Name: 使用提顿体系的研究斑马鱼再生的分子机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学习使用TetON系统在斑马鱼再生尾鳍中实现组织特异性基因表达的方法。通过多西环素诱导和免疫荧光验证，该技术可精确调控基因功能，为再生生物学研究提供有力工具。

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作者感谢Christa Haase、Doris Weber和Brigitte Korte提供的技术协助。Weidinger实验室的工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）基金项目WE 4223/3-1、WE 4223/4-1，以及德国心脏病学会通过Oskar-Lapp奖学金和Klaus-Georg-und-Sigrid-Hengstberger研究奖学金的资助。

1. 转基因 Tet 激活因子鱼系的建立
<ol>
	<li>构建 TetActivator 载体
	<ol>
		<li>使用标准技术将感兴趣的调控序列克隆至载体 #1247 中 TetActivator 盒的上游。或者，使用重组技术构建 BAC，将 TetActivator 盒（载体 #1180）插入目标基因的第一个外显子中，并将 Tol2 反向重复序列引入 BAC 骨架中（详细的重组工程方案见7,8）。</li>
		<li>使用市售试剂盒制备无毒素的质粒 DNA 或 BAC DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建转基因 TetActivator 鱼系
	<ol>
		<li>按照标准操作进行 TetActivator 载体的显微注射9。
		<ol>
			<li>将 25–50 pg 质粒 DNA 或最多 250 pg BAC DNA 与编码 tol2 转座酶的加帽正义 RNA 一同注射至单细胞期胚胎中，以实现转座子介导的转基因；或与 I-SceI 蛋白共注射以实现 I-SceI 介导的转基因。 
			注：有关转基因方法选择的考虑见讨论部分。 
			注：建议优先注射至细胞质而非卵黄中，因为当 DNA 未被递送至细胞质时，转基因效率可能会降低。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将注射后的 G0 代胚胎培育至成年。可选地，通过 AmCyan 荧光筛选 G0 代胚胎，并优先培养显示预期表达模式的胚胎。这可能提高生殖系传递率，特别是对于 Tol2 介导的转基因。</li>
		<li>通过将单个 G0 代鱼与野生型鱼杂交，并在 F1 代胚胎或幼鱼中使用荧光体视显微镜观察预期表达模式下的 AmCyan 荧光出现情况，评估生殖系整合是否成功（示例见图 1D）。</li>
		<li>将荧光阳性 F1 代胚胎培育至成年，并与野生型鱼交配以获得稳定的 F2 代转基因鱼。</li>
		<li>培育并鉴定至少 3 个来源于不同 G0 代创始鱼的独立亚系，因为不同品系在表达水平、表达模式、诱导 TetResponder 品系的能力、渗漏性以及对沉默的敏感性方面可能存在差异。 
		注：许多在胚胎中稳定表达的转基因在晚期幼鱼或成鱼中会部分或完全沉默。因此，若计划在成鱼中使用这些品系，应表征多个独立品系在成年期间 TetActivator 的表达与功能。 
		注：我们已构建了一系列 TetActivator 品系，可在胚胎和成鱼中实现组织特异性表达 TetActivator，详见表 1。这些品系可根据请求从 Weidinger 实验室获取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 转基因 TetResponder 鱼系的建立
注意：我们已构建了一种TetResponder载体，可用于通过I-SceI或Tol2介导生成稳定的TetResponder细胞系，该载体可应要求从Weidinger实验室获取（Weidinger实验室质粒数据库编号1444；图1E）。该载体包含一个四环素操纵子序列，其后为一段多克隆位点区域，便于插入目的基因的编码序列（CDS）以及YPet荧光蛋白的编码序列。因此，该载体设计用于在TetA系统调控下表达目的蛋白与YPet的C端融合蛋白。若需避免表达带标签的融合蛋白，可在插入目的基因CDS时引入p2a或t2a肽序列，从而实现目的蛋白与YPet作为独立多肽链的共表达6,10。
<ol>
	<li>构建 TetResponder 载体
	<ol>
		<li>根据标准操作流程，将目的基因的编码序列（CDS）克隆至四环素操纵子的 3’ 端，并位于 YPet CDS 的 5’ 端。确保已从目的基因的 CDS 中移除终止密码子。</li>
		<li>使用市售试剂盒制备无毒素的质粒 DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建转基因 TetResponder 鱼系
	<ol>
		<li>根据标准操作流程进行 TetResponder 载体的显微注射9。
		<ol>
			<li>将 25–50 pg 质粒 DNA 与编码 tol2 转座酶的加帽正义 RNA（用于转座子介导的转基因）或与 I-SceI 酶（用于大范围核酸酶辅助的转基因）一同注射到单细胞期胚胎的细胞质中。 
			注：关于转基因方法选择的考虑详见讨论部分。 
			注：建议优先注射至细胞质而非卵黄，因为若 DNA 未进入细胞质，转基因效率可能会降低。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将注射后的 G0 代胚胎培育至成年。</li>
		<li>通过将单条 G0 鱼与已建立的 TetActivator 鱼系杂交，并对 F1 代胚胎或幼鱼进行多西环素处理，评估转基因在生殖系中的成功整合及其可诱导性。 
		注：通常我们使用由 ubiquitin 启动子驱动的 TetActivator 鱼系（ubiquitin:irtTAM2(3F)-p2a-AmCyanulm2，简称 ubiquitin:TetA AmCyan3）来筛选功能性 TetResponder 携带者，因为该鱼系在胚胎和成鱼中均表现出较广泛的表达，因此非常适合评估目的组织中 TetResponder 的可诱导性。该鱼系可应要求从 Weidinger 实验室获取。</li>
		<li>将每窝的胚胎分别收集于含 E3 胚胎培养基（见材料表）的 10 cm 培养皿中，并在 28.5 °C 下孵育。</li>
		<li>将产卵的 G0 鱼放入单独编号的水箱（繁殖盒；见材料表）中，直至完成胚胎筛选。此操作可确保回收具有生殖系转基因传递能力的 G0 鱼。</li>
		<li>若预期仅有一半胚胎携带 TetActivator 转基因（即杂合 TetActivator 携带者与 TetResponder 创始鱼杂交的情况），则根据适当发育阶段 AmCyan 荧光的出现情况筛选携带 TetActivator 转基因的胚胎。</li>
		<li>通过多西环素（DOX）处理胚胎以诱导 TetActivator 的转录活性，具体操作见第 2.3 节。</li>
		<li>筛选 F1 代胚胎中 YPet 荧光的出现。优先选择能产生均一 YPet 表达的鱼系（G0 鱼），即同窝胚胎在预期表达区域内嵌合现象较少，且个体间差异较小。代表性示例见图 1F 和图 1G 中的箭头所示。</li>
		<li>将第 2.2.8 步&#160;中鉴定出的可诱导 TetResponder 转基因 G0 鱼与野生型鱼杂交，并将所有 F1 代胚胎培育至成年。</li>
		<li>通过基于 PCR 的基因分型（见第&#160;节）或通过将单条 F1 鱼与 TetActivator 鱼系杂交，随后对 F2 代胚胎进行 DOX 处理并观察 YPet 荧光的出现（见第 2.5 节），来鉴定成年 F1 代转基因鱼。</li>
		<li>建立并表征至少 3 个来源于不同 G0 创始鱼的 TetResponder 亚系，因为不同鱼系间的可诱导性可能存在差异。特别是可达到的表达水平以及响应元件是否能在所有细胞类型中被激活均可能有所不同。此外，各鱼系对沉默作用的敏感性也会存在差异。最后，在某些情况下，可能更宜选择仅介导目的蛋白中等表达水平的鱼系，尤其是当预期在无多西环素存在时，TetActivator 鱼系联合表达产生的渗漏表达可能导致发育缺陷或毒性。 
		注：在胚胎中可被强烈诱导的 TetResponder 鱼系可能在晚期幼鱼或成鱼中部分或完全沉默。因此，若计划在成鱼中使用这些鱼系，应表征多个独立鱼系在成鱼中的可诱导性。如果目的基因的诱导表达不影响后续发育，建议构建双转基因胚胎（TetActivator × TetResponder），在胚胎期诱导目的基因表达，并仅选择诱导最强且嵌合程度最低的个体进行培育。</li>
		<li>为维持和扩繁已建立的 TetResponder 鱼系，按第 2.5 节所述对成年鱼进行基因分型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎的多西环素处理
	<ol>
		<li>配制 2,000 倍浓度的多西环素（DOX）储备液。将 DOX 溶于 50% 乙醇（EtOH）中，配制成 50 mg/ml（97 mM）的溶液。将 DOX 储备液避光保存于 -20 °C。</li>
		<li>倒出胚胎中的大部分 E3 培养基，替换为含有 DOX 的 E3 胚胎培养基，使 DOX 的终浓度为 25 µg/ml（每 50 ml E3 培养基中加入 2.5 µl 2,000 倍 DOX 储备液）。无需去膜。</li>
		<li>将胚胎放回 28.5 °C 环境中孵育至少 6 小时&#160;，然后通过观察 YPet 荧光的出现来评估标记目的基因的表达情况。</li>
		<li>通过仅用乙醇溶剂处理胚胎来评估 TetActivator/TetResponder 组合的渗漏表达情况。 
		注：原位杂交（ISH）或 RT-PCR 检测 TetResponder mRNA 可作为比标记目的基因荧光更敏感的渗漏表达检测手段。渗漏程度取决于特定的 TetActivator/TetResponder 鱼系组合，且可能在不同组织和发育阶段间存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年斑马鱼的麻醉
	<ol>
		<li>准备一个直径为 10 cm 的培养皿或小烧杯，加入含有 1 mg/ml 三卡因（Tricaine，即氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，MS-222）的鱼用系统水。</li>
		<li>将鱼转移至含有麻醉剂的容器中，等待其达到麻醉第 4 级状态，表现为完全失去平衡（鱼体侧卧）、无任何运动且对触碰无反应11。</li>
		<li>使用镊子或勺子小心地将鱼转移至载玻片、塑料培养皿盖或涂有琼脂糖的培养皿上，进行鳍切除或成像操作（见第 3.2 节）。</li>
		<li>将鱼放回盛有大量新鲜鱼用系统水的容器中并进行监测。若 3 分钟内鳃部运动未恢复，可用塑料移液管向鳃部吹水以辅助恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于 PCR 的 TetResponder 鱼基因分型
	<ol>
		<li>进行尾鳍部分切除12。将鱼放入单独编号的水箱（繁殖盒；见材料表）中。此操作可在成功完成基因分型后回收转基因鱼。</li>
		<li>将鳍组织转移至预装有 20 µl 无 DNase 水的 96 孔 PCR 板的各个孔中，用于基因组 DNA 提取13。
		<ol>
			<li>向每孔加入 120 µl&#160;1 M NaOH，在热循环仪中 95°C 孵育 20 分钟。</li>
			<li>将样品冷却至 4°C，向每孔加入 14 µl 1 M Tris-HCl（pH 8.0），短暂涡旋混匀。以 16,000 × g 离心 5 分钟以沉淀细胞碎片。提取的基因组 DNA 可暂存于 4 °C 待用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设计特异性引物以扩增 TetResponder 转基因的一段片段。在标准 PCR 反应中使用 2 µl 提取的 DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成年斑马鱼尾鳍再生过程中组织特异性诱导转基因表达
<ol>
	<li>建立 TetActivator; TetResponder 双转基因鱼
	<ol>
		<li>将 TetActivator 携带者与 TetResponder 携带者进行交配。</li>
		<li>在驱动 TetActivator 盒的调控元件具有活性的发育阶段，筛选携带 TetActivator 转基因的胚胎。可使用体视荧光显微镜通过观察 AmCyan 荧光的出现来轻松识别转基因胚胎。 
		注意：TetActivator 转基因阳性鱼也可在成体阶段通过麻醉后成像来鉴定，例如在尾鳍截断后，再生组织中出现 AmCyan 荧光。</li>
		<li>将筛选出的胚胎培育至成年。</li>
		<li>通过基于 PCR 的基因分型或（更优方法）通过其在目标组织中诱导 TetResponder 表达的能力，鉴定双转基因成年鱼（即同时携带 TetResponder 和 TetActivator 的鱼）。尾鳍再生过程中 TetResponder 的诱导与检测方案见第 2.3 节&#160;和第 4 节。 
		注意：如果短暂的 TetResponder 表达不影响后续胚胎或幼体发育，则可在胚胎发育期间经 DOX 处理后，鉴定携带 TetActivator 和 TetResponder 转基因的双转基因胚胎（如上所述，第 2.3 节，&#160;图 1H）。双阳性胚胎将同时显示 AmCyan 和 YPet 荧光。将阳性胚胎培育至成年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼尾鳍截断及在再生鳍中诱导转基因表达
	<ol>
		<li>对麻醉后的鱼进行尾鳍部分截断（见第 2.4 节）12。可立即用 DOX 处理鱼，或将其放回鱼饲养系统中。</li>
		<li>准备一个装有 1 L 鱼系统用水的繁殖盒（图 2A；见材料表），其中含 25 µg/ml DOX（向 1&#160;L 鱼系统用水中加入 500 µl 的 2,000 倍浓缩液（50 mg/ml 储备液））。 
		&#8203;注意：在截断后立即诱导转基因表达可用于评估再生早期事件的影响，而在截断后 3 天（3 dpa）进行诱导则适用于评估再生生长期间的转基因表达或功能。</li>
		<li>将最多 10 条先前已截断尾鳍的双转基因鱼转移至繁殖盒中，并用盖子封闭盒子，防止鱼逃逸（图 2A）。</li>
		<li>将繁殖盒置于暗处以减少应激。我们通常将盒子放入 28.5 °C 的空气培养箱中，以确保恒定的黑暗和温度。</li>
		<li>仅用 EtOH 处理阴性对照双转基因鱼（每 1 L 鱼系统用水中加入 250 µl EtOH）。 
		注意：单转基因或野生型鱼用 DOX 处理也可作为额外的阴性对照，尽管我们从未观察到本实验所用 DOX 剂量对鳍再生产生不良影响。</li>
		<li>按照第 2.4 节所述方法麻醉鱼&#160;，并使用镊子或勺子将鱼转移至湿润的琼脂糖包被培养皿上。用镊子小心展开尾鳍。</li>
		<li>使用荧光体视显微镜检测再生组织中 YPet 荧光的出现（图 2B）。 
		注意：通常在 DOX 处理 6 小时后即可稳定观察到 TetResponder 驱动的荧光。然而，我们建议针对每条建立的品系表征 TetResponder 表达的动力学。</li>
		<li>将鱼放回鱼饲养系统以终止 TetResponder 转基因的诱导，或继续处理。 
		注意：对于超过 &#62;24 小时（长期处理）的处理，必须每天更换水并彻底清洁繁殖盒。</li>
		<li>在长期处理期间，每隔 2–3 天喂食一次，喂食前将鱼转移至装有新鲜鱼系统用水的洁净容器中，喂食后再放回繁殖盒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 鱼鳍再生组织中 TetResponder 表达的表征
注意：我们通常在尾鳍再生3天后（3 dpa）通过冷冻切片的荧光成像来验证组织特异性基因表达。在此时间点，再生组织的不同组织区室已经形成，在组织切片上可被清晰识别，且此时进行冷冻切片操作比再生后期更为简便。图2C展示了再生组织中可区分的各个组织区域，并列出了一些这些区域的分子标记物。以下方案描述了用于直接成像或免疫染色的纵向或横向冷冻切片的制备步骤。
<ol>
	<li>成年斑马鱼尾鳍的冰冻切片
	<ol>
		<li>按照第3.2节所述，用DOX处理尾鳍在2 dpa至3 dpa期间被截除的斑马鱼</li>
		<li>按照第2.4节所述麻醉斑马鱼</li>
		<li>使用勺子或镊子将斑马鱼轻轻转移至塑料培养皿盖上</li>
		<li>使用解剖刀在初始截肢平面近端约4-5个骨节处重新截除再生尾鳍，并将鱼放回新鲜的养鱼系统水中</li>
		<li>使用精细镊子小心地将再生组织转移至含有4% (w/v) 多聚甲醛（PFA）的1x磷酸盐缓冲液（PBS；见材料表）的小培养皿（例如，&#160;35 mm）中。操作时仅接触组织的残端部分，避免触碰再生区域</li>
		<li>将组织平放于培养皿底部，并在4 °C下固定过夜（O/N）</li>
		<li>用含0.1% Tween的1x PBS（PBT）清洗再生组织两次，以去除PFA；随后在0.5 M EDTA-PBS（pH 7.5）中于4 °C孵育过夜，以脱钙骨基质</li>
		<li>在10%蔗糖-PBS、20%蔗糖-PBS、30%蔗糖-PBS以及30%蔗糖-PBS与组织冷冻介质按1:1比例混合液（TFM；见材料表）中依次于&#160;室温&#160;孵育，每次30分钟。随后将鳍组织在组织冷冻介质中于4 °C孵育&#62;2小时</li>
		<li>将冷冻模具置于载玻片上，并填充组织冷冻介质，避免引入气泡</li>
		<li>将再生组织转移至冷冻模具中，并适当调整方向，以便获得尾鳍再生组织的纵向或横截面切片（图2D）。确保再生组织保持笔直，以利于切片</li>
		<li>将带有冷冻模具的载玻片置于放置在干冰床上的金属架上，开始冷冻过程（图2D）</li>
		<li>待组织冷冻介质完全凝固后，将冷冻模具移至实验台，室温静置数分钟，使塑料与介质界面处的冷冻介质轻微融化</li>
		<li>使用笔或其他工具将冻结的组织块从冷冻模具中推出。将冷冻组织块存放在-80 °C冰箱中，直至进行切片</li>
		<li>使用冰冻切片机（Cryo-microtome）制备厚度为10-14 µm的冰冻切片，并将切片收集到粘附性载玻片上（见材料表）。切片载玻片保存于-20 °C，待后续使用</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于YPet荧光对尾鳍切片上TetResponder表达的表征
	<ol>
		<li>用预冷至-20 °C的100%甲醇（MeOH）处理切片30分钟，以增强其在载玻片上的附着性，随后在室温下用PBT清洗两次，每次5分钟，再用PBS清洗一次，每次5分钟</li>
		<li>将切片在含Dapi（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）的PBS溶液（1:5,000）中孵育10分钟以染色细胞核，随后用PBS清洗两次，每次10分钟</li>
		<li>使用75%甘油-PBS或市售抗荧光淬灭封片剂封片，并加盖盖玻片</li>
		<li>在共聚焦或宽场荧光显微镜下观察YPet和AmCyan的荧光信号（图1E）。 
		注意：为明确识别表达YPet的细胞类型，可进行免疫荧光或免疫组织化学染色，联合使用针对特定细胞类型抗原的抗体以及抗GFP抗体（该抗体可识别YPet但不识别AmCyan）。或者，为增强对微弱YPet表达的检测，可在整体尾鳍或尾鳍石蜡切片上进行针对YPet RNA的原位杂交（RNA in situ hybridization）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成年斑马鱼具有惊人的能力，能够成功再生多种内部器官和附属结构。要深入理解其中涉及的分子与细胞机制，需要对基因功能和信号通路进行组织特异性分析。为此，TetON系统为在斑马鱼胚胎及成体中实现时空可控的基因表达提供了高效工具。本文所描述的TetON系统构建方法及实验技术已在本实验室最近的一项研究中成功应用3。在建立TetON系统时，还应考虑以下附加问题：
TetActivator 转基因设计的考虑因素
我们先前已证明，由反向四环素阻遏蛋白M2突变体与单纯疱疹病毒VP16转录激活结构域衍生物3F融合而成的单诱导型Tet激活因子[简称为irtTAM2(3F)或TetA-M2]能够实现高效诱导，但在无多西环素（DOX）存在时可能表现出虽低但可测量的渗漏表达，即背景性诱导活性5。因此，我们描述了采用糖皮质激素受体（TetA-GBD）或蜕皮激素受体结构域（TetA-EcR）融合构建的双诱导系统，可消除渗漏表达5。因此，若该系统用于表达毒性蛋白或活性极强的蛋白...

斑马鱼是一种广泛使用的脊椎动物模式生物，用于研究发育、生理、疾病和再生等多个方面的生物学问题。随着斑马鱼在胚胎后生物学过程研究中的应用日益广泛，可诱导的、组织特异性的基因表达或信号通路操控实验工具变得愈发重要。特别是成年斑马鱼器官和附属肢体再生的研究，长期受限于缺乏能够在再生过程中解析信号通路时空需求的有效工具。
目前，已有三种不同的系统被用于在成年斑马鱼再生器官中实现条件性、组织特异性的基因表达：Cre-lox 系统、通过转座子介导的体细胞转基因实现热休克诱导型转基因的嵌合表达，以及 TetON 系统1-3。TetON 是指四环素控制的转录激活系统的一种变体，其表达在抗生素四环素或其衍生物（例如多西环素）存在时被激活。e.g. 多西环素）。迄今为止在成年鱼类中使用的 Cre-lox 系统依赖于他莫昔芬控制的 Cre 重组酶（CreERT2），其表达通过组织特异性调控元件在空间上受到限制。由 Cre 驱动的 STOP 突变盒的移除，可促进由在所有细胞类型中均应具有活性的启动子驱动的目的基因表达1。通过转座子介导生成嵌合表达的体细胞转基因，提供了一种在单个细胞谱系中实现可诱导转基因表达的系统。将携带受热休克启动子转录调控的目的基因的 Tol2 转座子注射到斑马鱼胚胎中，通常会导致嵌合个体仅在再生器官的特定细胞谱系中携带该转基因2。尽管这两种系统均可实现条件性组织特异性基因表达，但 Cre-lox 系统不可逆，而基于转座子的克隆标记策略则受限于其随机性。因此，我们及其他研究者近期已将转基因 TetON 系统应用于斑马鱼，该系统可实现时间与空间上可控、且具有可调节性和可逆性的基因表达3-5。
此处使用的TetON系统包含一个转基因驱动品系（TetActivator），其中多西环素（DOX）诱导型转录激活因子（改进的反向四环素转录激活因子，irtTA，简称TetA）受组织特异性基因组调控序列的控制。其次，该系统需要一个转基因响应品系（TetResponder），其携带的目的基因受四环素操纵子（四环素反应元件，TetRE）的转录调控（图1A）。因此，通过特定组合的TetActivator与TetResponder品系，可实现对基因表达的条件性、组织特异性调控。
我们近期利用TetON系统探究了Wnt/β-catenin信号通路在成年斑马鱼尾鳍再生过程中组织特异性功能3。本文所述方案概述了在斑马鱼中建立和使用TetON系统的操作流程，尤其适用于鳍再生相关研究。内容包括构建稳定的转基因TetActivator和TetResponder品系的详细步骤，以及在斑马鱼胚胎和成体中诱导转基因表达的实验方案。此外，我们还介绍了验证鳍再生组织中基因组织特异性表达的技术，包括成年斑马鱼鳍组织冷冻切片制备的实验流程。同时，本文讨论了TetActivator转基因设计、转基因方法选择以及TetResponder表达检测等方面的注意事项。因此，本方案的总体目标是为在斑马鱼中建立功能性TetON系统提供蓝图，以实现条件性组织特异性基因表达，该系统可应用于任何感兴趣的组织。
我们构建了一种TetActivator载体，可利用短基因组调控序列（增强子片段；Weidinger实验室质粒数据库编号1247；图1B），通过I-SceI或Tol2介导生成稳定的TetActivator细胞系。该载体包含一个TetActivator表达盒，其中含有反向四环素抑制因子M2突变体（irtTAM2）与单纯疱疹病毒VP16转录激活结构域衍生物3F（3F）的融合蛋白[irtTAM2(3F)]。由于TetActivator（TetA）与荧光蛋白AmCyan在同一开放阅读框中共同表达，其表达情况可被方便地监测；二者之间由p2a肽连接，通过核糖体跳跃机制实现翻译，理论上可按1:1比例生成独立的TetA和AmCyan蛋白5,6。该载体还在TetActivator表达盒的5'端设有多克隆位点，便于通过常规克隆方法插入感兴趣的基因组调控序列。
此外，我们还构建了一个包含上述 TetActivator 插入片段和卡那霉素抗性筛选插入片段的载体（Weidinger 实验室质粒数据库编号 1180；图 1C），该载体可重组至细菌人工染色体（BAC）中，后者包含一个较大的基因组区域（通常插入至某个基因的起始密码子处，以使转基因能够模拟该基因的表达模式）。上述两种载体均可根据请求从 Weidinger 实验室获取。

<table><tbody><tr><td>繁殖盒</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>复合荧光显微镜</td><td>例如，Leica、Zeiss</td><td>因制造商而异</td><td>用于成像荧光组织切片</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>例如，Leica、Zeiss</td><td>因制造商而异</td><td>用于成像荧光组织切片</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>例如，Leica、Thermo-Scientific</td><td>因制造商而异</td><td>用于冷冻切片</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;, 6-二脒基-2-苯基吲哚（Dapi）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>在 PBS 中按 1/5,000 稀释&lt;br/&gt;用于细胞核可视化</td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>用 50% EtOH 配制成 50 mg/ml（97 mM）的储存液&lt;br/&gt;用于 TetResponder 诱导</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>在 PBS 中配制成 4%（w/v）多聚甲醛，pH 7.5&lt;br/&gt;用于固定</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，5.2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，150 mM NaCl，pH 7.5</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液 + Tween 20（PBT）</td><td></td><td></td><td>含 0.1% Tween 20 的 1× PBS</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 黏附载玻片</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>1014356190</td><td>用于组织切片的收集</td></tr><tr><td>体视荧光显微镜</td><td>例如，Leica、Zeiss</td><td>因制造商而异</td><td>用于基于荧光的基因分型</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>例如，Biorad、Applied Biosystems</td><td>因制造商而异</td><td>用于基于 PCR 的基因分型</td></tr><tr><td>组织冷冻介质（TFM）</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>用于组织样本包埋</td></tr><tr><td>三卡因（L-乙基-m-氨基苯甲酸甲磺酸盐/MS-222）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>用于麻醉&lt;br/&gt;在 E3 胚胎培养基中使用浓度为 1 mg/ml</td></tr></tbody></table>

利用teton系统研究斑马鱼再生的分子机制

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

斑马鱼已成为研究脊椎动物发育、生理学、疾病及组织再生的重要模式生物。要深入理解其中涉及的分子与细胞机制，需要借助能够实现可诱导、组织特异性基因表达或信号通路操控的实验工具。因此，我们及其他研究者近期已将TetON系统应用于斑马鱼。TetON系统可实现时间和空间上可控的基因表达，我们最近利用该工具探究了Wnt/β-catenin信号通路在斑马鱼尾鳍再生过程中组织特异性的功能。本文描述了在成年斑马鱼再生尾鳍中使用TetON系统实现可诱导、组织特异性基因表达的工作流程，包括构建稳定的转基因TetActivator和TetResponder品系、转基因诱导，以及验证鳍再生组织中基因表达组织特异性的技术方法。因此，本实验方案为建立并应用斑马鱼中的功能性TetON系统提供了蓝图，尤其适用于鳍再生研究。

为了建立用于组织特异性诱导基因表达的功能性 TetON 系统，需要构建转基因的 TetActivator 和 TetResponder 品系（图 1A）。该过程通过将 TetActivator（图 1B–C）或 TetResponder（图 1E）载体显微注射到早期斑马鱼胚胎中，并实现其在生殖系中的整合来完成。功能性 TetActivator 载体可通过将短调控序列（增强子元件）克隆至 TetActivator 盒的上游（图 1B）实现，也可通过将 TetActivator 盒重组至含有目的基因调控元件的 BAC 中完成（图 1C）。TetActivator 载体的生殖系整合可通过将单条注射后的 G0 代鱼与野生型鱼杂交，并在 F1 代胚胎中观察到符合预期表达模式的 AmCyan 荧光来验证（图 1D）。TetResponder 转基因的生殖系整合及其功能可通过将单条 G0 代注射鱼与已建立的 TetA...

本文概述了利用TetON系统在成年斑马鱼尾鳍再生过程中实现组织特异性基因表达的工作流程。

利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

斑马鱼已成为研究脊椎动物发育、生理学、疾病及组织再生的重要模式生物。全面的……

本实验的总体目标是在斑马鱼体内建立一种功能性的 Tet 开关系统，以实现条件性、组织特异性的基因表达，如本视频中所示的尾鳍再生过程中的基因表达。该目标首先通过构建 Tet 激活子转基因品系来实现，该品系在特定目标组织中表达一种与 AmCyan 标记蛋白融合的四环素诱导型转录激活因子；同时构建 Tet 响应子品系，该品系在 Tet 响应元件的调控下表达带有 Ype 标签的目标基因。随后，建立特定组合的 Tet 激活子与 Tet 响应子双转基因鱼。随后通过给予多西环素诱导组织特异性的 Tet 应答转基因表达。最后，通过制备鳍再生组织切片来验证 Tet 应答转基因的表达。最终，采用免疫荧光法可视化检测组织特异性的 Tet 应答转基因表达。与热激诱导基因表达等其他方法相比，该技术的主要优势在于，deed on 系统能够实现组织特异性的可诱导且可逆的基因表达。该方法有助于更深入地理解调控斑马鱼鳍再生的分子信号网络，因为它允许在特定组织中分析信号通路和基因功能。尽管我们使用该技术研究斑马鱼鳍的再生，但它在许多需要组织特异性调控基因功能的其他研究场景中同样具有重要应用价值。根据文本方案建立Tet应答鱼系后，通过将每条G0代鱼与已建立的Tet激活子品系杂交，评估外源基因的生殖系整合及可诱导性。随后收集胚胎，并培育至可评估Tet应答子诱导效应的发育阶段。使用50%乙醇溶解多西环素（doxycycline），配制2000×的母液，终浓度为50毫克/毫升。将避光保护的docks分装后于负20摄氏度保存。接下来，制备含有docks的E3胚胎培养基，其终浓度为25微克/毫升。然后，倒出胚胎中的大部分E3培养基。替换为含有 E3 培养基的培养皿，并将胚胎放回 28.5°C 环境中孵育至少六小时。孵育结束后，使用荧光体视显微镜筛选胚胎中的 Ypet 荧光信号。从上述已鉴定的 founder 胚胎中建立多个稳定的转基因 Tet 响应品系。选择在预期表达区域内诱导性强、嵌合性低，且个体胚胎间变异小的品系。在建立TED激活子和Tet应答子鱼系后，将Tet激活子携带者与Tet应答子携带者杂交，以获得双转基因鱼。通过体视显微镜下筛选青色荧光蛋白（am cyan）荧光信号，鉴定携带Tet激活子转基因的胚胎，并将am cyan阳性胚胎培育至成年。通过基于PCR的基因分型，或根据其在目标组织中诱导Tet应答元件表达的能力，鉴定携带Tet应答元件以及Tet激活因子的双转基因成年鱼，以进行尾鳍截断实验。将成年斑马鱼置于含有160微克/毫升三卡因（trica）的鱼水中麻醉。当鱼停止活动后，用镊子小心将其转移至倒置的培养皿上，并使用解剖刀对尾鳍进行部分截除，随后用多西环素（docs）处理。准备含有25微克/毫升多西环素（doxycycline）的一升鱼系统用水的繁殖盒。作为阴性对照，向含有1升鱼系统水的繁殖盒中

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用提顿体系的研究斑马鱼再生的分子机制

我们介绍一种在成年斑马鱼鳍再生过程中条件性敲低目标蛋白表达的方法。该技术包括将反义寡核苷酸吗啉代通过显微注射并电穿孔导入鳍组织，从而可在鳍再生的各个阶段（包括伤口愈合、芽基形成和再生性生长）中检测该蛋白的功能作用。...

体内电穿孔法将吗啉寡核苷酸导入再生的成年斑马鱼尾鳍

脊髓横断后，成年斑马鱼在损伤后六周内可实现功能恢复。为了利用幼鱼的透明特性以及更快的恢复速度，我们介绍了一种横断斑马鱼幼体脊髓的方法。横断后，我们观察到感觉功能在损伤后2 天开始恢复，损伤后3天出现C形弯曲运动。...

幼年斑马鱼脊髓横断术

一种可适应的斑马鱼反向遗传学方法，通过心室注射基因特异性吗啉代寡核苷酸，用于评估基因在发育后期及生理性稳态（如组织再生）过程中的功能。...

利用心脏心室注射反向遗传学吗啉代寡核苷酸方法转染斑马鱼幼鱼中多个难以靶向的组织

为了阐明斑马鱼成体神经发生与再生的细胞和分子机制，我们建立了一种侵入性手术方案，可在斑马鱼成体端脑中诱导机械性损伤，并通过免疫组织化学方法对刺伤半球后续发生的变化进行监测 原位...

斑马鱼成体端脑刺伤损伤：一种研究脊椎动物脑神经发生与再生的方法

在此，我们介绍一种通过注射庆大霉素诱导急性肾损伤来研究成年肾脏再生的可靠方法。我们证明了损伤程度依赖于庆大霉素剂量和环境温度 原位 杂交标记 lhx1a+ 形成新的肾单位。...

通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

我们介绍了一种利用明场体视显微镜在全组织尺度上捕捉斑马鱼幼体尾鳍再生动态的实验方案。该技术能够以单细胞分辨率记录再生过程中的动态变化。此方法可适用于任何配备CCD相机和延时成像软件的体视显微镜。...

利用延时亮场体视显微镜捕捉斑马鱼幼虫的组织修复过程

骨骼肌再生由组织驻留的肌肉干细胞驱动，这些细胞在多种肌肉疾病（如肌营养不良症）中功能受损，导致肌肉无法再生。本文介绍了一种可在斑马鱼肌肉疾病模型中研究肌肉再生的实验方案。...

研究肌肉疾病斑马鱼模型中的肌肉再生

本文描述了一种用于研究成年斑马鱼高度再生能力所涉及的分子调控机制的机械性脑损伤模型。该方法阐述了如何在多种小型鱼类的视顶盖区域制造刺伤损伤，以通过荧光免疫染色评估其再生反应。...

利用斑马鱼和青鳉鱼视顶盖成年 stab wound 损伤模型进行再生能力比较分析

本实验方案描述了一种利用激光损伤系统结合用于幼鱼处理的自动化微流控平台，在斑马鱼幼鱼中诱导组织特异性且高度可重复损伤的方法。...

用于研究斑马鱼幼鱼脊髓再生的可控半自动激光诱导损伤

本文介绍了一种在受精后至少1至7天内的任何阶段，对斑马鱼胚胎和幼鱼进行细胞移植的实验方案，可实现高时空分辨率的移植操作。...

高分辨率细胞移植在胚胎期和幼体期斑马鱼中的应用

学习使用TetON系统在斑马鱼再生尾鳍中实现组织特异性基因表达的方法。通过多西环素诱导和免疫荧光验证，该技术可精确调控基因功能，为再生生物学研究提供有力工具。

利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

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