学技术所观察到的结果一致。这一新的 eza 方法为脊髓小脑性共济失调相关神经病变领域的研究人员探索疾病相关 α-突触核蛋白的传播提供了途径。由于能够在小鼠中枢神经系统的各个部位精确量化该蛋白，因此该方法将特别有助于追踪某种潜在致病因素对病理发展的影响，或相反地，评估帕金森病潜在疗法的效果。

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Medicine

医学

发现疾病相关的α突触核蛋白通过增强ELISA在转基因小鼠表达人A53T的突变脑α突触核蛋白

使用蛋白酶孵育，以消化正常朊病毒，保留抗性聚集物完整。...

利用蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中错误折叠的朊蛋白聚集体

来源：Bétemps, D., 等，通过增强型ELISA检测人A53T突变α-突触核蛋白过表达转基因小鼠脑中与疾病相关的α-突触核蛋白。J. Vis. Exp.

利用ELISA检测神经退行性疾病相关蛋白α-突触核蛋白

我们介绍一种快速且低成本的筛选方法，通过高通量机器人转染和自制的双荧光素酶检测技术来鉴定转录调控因子。该方案可快速获得数千个基因的直接平行功能数据，并可轻松修改以靶向任何感兴趣的基因。...

高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

本文介绍了一种从人死后脑组织中分离出溶解度逐渐降低/聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的实验方案。通过使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，并结合高速超速离心技术，可检测病变与非病变组织中α-syn聚集特性的差异。...

从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。...

基于α-突触核蛋白的帕金森病大鼠模型通过重组腺相关病毒载体立体定向注射的建立方法

向表达人类α-突触核蛋白A53T家族性突变和萤火虫荧光素酶的Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-)小鼠腹腔或舌部外周注射α-突触核蛋白纤维，可诱导其中枢神经系统产生神经病理学改变，包括神经炎症。...

转基因小鼠外周接种α-突触核蛋白纤维后神经炎症的生物发光成像

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成...

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。...

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

介绍了一种便捷的重力灌注法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析。在帕金森病小鼠模型中，展示了磷酸化α-突触核蛋白的免疫荧光检测。本研究还全面描述了经心脏灌注、解剖、组织冷冻/包埋以及冷冻切片等步骤。...

一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

学习使用定量ELISA方法检测转基因小鼠模型中疾病相关α-突触核蛋白的积累情况。该技术可快速可靠地量化中脑、脑干和脊髓等脑区中的蛋白质水平，为研究突触核蛋白病提供重要工具。

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

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