Name: 可扩展的96孔板基于IPSC的文化和生产用机器人液体处理系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解如何使用可编程液体处理机器人在96孔板中进行可扩展的人诱导多能干细胞培养。该方法可在20代传代后维持正常核型和多能性，并支持分化为心肌细胞，适用于再生医学和个性化治疗研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目R44 GM087784和R01 HL109505的资助。作者感谢Gilson, INC公司的技术团队和OEM团队提供的长期技术支持。

机器人液体处理系统（在以下方案中为Gilson公司的pipetmaX）可在96孔板格式中维持传统的贴壁培养条件，同时实现干细胞培养与生产的自动化和可扩展性。与传统的6孔板培养类似，诱导多能干细胞（iPSCs）在此方案中以单层形式生长为独立的克隆集落，但采用的是96孔板格式。每个孔可以是同基因型或不同基因型，且由于机器人能够将各孔分隔开来，因此两种配置均可并行培养。典型的机器人iPSC培养流程包括两个阶段：喂养程序，即按照可自定义的时间表对细胞进行换液；传代程序，由用户选择解离方法和分种比例，从而控制接种密度和扩增速率。以下方案详细描述了如何启动新的培养、如何完成喂养与传代操作，以及支持iPSC培养的辅助程序。
注意：有关以下方案已验证的基质包被材料和解离试剂的具体建议，请参见材料列表。
1. 准备包被细胞外基质凝胶的96孔板
<ol>
	<li>从六个新的室温 96 孔板中移除包装，并将其放置在液体处理机器人工作台的 2、3、5、7、8、9 号位置（参见 图 1A 以了解工作台位置）。</li>
	<li>将一个预冷的、4 °C 的 4 孔槽放置在工作台 6 号位置。</li>
	<li>在工作台 1 号位置的吸头架第 12 列中装入预冷的、4 °C 的 200 µl 吸头。</li>
	<li>使用无菌操作技术，倾倒一份 aliquot 将 25 ml 4 °C 的 DMEM/F12 加入工作台 6 号位置中最左侧的第一个槽孔中。或者，可使用移液器完成转移。</li>
	<li>取下 96 孔板盖，并将每个板盖滑入专门设计的板盖支架（PLHR，参见 图 1A）。避免接触板盖内部。 
	注意：接触板盖内部，或将多个板盖堆叠导致一个板盖内面接触另一个板盖外表面，极易造成污染。</li>
	<li>使用机器人控制触摸屏，按下以下系列按钮以启动孔板预润洗过程：
	<ol>
		<li>点击“运行程序”。</li>
		<li>选择“细胞外基质凝胶预润洗”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。 
		注意：机器人不会实际运行，而是软件对协议进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行程序”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在预润洗过程（步骤 1.6）进行期间，继续执行步骤 1.8。</li>
	<li>将一份储存在 -80 °C 的 50 ml 锥形管中的 4 mg 生长因子减少型细胞外基质凝胶（GFRM）在冰上解冻。保持该 aliquot 在冰上，直至准备使用。 
	注意：若让 GFRM 升至室温，其将凝固并无法使用。</li>
	<li>使用 25 ml 玻璃移液管将 4 mg GFRM aliquot 重悬于 24 ml 4 °C 的 DMEM/F12 中。在转移 DMEM/F12 时，暂停 2–3 秒，使移液管冷却后再重悬 GFRM aliquot。</li>
	<li>当预润洗过程（步骤 1.6）完成后，继续执行步骤 1.11。</li>
	<li>将 24 ml DMEM/F12 与 GFRM 的混合液转移至工作台 6 号位置槽孔的第四个孔中。</li>
	<li>使用机器人控制触摸屏，按下以下系列按钮以启动细胞外基质凝胶包被过程：
	<ol>
		<li>点击“运行程序”。</li>
		<li>选择“细胞外基质凝胶 aliquot”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。 
		注意：机器人不会实际运行，而是软件对协议进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行程序”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当步骤 1.12 完成后，重新盖上孔板盖。</li>
	<li>将包被了细胞外基质凝胶的 96 孔板转移至 37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中，孵育 24 小时，之后孔板即可使用或储存。 
	注意：在特殊情况下，新包被的细胞外基质凝胶孔板可在孵育 15–30 分钟后使用，但推荐孵育过夜至 24 小时。</li>
	<li>重复操作步骤 1.1、1.3、1.5–1.6、1.10 以及 1.12–1.14，直至所有含 GFRM 的 DMEM/F12 用完为止。</li>
</ol>
2. 储存包被有细胞外基质凝胶的96孔板
<ol>
	<li>从37 °C、5% CO2、湿润培养箱中取出包被有细胞外基质凝胶的96孔板。</li>
	<li>可选：在进行步骤2.3之前，让包被有细胞外基质凝胶的96孔板恢复至室温（RT）。 
	注意：此可选步骤可减少将板置于4 °C时产生的冷凝水。</li>
	<li>将板放置在液体处理机器人工作台的2、3、5、7、8、9号位置（参见图1A中的工作台位置）。</li>
	<li>在1号位的吸头架第12列中装入室温&#160;200 µl 吸头。</li>
	<li>在6号位的工作台上放置一个四槽储液槽。</li>
	<li>用室温DMEM/F12培养基填充储液槽的第4孔（最右侧孔）。</li>
	<li>取下96孔板盖，将每块板滑入PLHR中。</li>
	<li>使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：
	<ol>
		<li>点击“运行程序”。</li>
		<li>选择“细胞外基质凝胶分装”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决定：点击“测试运行”，以使用分步向导预测试所选程序。 
		注意：机器人不会实际运行，而是软件对程序进行检测以发现潜在的软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行程序”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>程序完成后，重新盖上板盖，并将板从机器工作台上取下。</li>
	<li>用一条1英寸×6英寸的石蜡膜条，围绕每块包被有细胞外基质凝胶的96孔板的整个侧面（即板盖与板体接合处）缠绕一圈。务必拉紧石蜡膜，以形成气密性密封。</li>
	<li>可选：在板上标记完成细胞外基质凝胶包被的日期、细胞外基质凝胶批号、使用者姓名及其他相关信息。</li>
	<li>将板储存在4 °C，可在此条件下保存并使用长达两周。 
	注意：已有成功使用超过两周的案例，但不推荐。</li>
</ol>
3. 在96孔板中从活细胞或冻存细胞培养物进行干细胞克隆接种密度梯度实验：如何启动或恢复干细胞系的正常传代间隔
<ol>
	<li>若起始材料为冻存细胞，继续进行步骤 3.2；若起始材料为已接种于培养板中的活体干细胞培养物，请从步骤 3.5 开始。</li>
	<li>将冻存管置于 37 °C 水浴中轻轻摇晃，直至仅剩少量冰块未融化，完成细胞解冻。</li>
	<li>可选：将解冻后的细胞用 10 ml 室温干细胞生长培养基（SCGM）稀释，以 300 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，并将干细胞沉淀重悬于 7 ml 含 10 µM Y27632 的新鲜 SCGM 中。 
	注：此步骤可去除残留的冻存保护液。</li>
	<li>继续进行步骤 3.6。</li>
	<li>若起始材料为已接种的活体干细胞：使用酶法或非酶法解离细胞，按常规方法传代。尽量收获总计 1.5–3 百万个细胞（通常为六孔板中的一个孔）。将收获的细胞以 300 × g 离心 2 分钟，吸除上清液，并将干细胞沉淀重悬于 7 ml 含 10 µM Y27632 的新鲜 SCGM 中。继续进行步骤 3.6。</li>
	<li>确保来自冻存或活体培养的细胞均已被重悬于含 10 μM Y27632 的 7 ml 室温 SCGM 中。</li>
	<li>在一号床位置的移液枪头架第 12 列中装入室温 200 µl 枪头。</li>
	<li>在二号床位置放置一个四槽储液槽。</li>
	<li>在五号床位置放置一个预先加热至 37 °C 的、涂有细胞外基质凝胶的新 96 孔板，并取下盖子，将其放入 PLHR 中。</li>
	<li>通过移液或无菌倾倒方式，将 7 ml 重悬细胞液转移至储液槽的第 3 孔中。
	<ol>
		<li>使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：</li>
		<li>点击“运行程序”（Run a Protocol）。</li>
		<li>选择“接种密度梯度”（Seeding Density Gradient），然后点击下一步。</li>
		<li>用户决策：点击“测试运行”（test run）以使用分步向导预测试所选程序。 
		注：机器人不会实际运行，软件将检测所选程序是否存在软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”（skip setup）亦可接受。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“运行程序”（Run Protocol）。</li>
	<li>当稀释程序完成后，重新盖上培养板盖子，并将其置于 37 °C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中，等待下一次换液。</li>
	<li>可选：在培养板上标记日期、品系信息、使用者姓名、培养基类型及其他相关信息。</li>
	<li>在接下来的几天中，根据需要按照下方协议 4 对 96 孔板进行换液。 
	注：典型的干细胞培养板需每 24 小时进行一次完全换液；用于换液的 SCGM 中不含有 Y27632，Y27632 仅在传代后初次接种时使用。换液前应检查培养板是否存在污染及克隆密度。有关克隆密度监测的更多说明，请参见步骤 3.16。</li>
	<li>在接下来的几天中，培养板中央附近的若干列（通常为第 5–8 列）将接近理想的传代密度；为确定该密度，请结合以下信息，将 96 孔板与图 3B所示的密度范围进行比较：
	<ol>
		<li>当大多数克隆之间的间隙约为相邻克隆直径的 25% 时，进行传代。 
		注：确定传代时机的依据是，若再经历一次喂养和生长周期，克隆将发生接触，应避免此情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为启动均匀稀释的培养板并进入常规培养，请选择一个达到理想密度的列进行传代。参见协议 5 进行传代操作。</li>
</ol>
4. 喂养96孔板中的干细胞克隆
注意：以下方案描述了对一个96孔干细胞克隆板的喂养操作。该技术可扩展至同时处理总共6个板。
<ol>
	<li>从 37 °C、5% CO2、湿度控制的培养箱中取出 96 孔干细胞克隆板。</li>
	<li>检查培养板是否存在污染及细胞密度。为进行换液，需确保克隆密度低于理想的传代密度。有关密度的信息，请参见 图 3B。 
	注意：污染可能表现为培养基浑浊，并伴有难闻气味。在显微镜下检查时，也可能观察到微小且明显非 iPSC 的细胞团块。有关细胞密度的评估，请参见上述步骤 3.16.1。</li>
	<li>将 96 孔干细胞克隆板放置于床位置 3 的倾斜 37 °C 斜坡上。</li>
	<li>在床位置 1 的吸头架第 12 列中装入室温（RT）200 µl 移液吸头。</li>
	<li>在床位置 2 放置一个 4 孔槽试剂槽。</li>
	<li>通过无菌倾倒或移液转移，将 8 ml 新鲜的室温（RT）不含 Y27632 的 SCGM 加入床位置 2 的试剂槽第 3 孔中。</li>
	<li>取下 96 孔干细胞克隆板的盖子，并将其放入 PLHR 中。</li>
	<li>使用机器人控制触摸屏，按下以下按钮组合：
	<ol>
		<li>点击“运行程序”。</li>
		<li>选择“克隆换液单板程序”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决定：点击“测试运行”，以使用分步向导预测试所选程序。 
		&#8203;注意，机器人不会实际运行，软件仅检测程序是否存在软件问题。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行程序”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当换液程序完成后，重新盖上 96 孔干细胞克隆板的盖子，并放回 37 °C、5% CO2、湿度控制的培养箱中，直至下次换液或传代。通常在 24 小时后需要进行下一步操作。 
	注意：建议在培养板盖子上记录换液事件，包括日期、培养基类型、操作者姓名及其他相关信息。</li>
</ol>
5. 96孔板干细胞克隆的传代
<ol>
	<li>经过数个培养周期后，96孔干细胞克隆板将准备进行传代。本方案描述将一列细胞传代至一个完整的96孔板，相当于1:12的传代比例。用户可根据需要自定义传代比例，并选择任意数量的孔或列进行传代，包括非相邻的孔位。</li>
	<li>将96孔干细胞克隆板的密度进行比较 图3B 以确定是否进行传代。理想的传代密度为：大部分菌落之间的间距约为相邻菌落直径的25%，或继续培养将导致菌落相互融合生长。</li>
	<li>在显微镜下检查96孔干细胞克隆板，确保无污染。</li>
	<li>将96孔干细胞克隆板放置在斜置的37 °C斜坡上第3号床位置。</li>
	<li>在1号床位置的吸头装载架上，将第8至12列装载200 µl常温吸头。</li>
	<li>将一个4孔槽置于2号床位置。</li>
	<li>1号孔保持空置，2号孔加入8.5 ml SCGM + 10 µM Y27632，3号孔加入3.5 ml 30% 蛋白水解和胶原水解解离试剂（或EDTA为基础的解离试剂），4号孔加入4.5 ml PBS。 
	注意：所有试剂可使用室温或37 °C的溶液。本研究所述的脂肪组织和成纤维细胞来源的iPSC培养使用了以PBS稀释至30%的室温蛋白水解和胶原水解解离试剂。</li>
	<li>将一个预先在37 °C温育的新细胞外基质凝胶包被的96孔板放置于5号位置。</li>
	<li>移除96孔干细胞集落培养板的盖子和新的96孔板盖子，并将两者均放入PLHR中。</li>
	<li>使用机器人控制触摸板，按下以下按钮组合：
	<ol>
		<li>点击“运行实验方案”。</li>
		<li>选择“Colony Split 1:12 Column 1”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决策：点击“测试运行”以使用分步向导对所选程序进行预测试。 
		注意：机器人不实际运行，而是由软件对方案进行软件问题测试。对于已建立的方案，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行方案”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待传代操作步骤完成后，重新盖好两块培养板的盖子。</li>
	<li>可选：在新培养板上标注所需信息（即日期、细胞系、传代次数、培养基类型、用户名 等等。).</li>
	<li>将两块培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2，置于加湿培养箱中，直至下次换液或传代。注意：通常在24小时后进行下一次换液。 
	注意：细胞和克隆在传代后 2–3 小时内应贴附于培养板上，并呈现明显的铺展状态。这是由于存在 Rho 激酶抑制剂，随后细胞将收缩并表现出特征性的干细胞形态（即， 首次无Rho激酶抑制剂培养后，形成鹅卵石样紧密集落，细胞体积与细胞核大小之比较小。</li>
</ol>
6. 收获96孔板干细胞用于生产
注意：干细胞集落可在培养期间的任意时间点收获并使用。通常在细胞准备传代时进行（参见方案5）。本方案描述了如何从一块96孔干细胞集落板中收获十一列细胞。
<ol>
	<li>在显微镜下检查96孔干细胞克隆板，确保无污染。</li>
	<li>将96孔干细胞克隆板放置在3号床位置的倾斜37 °C斜坡上。</li>
	<li>在1号床位置的吸头装载架中，装入第11列和第12列的RT 200 µl移液吸头。</li>
	<li>在2号床位置放置一个4孔槽。</li>
	<li>第1孔槽留空，第2孔槽中加入8.5 ml SCGM，第3孔槽中加入3.5 ml 30%蛋白水解和胶原水解解离试剂（或EDTA基解离试剂），第4孔槽中加入4.5 ml PBS。 
	注意：所有试剂可置于室温或37 °C。</li>
	<li>取下96孔干细胞克隆板的盖子，并将其放入PLHR中。</li>
	<li>使用机器人控制触摸面板，按下以下按钮组合：
	<ol>
		<li>点击“运行程序”。</li>
		<li>选择“克隆收获第2-12列”，然后点击下一步。</li>
		<li>用户决定：点击“测试运行”以使用分步向导预测试所选程序。 
		注意：机器人不会实际运行，而是软件对所选程序进行软件问题检测。对于已建立的程序，点击“跳过设置”是可接受的。</li>
		<li>点击“运行程序”。 
		注意：一旦收集程序完成，细胞将位于第2孔槽中，可进行收集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者 MKC、MJG、EEB、NJD 和 RO 在本研究开发期间是或曾是 InvivoSciences, INC 的员工，该公司构想并开发了本文所述的机器人操作方案。TW 是 InvivoSciences INC 的首席科学官。SH 是 Gilson INC 的员工。

在本研究中，我们建立了一种用于iPSC制备的机器人化培养方法，可在96孔板体系中实现换液和传代的微型化与自动化，同时支持高效的扩增。采用液体处理机器人定期对iPSC克隆进行换液，并通过酶解法以固定时间间隔进行传代。机器人还被编程用于制备包被有细胞外基质凝胶的培养板，并建立接种密度梯度。当成纤维细胞来源和脂肪组织来源的iPSC在此系统中培养超过20代（约3个月）时，仍能维持其多能性及稳定的核型。两个细胞系均能够分化为心肌细胞。综上所述，本文所描述的一系列方案使得缺乏干细胞培养经验或缺乏专业培养设备的使用者，能够以较低的劳动强度和成本实现干细胞的培养，并获得高效的细胞产量或多细胞系并行处理能力。
本文详述的机器人操作方案为诱导多能干细胞（iPSC）的生产与处理提供了经济高效的扩增方法。其优势之一在于，采用已建立的基于培养板的扩增体系，可维持细胞的多能性，这一点已在本研究及先前的研究中得到证实44,47–49。尽管其他可扩展的干细胞培养体系也能获得多能性细胞20,23,29，但该基于培养板的方法几乎无需改变原有培养体系，例如无需适应悬浮培养、无需使用消泡剂或长期使用Rho激酶抑制剂20。因此，由于培养条件相似，该方法能够快速且可预测地适应新细胞系的培养。随着iPSC在疾病建模中的应用日益增加4,6,19,50，新的iPSC细胞系被持续建立。本文所述技术特别适用于中高通量、大规模地培养新细胞系，因为转入该体系的技术门槛较低。在维持细胞集落所需的劳动力和设备方面，同样具有此优势。最后，由于该培养体系及操作方式与iPSC细胞系建立和验证时所用环境相似，其培养表现（如定向分化能力）更可能具有可预测性。
图8 展示了一种在96孔板中扩大干细胞生产的策略。一个孔板（第0周期）通过机器人接种12个新孔板，实现12倍扩增（第0周期到第1周期）。经过数天的培养后，这12个孔板中的其中一个被传代以接种另一组12个新孔板（第1周期到第2周期）。其余11个孔板则可用于其他用途，代表该系统的生产部分。按照此速率，每次传代一个孔板，每个周期（即每3-4天）可提供11个孔板。当多个孔板同时进行传代时，该方法可进一步扩大规模，如从第2周期到第3周期的过渡所示。在第3周期中，始终使用两个孔板来维持细胞系并接种24个新孔板。每次传代周期后，剩余的22个孔板即可用于后续实验。在维持培养的任何阶段，用户均可接种更多孔板以提高产量。例如，可在两个生长周期中对每一列均进行传代。第一次传代将一个孔板扩增至12个孔板，而每个这12个孔板又可用于接种144个孔板。在此情况下，用户从一个孔板开始，经过两次传代（约1.5至2周的培养），最终获得144个孔板。例如，成纤维细胞和脂肪来源的iPSC系在准备传代时，每个96孔板可产出约2500万至7500万个细胞。因此，144个孔板可代表约4-7 × 109 个细胞。
使用机器人操作搬运144块96孔板的劳动负担是多少？本研究的目标之一是实现可扩展的干细胞生产，相较于传统的（即，6孔板）干细胞培养方式，降低人力投入。机器人通过消除在换液和传代过程中对每块板的手动操作需求，实现了这一目标。虽然96孔板的生产规模与传统6孔板一样呈线性增长，但技术人员在机器人培养中处理这些板所需的时间显著减少。机器人培养的生产效率正是源于这一差异（图9）。研究发现，技术人员取出一块6孔板、在显微镜下检查、吸除旧培养基并添加新培养基，大约需要3.5分钟。相比之下，技术人员仅需约30秒&#160;即可从培养箱中取出一块96孔板，在显微镜下检查细胞密度和污染情况，然后将其放置到机器人系统上。通过采用类似上述的扩展化换液程序，可同时加载并处理六块96孔板，整个过程耗时约21分钟，即每块板3.5分钟&#160;。单块板的换液总耗时在机器人操作与手动操作之间相近，但若手动为6块板换液，技术人员需全程参与21分钟&#160;，而使用机器人时，技术人员仅需花费3分钟&#160;来处理这六块板（每块板约30秒&#160;的检查时间）。如图9所示，使用机器人处理144块板时，技术人员的总操作时间约为1.2小时，而手动操作则需要8小时，且机器人在处理板和液体转移过程中不会出现操作失误。
本文所述的96孔板iPSC培养方法为复杂的筛选任务提供了一个可操作的平台。由于每个孔中的细胞均来自相同的初始细胞池，具有相同的遗传背景并以相同的密度接种，因此可以将不同的实验变量分布在培养板上，并通过机器人系统结合 commercially available reservoirs（商用储液槽）对不同条件进行分隔和维持。该方法适用于干细胞生长培养基开发34,35,47、基质或培养条件测试以及利用干细胞开展的毒性研究51等实验。由于每种干细胞系在最佳克隆大小和传代需求方面均具有独特性，研究者可通过调整收获的列数、传代过程中的机械振荡强度以及换液频率，利用该系统调控接种密度、换液频率和传代操作。通过迭代优化这些变量，使用者可快速确定适合新细胞系培养的一组条件，或开发新的培养技术。该机器人系统还能够同时维持96个平行且独立的干细胞克隆。在由体细胞诱导生成iPSC或在基因操作后进行克隆筛选时，通常需要对大量平行克隆进行筛选以获得潜在的iPSC细胞系。一旦单细胞被接种至96孔板中，该系统即可对96孔板进行换液和传代操作，同时保持各个克隆彼此分离。这在筛选潜在克隆时实现了极高的通量，并消除了人工操作中同时培养96个平行细胞系的困难。此外，该方法还支持对每个克隆进行扩量培养，使材料可充分用于平行分析。最后，我们设想将这些培养技术与机器人化培养板转运系统整合，实现培养板在培养箱之间的自动运送，从而完成完全自动化的细胞培养。通过更复杂的机器人系统，可在保持本文所述基础操作流程可转移至其他基于培养板系统的同时，实现更大规模的扩展。
在本实验方案中，首先需要重点关注的步骤是防止和检测污染的步骤，例如步骤 1.5 和 4.2。如上所述，只要采用良好的无菌操作技术和基本常识，污染通常可以成功避免。无论干细胞培养采用何种形式，操作人员都必须在规定步骤中检查是否存在污染，这将显著降低污染风险。正确应用细胞外基质凝胶是本方案成功实施的第二个关键步骤。若未对 96 孔板进行适当包被，干细胞将无法生长。一个常见问题是孔内包被不完全。经验表明，气泡、静电吸附以及毛细作用会阻碍孔底的完全包被。预润湿步骤（1.6）的设立正是为了显著改善孔底的包被效果，因此不得省略。该预润湿步骤似乎能够降低塑料 96 孔板表面的疏水性，从而使后续加入的细胞外基质凝胶在孔底及孔壁均匀分布。此外，建议在完成包被后，轻轻将 96 孔板轻敲于洁净的手掌一次，以确保细胞外基质凝胶溶液均匀铺展。细胞解离参数的优化同样至关重要。长时间使用酶或 EDTA 类解离试剂会导致细胞完全解离为单细胞，而这在传代过程中可能并非预期目标。因此，操作人员应特别关注解离时间、吹打力度以及洗涤次数对细胞集落形态和细胞健康状态的影响，并据此进行相应调整。
理解本文所述技术的局限性对于成功操作至关重要。与任何其他细胞培养环境一样，使用96孔板具有相对较高的污染风险。如上所述，技术人员在换液和传代过程中需手动操作每块培养板，例如打开盖子、将板放置于机器人工作台以及在显微镜下检查培养板。因此，如步骤1.5后所述，必须避免触碰任何培养板盖的内侧，或使其暴露于可能被污染的表面，例如工作台上的斜面加热模块或垂直定位针。在方案开发过程中，发现了这一局限性，从而促使设计出一种用于存放培养板盖的支架，以维持无菌状态。同样，液体处理机器人工作台上的槽式储液槽、移液吸头及其他耗材也可能成为污染源，因为它们暴露于环境中并由技术人员操作。因此，应遵循良好的无菌操作规范，例如减少在暴露的培养材料或开放液体上方的移动。另一个局限性在于，当方案扩大规模时，难以对每个孔进行目视检查。 &#62;100个96孔板的处理较为繁琐。可通过肉眼观察整个培养板是否存在污染迹象（如培养基浑浊）来识别可疑孔。对于未来的规模扩大，将引入自动显微镜以及细胞生长和潜在污染的指示系统。
综上所述，本文所述的基于96孔板的高通量平台为干细胞培养与生产提供了一种可重复且高保真的板式培养方法。该方法在保留传统贴壁培养优势的同时，降低了干细胞培养所需的经验水平、设备要求及投入的 labor 时间。

自2007年首次成功获得人类诱导性多能干细胞（iPSCs）以来，其在化合物测试、再生医学和疾病建模中的应用已显著增加12–6。这一需求源于iPSC能够大量产生具有多能性的细胞，并可前所未有地分化为体细胞。随着定向分化技术的不断改进7–10，以及人类细胞或组织建模和细胞治疗的发展日益推进11–14，对高质量iPSC的大规模生产需求也随之增长。普遍认为，在包括心肌梗死治疗或β细胞功能替代等在内的多种疾病治疗中，将需要数亿至数十亿个由iPSC分化而来的体细胞15–18。此外，日益复杂的三维组织模型在药物发现与治疗中的应用也将需要大量细胞9,13,19。在所有这些应用中，必须能够稳定获得定义明确、均一且可重复的iPSC，并且其制备过程应简便可行。
为了生产用于组织工程和移植的干细胞来源生物制药产品和细胞，必须具备一种具有成本效益的细胞制造技术。目前，诱导多能干细胞（iPSC）的规模化生产主要集中在悬浮培养20–25或结合微载体基质的悬浮培养26–28，部分原因是这些技术已成功应用于大规模、非iPSC的真核细胞生产体系。多个研究团队已证明可利用悬浮培养系统获得多能干细胞20,21,23,24,29。然而，这些方法依赖昂贵且复杂的系统，而这些系统对于正在开发新型分化方案、推动组织工程研究或进行实验室规模研究的研究人员而言往往难以获得。此外，悬浮培养和微载体iPSC培养需要特定的适应过程、技术或化学试剂，而这些在传统的贴壁iPSC培养中并不存在，例如需持续使用Rho激酶抑制剂、消泡剂以及过滤手段来调控细胞聚集体的形成。在悬浮培养中，细胞所受的物理应力更为显著，主要来源于机械搅拌以及微载体之间的碰撞。这些问题限制了新建立的干细胞系在悬浮培养中扩增的可预测性和速度。另有研究者开发了模仿培养板操作技术的机器人化微孔板处理系统30,31，但这些平台不仅需要在设备和操作技术方面进行大量投入，还面临干细胞培养本身固有的诸多挑战。
以下工作描述了一种可扩展的iPSC培养系统的开发与实践，该系统利用一套自成一体的标准8通道机器人液体处理系统和96孔板。该方法旨在衔接实验室规模的iPSC培养与高通量iPSC生产例如, 107 – 1.5 × 109 每周每位技术人员可处理的细胞数量）使开发新型iPSC技术的研究人员能够轻松扩大生产规模，而无需大量硬件或人力投入。该方法建立成本相对较低，几乎不需要干细胞培养、编程或工程经验，所需设备占地空间小，无需专用的细胞培养操作台，并利用标准的细胞培养设备实现中高通量的自动化细胞生产。本研究旨在开发一种可扩展的干细胞培养系统，适用于初次开展干细胞培养的实验室、认为手动培养阻碍其研究思路发展的科研人员，或希望以经济方式大量生产干细胞的研究者。本文所展示的平台消除了技术人员对干细胞培养过程的主观影响，标准化了换液和传代操作，从而实现稳定一致的干细胞生产。

<table><tbody><tr><td>96孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96孔；每孔体积：360&amp;nbsp;&amp;#956;l；细胞生长面积：0.32&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;；单独包装</td></tr><tr><td>Seahorse储液槽</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>4孔透明聚丙烯储液槽，容量73 ml，每箱25个</td></tr><tr><td>Gilson吸头</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10个架子，Gilson 96孔吸头，D200吸头</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12粉末。&amp;nbsp;用1 L纯化、细胞培养级水重悬，并经无菌过滤。</td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>文中称为“&quot;细胞外基质凝胶&quot;”。Matrigel GFR，10&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1人胚胎干细胞维持完全试剂盒</td></tr><tr><td>E8培养基</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8人胚胎干细胞/诱导多能干细胞维持试剂盒</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>ROCK抑制剂Y-27632 2HCl</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>文中称为“&quot;蛋白水解和胶原蛋白水解解离试剂&quot;”。Accutase 500&amp;nbsp;ml无菌细胞溶液</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>不含Ca、Mg的PBS，500&amp;nbsp;ml，每包6瓶</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

基于96孔板的可扩展ipsc培养与生产及机器人液体处理系统应用

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

多能干细胞培养技术的持续进步正在缩小这些细胞在再生医学、药物发现和安全性测试中从实验室到临床应用之间的差距。为了生产用于组织工程和移植的干细胞衍生生物制药产品和细胞，一种低成本的细胞制造技术至关重要。在下游应用中维持细胞的多能性及其稳定性能例如细胞分化）随时间的变化对于大规模细胞生产至关重要。然而，这一目标往往难以实现，尤其是在手动培养细胞时，操作者可能引入显著的实验变异，且扩大培养规模的成本可能极为高昂。为实现高通量、大规模的干细胞生产并消除操作者带来的影响，研究人员开发了基于台式多通道液体处理机器人的新型干细胞培养方案，该方案仅需极少的技术人员参与或经验。利用该方案，可在无饲养层条件下直接从冻存细胞开始培养人诱导多能干细胞（iPSCs），并在96孔板中进行维持培养。根据细胞系种类及期望的扩增速率，操作者可依据一系列展示最佳克隆密度的图像，轻松判断传代时机。随后可准备相应试剂，直接将克隆分割转移至新培养板，无需离心步骤。经过20次传代（约3个月）后，两个iPSC系仍保持稳定的核型，表达干细胞标志物，并能高效分化为心肌细胞。该系统还可进一步用于针对96孔板设计的新分化方案或基因操作的高通量筛选。该技术将显著降低生产大量一致性干细胞所需的人力与技术负担，适用于多种应用场景。

所述方案可使实验室利用可编程液体处理机器人和96孔板，以较低的劳动力、经验及设备投入成本，实现可扩展的、贴壁培养的干细胞高通量培养。在此系统中传代超过20次的诱导多能干细胞（iPSCs）仍维持了多能性、正常的核型，并可分化为心肌细胞。

基于96孔板的可扩展iPSC培养与生产及机器人液体处理系统应用

多能干细胞培养技术的持续进步正在缩小这些细胞在再生医学、药物研发等领域从实验室到临床应用之间的差距。

以下实验的总体目标是可重复地建立一种可放大的多能干细胞培养体系。首先，通过使用预编程的液体处理机器人，以不同的密度接种人多能干细胞；第二步，在96孔板中通过肉眼观察识别出克隆密度最佳的孔，用于后续处理。随后将诱导的人多能干细胞接种到新培养板中，进行自动换液和进一步传代。最终，该方法可筛选出最适合人诱导多能干细胞扩增的接种密度，以实现其向心肌细胞的分化。该技术的应用前景包括个性化治疗和再生医学的中等规模发展。URI高效培养机器人适用于在数天内生产数亿个URI高效的干细胞，这些干细胞随后可分化为多种细胞，用于个性化药物测试或细胞与组织植入治疗。尽管该方法已应用于筛选多能干细胞培养扩增的最佳接种密度，但也可用于优化和鉴定多种其他细胞类型的新型分化方案。演示该实验步骤的是来自我实验室的药物科学家Neil Daily。在开始换液操作前，需检查96孔干细胞集落培养板是否存在污染，并确认细胞集落密度尚未达到理想的传代密度。如果细胞状态良好，将培养板放入床中。将其置于液体处理机器人倾斜的37摄氏度斜坡上，并在床中的一号位放置装有室温200微升移液枪头的枪头架。将一个四孔槽置于床位置二，并向槽的第三孔中加入八毫升新鲜的室温干细胞生长培养基（不含RO激酶抑制剂）。然后将培养板转移至培养板支架上，使用机器人控制触摸屏依次选择运行程序“集落换液一板”，然后选择“下一步”，再按“试运行”以使用分步向导预测试所选程序。程序确认无误后，选择“运行程序”。换液完成后，回收96孔干细胞集落培养板。然后在培养皿盖上记录换液事件的详细信息，并将其放回细胞培养箱中培养24小时，直至下一次换液或传代。选择哪个孔进行传代取决于克隆的密度。在此培养皿上设置接种密度梯度数天后，经过数次换液周期，我们观察到一个孔密度过高，不适合传代；另一个孔密度过低，也不适合传代。确认96孔板中大部分菌落之间的间距为相邻菌落直径的25%，否则后续喂养会导致菌落相互融合。若菌落未受污染，将培养板放入孵育床中，置于37度斜坡的第三位置，并将吸头架装入孵育床。将一支室温的200微升移液器吸头置于位置一。将一个四孔槽放置在位置二，将8.5毫升添加了ROCK激酶抑制剂Y 27632的干细胞生长培养基加入第三孔，将3.5毫升30%的蛋白酶和胶原酶解离试剂加入第二孔，将4.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）加入第四孔，第一孔保持空置。下一步，将一块预先加热至37摄氏度、包被有细胞外基质凝胶的96孔板放入孵育器中，置于位置五，并将旧板和新板的盖子转移至板盖支架架中。现在使用机器人控制触摸屏，依次选择运行程序“菌落分割1至12列1”，然后选择“下一步”。接着选择“测试运行”，使用分步向导对所选程序进行预测试，随后运行该程序。当传代操作流程结束后，回收两块培养板。用相关信息标记新培养板，并将培养板放回培养箱。在24小时内，细胞和克隆应在传代后2至3小时内贴附于培养板上，由于RO激酶抑制剂的存在，细胞会呈现明显的铺展状态。在首次无RO激酶抑制剂培养后，细胞会收缩并呈现出典型的鹅卵石状干细胞形态。染色体异常在干细胞培养过程中较为常见，但可能不影响多能性标志物的分布；正如本实验中所示，对采用上述方法培养的细胞进行核型分析发现，经机器人传代的诱导性多能干细胞系均具有46条正常染色体，表明该机器人培养方法并未引入超出正常范围的染色体不稳定性。为了检测经机器人培养的诱导性多能干细胞系中已确立的干细胞基因表达标志物，还收集了总RNA。本实验中的两株诱导性多能干细胞系均表现出相似的多能性标志物表达水平，而由这两株细胞系分化而来的 cardiomyocytes 则未表现出相似性，另一株人皮肤成纤维细胞系亦如此。此外，当这两株诱导性多能干细胞系分化为心肌细胞时，均表现出明显的肌节结构形成。综上，这些数据表明，经过三个月以上、超过20次传代的机器人培养后，细胞染色体保持正常，且具有与多能性一致的转录程序，并仍具备向心肌细胞分化的潜能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用此类液体处理机器人或类似设备，以可扩展的方式培养多能细胞。

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

可扩展的96孔板基于IPSC的文化和生产用机器人液体处理系统

本文描述了利用从季节性缺氧峡湾垂直深度连续样品中分离的环境基因组DNA构建fosmid文库的方法。通过自动化菌落挑取系统，将构建的克隆文库挑取至384孔板中，以便后续测序和功能筛选，并进行存档保存。...

大型插入片段环境基因组文库构建

定量适合度分析（QFA）是一系列互补的实验与计算方法，用于估计微生物培养物的适合度。QFA...

一种定量适合度分析工作流程

本文介绍了一种利用水相两相系统在96孔板高通量格式中进行癌细胞球体机器人打印的实验方案。...

利用水相两相系统进行癌症细胞球体的机器人化生产以用于药物测试

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。...

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。...

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

本文介绍了一种在微型生物反应器系统中同时进行48个平行细胞培养并在不同条件下操作的详细方案。描述了细胞培养过程、收获以及后续的抗体滴度分析。...

使用高通量自动化微型生物反应器系统在CHO细胞中生产模型IgG1

本方案为使用一种新型开源自动化技术进行黏性材料标准化且可重复混合的全面教程。文中详细介绍了新开发的开源工作站的操作方法、开源方案设计软件的使用，以及验证和确认可重复混合物的方法。...

一种用于自动化和标准化制造基于水凝胶的三维培养模型的开源技术平台

我们展示了与自动化成像和分析兼容的人诱导多能干细胞（hiPSC）培养及神经元分化的自动化流程。...

人诱导多能干细胞来源的皮层神经元和多巴胺能神经元的自动化生产及整合活细胞监测

本文介绍了一种自动化细胞培养系统的操作方案。该自动化培养系统可减少人工操作，便于用户使用，尤其有助于不熟悉诱导性多能干细胞（iPS细胞）操作的研究人员，实现从iPS细胞的维持培养到向多种细胞类型分化的全过程。...

一种用于维持和分化人诱导性多能干细胞的自动化培养系统

本方案详细记录了SPOT（一种基于支架的高通量培养平台）在96孔和384孔板格式中的制备与组装过程。同时，还介绍了SPOT的接种流程，包括手动操作以及使用 commercially available liquid...

可重复制造SPOT作为高通量基于支架的培养平台

了解如何使用可编程液体处理机器人在96孔板中进行可扩展的人诱导多能干细胞培养。该方法可在20代传代后维持正常核型和多能性，并支持分化为心肌细胞，适用于再生医学和个性化治疗研究。

基于96孔板的可扩展iPSC培养与生产及机器人液体处理系统应用

探索更多视频