Name: 癌症细胞球体机器人生产与药物测试的双水相系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习利用双水相系统和机器人液体处理技术高通量制备癌细胞球体的方法。该技术使用聚乙二醇和葡聚糖在96孔板中形成均匀的肿瘤模型，用于抗癌药物筛选和疗效评估。

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作者感谢美国国立卫生研究院 R21CA182333 项目提供的经费支持。

1. 聚合物水相双相体系（ATPS）的制备
<ol>
	<li>称取0.5 g聚乙二醇（PEG）（分子量：35,000），加入到无菌15 ml锥形管中的9.5 ml完全培养基中，配制10 ml 5%（w/v）的水相PEG溶液。 
	注意：先将一半培养基加入锥形管，再加入聚合物，最后加入剩余培养基，可减少聚合物在管壁上的黏附，并促进其更快溶解。</li>
	<li>称取0.128 g葡聚糖（DEX）（分子量：500,000），加入到无菌1.5 ml微量离心管中的0.872 ml完全培养基中，配制1 ml 12.8%（w/v）的水相DEX溶液。</li>
	<li>将两种溶液分别涡旋约1分钟，使聚合物充分溶解于培养基中。</li>
	<li>将两种溶液置于37 °C水浴中1小时，以确保完全溶解并形成均一混合物。保持管盖位于水面以上，避免浴水污染溶液。</li>
	<li>将PEG相溶液吸入无菌塑料注射器中，通过孔径为0.2 µm的注射器滤器过滤，以去除杂质。 
	注意：将PEG溶液吸入注射器后，将其插入滤器并置于锥形管上方，缓慢施力推动溶液通过滤器。推动注射器活塞时出现一定阻力属正常现象。部分溶液会残留在滤器中，造成少量损失，但聚合物浓度不会改变。</li>
	<li>用移液器吸取10 µl DEX相溶液，于另一管中与10 µl培养基混合稀释，得到6.4%（w/v）的DEX相溶液。吸取100 µl PEG相溶液，加入培养皿中。
	<ol>
		<li>向PEG相溶液中加入0.5 µl 6.4%（w/v）DEX相溶液。在显微镜下观察DEX液滴，确认ATPS（水相分离系统）成功形成。液滴边界应清晰可见，表明存在两个稳定且分离的水相。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将储备的水相PEG和DEX溶液储存于4 °C，待用。 
	注意：建议每次实验前新鲜配制聚合物溶液，并在配制后24小时内使用。</li>
</ol>
2. 癌细胞球体打印前的准备
<ol>
	<li>培养感兴趣的癌细胞（例如， MDA-MB-157 乳腺癌细胞）接种至90%–100%融合的单层细胞中。对于 MDA-MB-157 细胞，使用含有10% FBS、1%谷氨酰胺和1%抗生素的DMEM培养基。
	<ol>
		<li>使用细胞解离缓冲液（按照制造商说明书）收集细胞，并将细胞悬液转移至15 ml锥形离心管中。在173.3 × g条件下离心5分钟，弃上清液，用1 ml完全培养基重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞加载到血细胞计数板上并进行计数，以计算获得目标类球体细胞密度所需的细胞数量。在T75培养瓶中培养的MDA-MB-157细胞，当形成融合单层时，通常可获得约7 x 10⁶个细胞6 细胞 
	注意：生成单个球形体所需的悬滴体积中的细胞密度取决于细胞类型。22 例如，密度为 1.5 x 104 建议每个0.3 µl DEX相液滴使用更多或等量的MDA-MB-157细胞，以确保形成单个球状体。</li>
	<li>再次以173.3 × g离心细胞5分钟，并用适量培养基重悬，以将细胞悬液浓缩至所需细胞密度。 
	注意：例如，如果 7 x 106 收集癌细胞，获得形成1.5 × 10⁵个细胞悬浮液所需的总体积4 在0.3 µl DEX相液滴中的细胞密度为140 µl。但由于下一步将用DEX相溶液进行稀释，因此仅使用70 µl细胞培养基重悬细胞。</li>
	<li>向所得细胞悬液中加入等体积的1.2步骤中配制的12.8%（w/v）水相DEX溶液。以1.5 × 104 细胞密度球体，将70 µl DEX相溶液加入70 µl细胞悬液中。</li>
	<li>充分混匀细胞悬液，以确保细胞均匀分布及DEX溶液充分混合。应轻柔地进行吹打，避免产生气泡。</li>
</ol>
3. 共培养球体打印前的准备
<ol>
	<li>培养癌细胞（例如， MDA-MB-157 人乳腺癌细胞）和辅助细胞（例如， 人成纤维细胞）接种至90%-100%融合的单层。使用细胞解离缓冲液（按照制造商说明书）分别收获每种细胞类型。
	<ol>
		<li>将每种悬液加入一个15 ml锥形管中，以173.3 × g离心5分钟，吸除各锥形管中的上清液。用1 ml完全培养基重悬每个锥形管中的细胞。 
		注意：可使用荧光染料（如Calcein AM（活细胞染料）和核染料（Hoechst））来区分两种细胞类型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别将每种细胞类型接种到血细胞计数板上进行计数，以计算共培养类球体中癌细胞与支持细胞所需的比例及对应数量。在T75培养瓶中培养至融合单层的MDA-MB-157细胞和成纤维细胞通常可获得约7 x 10⁶个细胞6 和约 6 × 106 细胞，分别。</li>
	<li>将支持细胞悬液按正确体积加入癌细胞悬液中，以获得两种细胞数量的期望比例。例如，使用50个癌细胞对1个成纤维细胞的比例。</li>
	<li>将含有混合细胞悬液的锥形管在173.3 × g下离心5分钟，弃上清后用适量体积的溶液重悬细胞，使最终密度为生长培养基与12.8%（w/v）水相DEX溶液（按1.2节方法制备）等体积混合。</li>
	<li>轻轻吹打所得的细胞悬液，上下混匀，以确保悬液均匀。</li>
</ol>
4. 将肿瘤类器官打印至96孔板
<ol>
	<li>实验前一天，将未处理的圆底96孔板用1% (w/v) Pluronic溶液在37 °C孵育24小时进行包被。该包被可防止细胞在培养期间贴壁。</li>
	<li>向96孔板（目标板）的每个孔中加入50 µl过滤后的5% (w/v) 水相PEG溶液。</li>
	<li>使用移液器混匀细胞悬液（分别按步骤2或步骤3制备的单培养或共培养细胞悬液），并将20 µl悬液加入384孔板（源板）某一列的每隔一个孔中。</li>
	<li>打开液体处理仪，将移液头“归位”以校准坐标。然后载入先前定义的程序（见下文4.6），确保耗材和参数设置正确。不同型号的液体处理仪，其“归位”操作可能有所不同。 
	注意：无论使用何种自动化液体处理仪，下文4.6中逐步展示的程序流程均相似；但由于软件不同，编程界面可能有所差异。</li>
	<li>将源板、目标板以及移液枪头盒放置于液体处理仪工作站上指定的位置，如图1所示。</li>
	<li>执行包含以下步骤的程序：
	<ol>
		<li>从液体处理仪的移液头加载一列移液枪头（8个）用于混匀操作，枪头来自工作站上的枪头盒（图1）。</li>
		<li>混匀源板各孔中的细胞悬液（图1）。选择的混匀体积应小于孔中细胞悬液的总体积，以避免产生气泡。</li>
		<li>将枪头弹出至空的废弃枪头盒中（图1）。</li>
		<li>从移液头加载一列10 µl分液用移液枪头（图1）。</li>
		<li>从源板中每个孔吸取0.3 µl细胞悬液进入各移液枪头（图1）。</li>
		<li>将细胞悬液分注至目标板某一列的各孔中（图1）。设置分注高度为0.5 mm，分注流速小于1 µl/sec。</li>
		<li>重复步骤4.6.1至4.6.6，直至完成目标板全部列的逐列打印。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小心地将目标板从工作站表面取出，并置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中。转移过程中保持板子水平，以避免扰动含有细胞的DEX相液滴。</li>
	<li>将板子孵育24小时，使细胞在DEX相液滴内聚集形成类球体。</li>
</ol>
5. 肿瘤细胞球体的药物处理
请注意，以下方案适用于为期4天的药物处理，包括在第2天后更换新鲜药物。该方案可根据其他处理周期进行调整。
<ol>
	<li>在24小时后通过肉眼确认96孔板中类球体的形成。如有需要，可对孔内成像，通过测量每个类球体的最小和最大直径并取其平均值来确定类球体大小。</li>
	<li>将目标药物溶解于生产商推荐的溶剂中，配制预定溶解度浓度的母液。例如，将顺铂溶于水中，浓度为2 mg/ml。 
	注意：若药物对光敏感，需将药物母液避光保存。</li>
	<li>使用梯度稀释法，用细胞培养基将上一步配制的母液稀释成所需浓度的药物工作液。每次稀释的浓度应为最终所需浓度的两倍。稀释比例将根据起始母液浓度和所需工作浓度而调整。</li>
	<li>将上一步配制的50 µl药物溶液加入每个孔中。此步骤可通过自动化设备或手动移液完成。 
	注意：由于每孔中已含有50 µl水相PEG层，加入的50 µl药物溶液将被等体积稀释，最终达到目标浓度。
	<ol>
		<li>每个药物浓度使用96孔板中两列的类球体（n=16）。</li>
		<li>在对照孔中，仅加入50 µl新鲜培养基至已有的50 µl水相PEG层中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将类球体在37 °C、5% CO2条件下与药物共孵育48小时，并避光保存。</li>
	<li>孵育48小时后，重新配制所需浓度的新鲜药物稀释液，并向每孔加入50 µl新鲜药物溶液以更换药物。 
	注意：此时各孔中已含有第一次给药后的目标药物浓度。因此，在此换药阶段，各浓度应直接配制成目标浓度，不再发生稀释。</li>
	<li>将类球体继续在37 °C、5% CO2条件下与药物共孵育48小时，并避光保存。</li>
</ol>
6. 类球体中细胞活力的分析
<ol>
	<li>孵育48小时后更换新鲜药物（即，类球体与药物的总处理时间为4天），通过手动移液测量一个孔中培养基的总体积。 
	注意：每孔典型体积约为 140 µl（由于蒸发会略有减少）。</li>
	<li>计算细胞活力试剂的体积（例如， PrestoBlue）按总体积的10%浓度加入。将此体积的细胞活力检测试剂加入每个孔中。 
	注意：当孔中已有培养基体积为 140 µl 时，需加入 15.6 µl 的溶液，以达到孔内总体积的 10% 浓度。该数值通过将现有培养基体积除以 9 计算得出（140 µl / 9 = 15.6 µl）。</li>
	<li>将细胞活力检测试剂加入各孔后，于37 °C避光孵育6小时。</li>
	<li>将培养板放入微孔板读数仪中，分别在激发波长560 nm和发射波长590 nm条件下读取荧光信号。</li>
	<li>通过将相同处理条件下处理孔的荧光信号平均值与对照孔的荧光信号平均值进行归一化，计算类球体中细胞的存活率百分比。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

类器官球为更深入理解肿瘤生理学及药物疗效提供了逼真的模型，同时为抗癌药物研发提供了有力工具。若能采用仅需常规实验器皿、液体处理工具和筛选设备的简单类器官球生成与维持技术，将极大促进上述应用。利用水相两相系统可使癌细胞在液滴相内自发聚集，从而借助自动化液体处理机器人高效地生成并维持类器官球。 原位 使用商业试剂和工具对细胞反应进行药物处理和终点分析。因此，该技术相较于现有的三维癌细胞培养方法具有显著优势，并提供了一个可加速药物发现的筛选平台。
在微孔板中生成大小均一的球状体对于高通量筛选应用至关重要，可确保所有球状体具有相似的基础细胞活性水平。使用带有空气置换移液机制的液体处理设备时，必须通过量化关键液体处理参数（分配高度、分配流速和预吸入空气体积）对水相DEX相分配效果的影响，来优化分配过程。该优化可使移液头将黏稠的DEX相溶液和癌细胞扫入孔中，从而形成均一的球状体。尽管本方案中已针对SRT Bravo液体处理设备确定了这三个参数的具体数值，但对其他液体处理设备也应采用类似方法，以确定最佳分配条件，从而在浸没的PEG相中实现稳定且一致的DEX相液滴尺寸分配。此外，...

基于细胞的检测方法为新型抗癌药物的研发与发现提供了重要工具。1,2 历史上，研究人员常采用癌细胞的单层培养模型来评估候选化合物对特定类型癌细胞的抑制效果。单层培养可在标准培养板中便捷地维持，且标准培养板与商业化机器人加样系统及用于检测细胞对化合物反应的下游分析设备具有良好兼容性，这些优势使二维（2D）培养成为药物筛选中一种颇具吸引力的工具。3 遗憾的是，单层细胞实验通常无法准确预测化合物的药效 体内 使得药物研发和发现成为一个极其昂贵的过程。4,5 尽管制药公司和学术机构投入了大量资金和努力，但在过去二十年中，临床试验中的抗癌药物仅有约1%获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。6 二维培养与癌细胞复杂三维微环境之间的差异 体内 是单层培养系统的一个主要缺陷。7 因此，在更接近三维肿瘤环境的条件下对候选化合物进行肿瘤细胞筛选，可能加速新型化疗药物的开发。8
肿瘤细胞球体是一种相关的体外三维肿瘤模型in vitro。9,10 球体是通过癌细胞在非黏附表面或悬浮条件下自发或诱导聚集形成的致密细胞簇，常用技术包括旋转瓶法、液体覆盖法、微加工微孔阵列、微流控技术和悬滴法等。11-16 球体模拟了实体瘤的关键特征，包括其几何结构以及氧气、营养物质和药物化合物向中心区域的有限扩散；因此，与单层培养相比，它们能更真实地再现实体瘤对药物的反应。17-19 尽管具有显著优势，球体培养目前尚未常规用于针对癌细胞的化合物筛选。在标准高通量条件下制备大小均一的球体存在困难，且需兼容市售的机器人系统及筛选/成像工具，这阻碍了球体培养在药物研发流程中的应用。尽管近年来已有定制材料和培养板上市以满足该需求，但成本因素限制了其广泛使用。
两种能够高通量生成尺寸均一的类球体的主要技术分别采用新型悬滴平台和微加工微孔阵列13,16,20。然而，这两种方法均需要特殊的培养板和装置，其制造成本高昂，且对于核心研究中心和制药工业等主要开展新型抗癌药物研发的终端用户而言使用不便。尽管近期悬滴板设计在含细胞液滴的稳定性方面有所改进，培养过程中仍只能使用板上每隔一个的孔位，以避免液滴扩散或融合16，这显著降低了实验通量。此外，药物添加与更换难以通过手动或机器人移液完成，且由于该板型与常规筛选设备（如酶标仪）不兼容，类球体需转移至标准培养板中进行生化分析21。利用软光刻技术制备的微孔阵列也可实现尺寸可控的类球体生成13,20。然而，该平台与标准移液工具不兼容，无法对单个类球体施加不同药物化合物或浓度处理，导致所有类球体暴露于相同的处理条件下。因此，该方法不适用于需要同时测试多种化合物或浓度的高通量化合物筛选。
为了克服这些障碍，已开发出一种新技术，可在标准的96孔板中高通量地生成大小均一的癌细胞球体。22,23 该方法基于一种由聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（DEX）作为成相聚合物的聚合物水相两相系统（ATPS）。24 近年来，ATPS已被应用于多种新型细胞生物学研究中，可在高度水性的介质中实现细胞微图案化以及生物试剂对细胞的局部递送。25-32 为形成球体，将癌细胞与水相DEX相混合，然后将所得悬液的亚微升液滴移入含有浸没式水相PEG相溶液的孔中。该液滴与浸没相不混溶，从而将细胞限制在液滴内，促进球体的形成。重要的是，高度水性的浸没相可为球体中的细胞提供营养，并显著减轻某些其他检测方法中常见的培养基蒸发问题，从而避免培养基渗透压变化及药物浓度波动。该技术仅需使用市售试剂和移液工具，在标准96孔板中即可完成球体生成和药物处理。关键的是，可直接在同一块板中利用标准生化检测方法和酶标仪对球体的细胞反应进行分析。ATPS操作简便，且该方法易于与自动化液体处理机器人系统结合，使得单培养和共培养球体的高通量生成成为一种简单可行的实验室技术。这一新方法将大大推动癌细胞球体在药物研发与发现过程中的整合，显著提升检测通量和成本效益（增加被测化合物数量并减少试剂消耗）以及实验效率（减少人工操作时间）。
以下详细描述了使用ATPS方法在96孔板中通过机器人系统制备癌细胞球体的实验方案。此外，还介绍了对所获得的细胞球体进行药物处理，以及利用商业化的生化检测试剂盒对细胞反应进行下游分析的具体步骤。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂与耗材&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>聚乙二醇，分子量：35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖，分子量：500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>顺铂</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>一次性吸头（10 &amp;micro;l）</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>一次性吸头（70 &amp;micro;l）</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>圆底96孔板</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>液体处理仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>微孔板读板仪</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

利用水相两相系统进行癌症细胞球体的机器人化生产以用于药物测试

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

肿瘤细胞球体是一种相关的 体外 用于抗癌药物测试的无血管肿瘤模型。本文描述了一种在高通量96孔板中制备单细胞培养和共培养球状体的详细方案。该方法利用水相两相系统，将细胞限制于浸没在第二水相中的较密水相液滴内。液滴附着于孔板表面，使细胞保持紧密接触，从而形成单个球状体。该技术已适配于自动化液体处理机器人，可生成尺寸可控的球状体，并加快球状体制备过程，适用于化合物筛选应用。经临床使用药物处理的球状体表现出随药物剂量增加而降低的细胞活力。采用标准微孔板进行球状体生成，可直接利用微孔板读数仪分析药物处理后球状体中癌细胞的活力。该技术既可通过自动化机器人实现，也可通过手动移液器等其他液体处理工具简便操作。

关键词：无血管肿瘤模型，抗癌药物测试，球状体，水相两相系统，96孔板，高通量筛选，细胞活力，自动化液体处理

机器人液体处理工作站如图1所示。图中标注了第4.6节中用于类球体机器人打印的所有站位和移液头。图像显示使用了两个不同的吸头盒站位（一组吸头用于混匀，另一组用于吸取和分配细胞悬液—水相DEX相混合物）。整个装置置于标准生物安全柜内，以保持无菌环境。图2展示了利用水相两相系统进行“打印”过程的示意图。装有细胞悬液（蓝色，图案化相）的移液吸头浸入96孔板的圆底孔中，该孔内含有水相PEG相（粉色，浸没相），并将内容物释放至孔底附近。形成的DEX相液滴可限制癌细胞扩散，并促进细胞间相互作用，从而诱导细胞聚集并形成类球体。类球体的形成是自发的，在孵育24小时内即可完成，如图2的实验图像所示。实际操作中，该类球体打印在96孔板中按列依次进行。类球体形成后，通过直接添加新鲜培养基更换培养液，使两相系统转变为单一水相。这一转变是由于PEG和DEX浓度降低至低于维持水相PEG与DEX相分离所需的阈值浓度所致。
通过参数优化，对液体处理仪传统的空气置换移液机制进行了调整，发现当 dispensing 高...

本文介绍了一种利用水相两相系统在96孔板高通量格式中进行癌细胞球体机器人打印的实验方案。

肿瘤细胞球体是用于抗癌药物测试的无血管肿瘤相关体外模型。一种制备……的详细方案

本实验的总体目标是采用标准的高通量格式制备癌细胞的 pH 环境，以便用于抗癌药物的筛选。该目标首先通过将两种聚合物——聚乙二醇和葡聚糖——以预定浓度溶解于细胞培养基中，形成稳定的水相双相体系来实现。第二步是将目标细胞配制成所需细胞密度两倍的浓度，并将细胞悬液与等体积的水相葡聚糖相混合。然后，将水相聚乙二醇相加入96孔板中，并使用液体处理机器人向各孔中分配含有细胞的葡聚糖相亚微升液滴。下一步是在孵育24小时后确认96孔板中类球体的形成，并直接向孔中加入感兴趣的抗癌药物。最后，采用标准酶标仪兼容的活力检测方法，测定经药物处理的类球体相对于未经处理的对照类球体的存活率百分比。与现有的悬滴法或微加工微孔方法相比，该技术的主要优势在于无需使用定制的培养板或装置，即可实现高通量的细胞球体形成和药物筛选。该方法有助于回答癌症研究中的关键问题，并加速抗肿瘤化学治疗药物的发现。该技术的应用前景广泛，尤其在癌症治疗领域，因为它能够利用更具临床相关性的肿瘤模型进行高通量化学化合物筛选，从而识别新的抗肿瘤药物。初次使用该方法的研究人员可方便地制备癌细胞类固醇和微孔板，并可利用标准实验服和机器人工具轻松开展药物处理实验。首先，称取 0.5 克聚乙二醇，加入无菌 15 毫升锥形管中的 9.5 毫升完全培养基中，涡旋混合 1 分钟，以制备 10 毫升浓度为 5%（质量/体积）的水相聚乙二醇溶液。然后称取 0.128 克葡聚糖，加入 0.87 毫升溶液中。在无菌的1.5毫升微量离心管中加入2毫升完全培养基，涡旋振荡1分钟，制备1毫升12.8%（质量/体积）的水相葡聚糖溶液。将聚乙二醇和葡聚糖溶液均置于37摄氏度水浴中孵育1小时。为促进完全溶解。确保管盖保持在液面以上，以避免一小时后可能发生的污染。移除聚乙二醇面部溶液，并将其装入一个五毫升无菌塑料注射器中。使用孔径为0.2微米的注射器滤器过滤溶液，以去除任何杂质。将聚乙二醇和葡聚糖两相溶液在4摄氏度下保存，最多可保存24小时后再使用。培养目标癌细胞（如M-D-A-M-B 1 57乳腺癌细胞系），直至细胞融合度达到90%至100%。然后使用标准技术收获细胞，并在血细胞计数板上计数，将细胞沉淀重悬于半培养基与半悬浮液的混合液中，使其浓度达到每毫升5000万个细胞。这样可确保每个0.3微升液滴中含有约15,000个细胞。将过滤后的5%水相聚乙二醇溶液每孔50微升加入已预先用条形码标记的非黏附性96孔板中，具体标记方法见配套文本方案。聚乙二醇添加可使用多通道移液器手动操作，或使用液体处理机器人完成。用移液器轻轻吹打细胞悬液，使其充分混匀。将随时间沉降的任何细胞重新悬浮。取20微升悬浮液加入384孔板一列中的每隔一个孔。然后打开液体处理仪，并将移液头归位至原点。为注册坐标，请将源板、目的板以及移液枪头盒放置在液体处理工作站上指定的位置。使用自动液体处理仪，选择混匀体积，约为细胞悬液体积的三分之一，并从工作站中用混匀用移液枪头加载液体处理仪移液头的一列枪头。使用液体处理仪对384孔源板中的细胞悬液进行混匀。然后将吸头弹入空的废吸头盒中。接下来，从移液头的一个通道加载10微升分配吸头。使用液体处理仪从源板中吸取0.3微升细胞悬液至每个吸头中。然后将细胞悬液加入目的板一列孔中，每孔含有50 µL的5%聚乙二醇相。加样高度为0.5 mm，以每秒1 µL或更慢的流速滴加。重复此过程，直至目的板的所有列均接种细胞。完成后，小心将目的板从工作站中取出，并在37 °C、5% CO₂的湿化环境中孵育24小时，之后再进行任何药物处理。在培养24小时后，目视确认96孔板中每个孔内的类固醇形成情况。通过连续稀释法配制待测药物（如顺铂）。将药物原液用培养基稀释，使每种稀释液的浓度均为最终所需浓度的两倍。每块96孔板最多可测试五种不同浓度。将50微升药物溶液加入每个孔的聚乙二醇相中。每个处理组使用八列中的两列，共八个孔，包括仅添加培养基的对照组。将类固醇与药物在37摄氏度、5%二氧化碳、避光条件下共同孵育48小时。48小时后，配制新鲜的药物稀释液，并通过加入50微升含有所需浓度新鲜药物的培养基来更换药物。将PHE再继续在37摄氏度、5%二氧化碳、避光条件下孵育48小时。接下来，按照随附的文字实验方案，向每个孔中加入细胞活力检测试剂，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下避光孵育6小时。当检测完成后，将培养板放入微孔板读数仪中，分别在激发波长560纳米和发射波长590纳米处读取荧光信号。抗癌药物的高通量筛选需要一种可重复的方法，以形成数百个大小均一的类固醇结构。此处所示的图表强调了该方法在形成类球体方面的可重复性。在标准的96孔板中，类球体的平均直径为332微米，标准偏差小于10%。类球体直径的变异符合正态分布特征。当类球体暴露于不同浓度的顺铂（一种临床化疗药物）中四天后，它们对处理表现出剂量依赖性反应。结果显示，药物的半数致死浓度为 4.67 µM。在致死浓度下，药物处理可使癌细胞孢子解体。一旦掌握该技术，整个实验可在约两小时内完成。在进行类固醇打印实验之前，必须迅速检查是否形成水相两相体系。在完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法，如对样本进行冷冻切片、类固醇免疫组织化学染色以及其他生物学检测，以探究药物在癌细胞类固醇中作用的分子靶点等相关问题。观看本视频后，您应能充分理解如何以便捷的方式构建三维癌细胞培养体系，并利用标准板和设备以高通量方式开展药物筛选测试。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

癌症细胞球体机器人生产与药物测试的双水相系统

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使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

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一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

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基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

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CAR T细胞介导的类球体杀伤实验

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一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

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多细胞球体的制备及多参数活细胞荧光寿命成像显微镜（FLIM）分析

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