检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

以下实验的总体目标是利用定量ELISA方法，在帕金森病的转基因小鼠模型中监测与疾病相关的α-突触核蛋白的累积情况。该目标通过以下方式实现：首先让未接种的小鼠正常衰老，或通过脑内接种将患病M83小鼠的脑组织提取物注入小鼠体内。待小鼠出现临床疾病症状并被处死后，分离其脑组织的不同区域。

接下来，使用高盐缓冲液制备各脑区的匀浆，随后对匀浆进行ELISA，以定量各脑区中与疾病相关的α-突触核蛋白。ELISA结果显示，与疾病相关的α-突触核蛋白主要在后脑区域（包括中脑和脑干）以及小鼠的脊髓中积聚。与此前可用的方法（如Western印迹或免疫组织化学）相比，该ELISA技术的主要优势在于能够快速且可靠地定量与疾病相关的α-突触核蛋白。

在此实验模型中，该方法有助于监测这种蛋白在三只MA小鼠中枢神经系统中的聚集和传播，这表明该过程可能涉及类似脑部的机制，并与临床科学的发展相关。未来可进一步改进该方法，用于研究多种生物样本，例如脑脊液或血液，这些样本中也可能含有构象异常的α-突触核蛋白。演示本实验操作的人员将由本实验室的一名技术人员完成。

所有涉及动物的操作和方案均符合欧盟指令 86/609/EEC，并经法国国家委员会（comm ETH）批准。出于伦理与动物实验考量，动物安乐死后，在里昂青年（Leon Young）经 A 和 S'S 认证的实验设施中进行饲养和护理，并取出小鼠的脑和脊髓。根据文本方案，将完整脑组织置于冰上低倍放大镜下的培养皿中。

首先，用镊子置于其中一个嗅球后方，将其与另一个嗅球分离。通过向下的动作，将该嗅球从脑组织上剥离，随后以相同方式移除第二个嗅球。接着，用镊子固定脑组织，轻轻将另一对镊子插入左、右皮层之间，并向前移动，以分离脑的两半部分。

现在继续固定脑组织。将第二把镊子置于皮层后方两毫米处，并向上施加压力，以将皮层从海马体上抬起。然后从海马体开始，向前脑方向剥离皮层的第一部分。

对另一半重复上述操作。接着，将打开的镊子置于其中一个海马体周围，然后轻轻在器官底部闭合镊子，并轻柔地将其取出。

对第二个海马体重复上述操作。将镊子置于其中一个纹状体后方，轻轻将其与脑组织分离。使用镊子清除纹状体上残留的任何皮层组织，然后移除第二个海马体，用镊子将小脑与其余脑组织分离，同时轻轻按压小脑的轮廓。

然后将镊子置于小脑后方，向前移动镊子，利用镊子较宽的部分将脑组织抬起，以显露头端，该区域由四个圆形结构组成，可清晰观察到脑干连接的位置。随后，在移除脑干前，于连接处进行垂直切口，将镊子置于中脑后方，并沿垂直方向操作，以将其与剩余脑组织完全分离。为制备脑组织匀浆，向分离的脑区加入适量 HS 缓冲液，使匀浆浓度达到预期百分比，具体参见下表所示。

使用由硼硅酸盐玻璃管及研磨杵 A 和 B 组成的组织研磨器，将待破碎的脑区组织倒入管中。随后用研磨杵 A 匀浆组织 10 次以使其充分解离，然后更换为研磨杵 B 再额外匀浆 20 次。

使用移液管将匀浆液转移至1.5毫升离心管中，并对剩余脑组织样本重复匀浆操作。将样本在4°C条件下以1000 G离心5分钟，随后收集上清液并分装为每份200微升。于-80°C保存，用于后续ELISA分析以检测脑匀浆中的目标分子。

首先，使用 50 微摩尔碳酸盐缓冲液将包被用抗 α-突触核蛋白兔多克隆或单克隆克隆 42 抗体稀释至 0.01 纳克/毫升，取 100 微升抗体包被液加入 96 孔微孔板的孔中，于 4 摄氏度孵育过夜。次日，向孔中加入 300 微升 PBST，使用酶标板洗板机在室温下洗涤 5 次。

接下来，向每个孔中加入 200 µL T20 PBS 封闭缓冲液，在 150 rpm 条件下振荡孵育 1 小时，然后用 PBST 洗涤 5 次。按照此处列出的指南，用含 1% BSA 的 PBST 稀释脑组织匀浆液，每孔加入 100 µL。室温下于 150 rpm 振荡孵育 2 小时，之后用 PBST 洗涤 5 次。最后一次洗涤后，根据文本方案中表 2 所列比例，将相应的 α-突触核蛋白检测抗体用含 1% BSA 的 PBS BST 稀释，每孔加入适量稀释后的抗体溶液，在室温下于 150 rpm 振荡孵育 1 小时，然后同前法洗涤 5 次。

随后，将抗小鼠或抗兔IgG-HRP二抗用含1% BSA的PBST按1:8,000稀释后加入，于150 RPM条件下孵育1小时，然后洗涤5次。接着每孔加入100微升TMB显色液，于150 RPM避光孵育15分钟。每孔加入100微升1 N盐酸终止反应。

然后使用酶标仪在450纳米波长下测定吸光度，用于数据分析。用空白孔的光密度值（仅含缓冲液和试剂）从光密度中减去。

根据本研究中的文本方案，对脑组织样本测定的数值进行统计分析，ELISA 特异性检测到老年病鼠 M83 的脑匀浆中存在与疾病相关的 pSer129 α-突触核蛋白，而在年轻的 M83 小鼠中未检测到。其他抗体（如 LB509）在病鼠中显示出强信号，但在健康小鼠中未检测到。

本视频中所述ELIZA方法的分析灵敏度与先前描述的蛋白质印迹法进行了比较。大约10微克的脑组织当量足以从患病小鼠中产生阳性P或129位磷酸化α-突触核蛋白ELIZA信号。然而，通过蛋白质印迹法检测患病及年老M83小鼠的129位磷酸化α-突触核蛋白，则至少需要200微克脑组织样本。来自中脑、脑干和脊髓的脑匀浆样本均显示出对LB509和PSER129抗体明显的免疫反应性。

然而，在其他检测的脑区中，ELISA 未检测到信号。在注射了患病 M 83 小鼠脑提取物后出现加速临床症状的 M 83 小鼠不同脑区中，免疫反应性与未接种的年老 M 83 小鼠中观察到的结果无差异。这些结果与 Western blot 和免疫组织化学获得的结果完全一致，均显示在脑和脊髓的尾侧区域存在更多的 pSer129 α-突触核蛋白沉积。一旦完成该脑区的取材，样品的制备便成为一个相当漫长且关键的步骤。

需要使用高盐缓冲液来正确识别与疾病相关的纤维蛋白在临床样本中的矿物反应活性。ELISA 方法可在数小时内检测出异常的错误折叠蛋白及其外周分布。本实验步骤表明，与疾病相关的蛋白主要在脑部的特定区域以及脊髓中聚集，这一发现与此前利用蛋白质印迹法或免疫组织化学技术所观察到的结果一致。

这一新的 eza 方法为脊髓小脑性共济失调相关神经病变领域的研究人员探索疾病相关 α-突触核蛋白的传播提供了途径。由于能够在小鼠中枢神经系统的各个部位精确量化该蛋白，因此该方法将特别有助于追踪某种潜在致病因素对病理发展的影响，或相反地，评估帕金森病潜在疗法的效果。