利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

本实验的总体目标是在斑马鱼体内建立一种功能性的 Tet 开关系统，以实现条件性、组织特异性的基因表达，如本视频中所示的尾鳍再生过程中的基因表达。该目标首先通过构建 Tet 激活子转基因品系来实现，该品系在特定目标组织中表达一种与 AmCyan 标记蛋白融合的四环素诱导型转录激活因子；同时构建 Tet 响应子品系，该品系在 Tet 响应元件的调控下表达带有 Ype 标签的目标基因。随后，建立特定组合的 Tet 激活子与 Tet 响应子双转基因鱼。

随后通过给予多西环素诱导组织特异性的 Tet 应答转基因表达。最后，通过制备鳍再生组织切片来验证 Tet 应答转基因的表达。最终，采用免疫荧光法可视化检测组织特异性的 Tet 应答转基因表达。

与热激诱导基因表达等其他方法相比，该技术的主要优势在于，deed on 系统能够实现组织特异性的可诱导且可逆的基因表达。该方法有助于更深入地理解调控斑马鱼鳍再生的分子信号网络，因为它允许在特定组织中分析信号通路和基因功能。尽管我们使用该技术研究斑马鱼鳍的再生，但它在许多需要组织特异性调控基因功能的其他研究场景中同样具有重要应用价值。

根据文本方案建立Tet应答鱼系后，通过将每条G0代鱼与已建立的Tet激活子品系杂交，评估外源基因的生殖系整合及可诱导性。随后收集胚胎，并培育至可评估Tet应答子诱导效应的发育阶段。使用50%乙醇溶解多西环素（doxycycline），配制2000×的母液，终浓度为50毫克/毫升。

将避光保护的docks分装后于负20摄氏度保存。接下来，制备含有docks的E3胚胎培养基，其终浓度为25微克/毫升。然后，倒出胚胎中的大部分E3培养基。

替换为含有 E3 培养基的培养皿，并将胚胎放回 28.5°C 环境中孵育至少六小时。孵育结束后，使用荧光体视显微镜筛选胚胎中的 Ypet 荧光信号。从上述已鉴定的 founder 胚胎中建立多个稳定的转基因 Tet 响应品系。

选择在预期表达区域内诱导性强、嵌合性低，且个体胚胎间变异小的品系。在建立TED激活子和Tet应答子鱼系后，将Tet激活子携带者与Tet应答子携带者杂交，以获得双转基因鱼。通过体视显微镜下筛选青色荧光蛋白（am cyan）荧光信号，鉴定携带Tet激活子转基因的胚胎，并将am cyan阳性胚胎培育至成年。

通过基于PCR的基因分型，或根据其在目标组织中诱导Tet应答元件表达的能力，鉴定携带Tet应答元件以及Tet激活因子的双转基因成年鱼，以进行尾鳍截断实验。将成年斑马鱼置于含有160微克/毫升三卡因（trica）的鱼水中麻醉。当鱼停止活动后，用镊子小心将其转移至倒置的培养皿上，并使用解剖刀对尾鳍进行部分截除，随后用多西环素（docs）处理。准备含有25微克/毫升多西环素（doxycycline）的一升鱼系统用水的繁殖盒。

作为阴性对照，向含有1升鱼系统水的繁殖盒中加入250微升乙醇，代替强力霉素，将最多10条双转基因鱼转移至每个繁殖盒中，并将繁殖盒置于黑暗环境中以减少应激。至少六小时后，麻醉并转移处理过的鱼至涂有湿琼脂糖的培养皿中，使用镊子展开尾鳍。接下来，在荧光显微镜下观察鱼再生组织中YFP的表达情况。

随后，可将鱼类用于进一步处理，或放回鱼饲养系统，以在部分鳍切除及药物处理后终止响应性转基因的诱导。根据本视频此前所述的实验设计，在适当时间点，使用镊子将再生鳍在距离初次截肢平面近端约四至五个骨节处再次截除，并仅操作组织的残端部分，小心地将再生组织平铺于含有4%（重量/体积）多聚甲醛（PFA）的PBS溶液的小培养皿中，于4°C固定过夜。次日，用PBS洗涤再生组织两次，随后转移至0.5摩尔的EDTA-PBS溶液中，于4°C继续脱钙骨基质过夜。接着，在室温下将再生组织依次置于蔗糖-PBS梯度溶液中孵育，每步30分钟，最后置于等体积混合的30%蔗糖-PBS溶液与组织包埋剂中，额外孵育30分钟。

将鳍转入组织冷冻介质中，在4°C下孵育至少两小时。然后将冷冻模具置于载玻片上，并用组织冷冻介质填充。将再生组织转移至冷冻模具中，并调整组织方向以获得纵向或横截面切片。

确保再生组织保持平直，以利于切片。将包埋盒与载玻片一起转移至置于干冰床上的金属架上，开始冷冻过程。当包埋介质完全凝固后，将包埋盒移回室温，使介质在塑料与介质交界处逐渐解冻。

然后使用笔等工具将冻结的组织块从冷冻模具中推出，并在负80摄氏度下保存，直至使用冷冻切片机进行切片。在黏附性载玻片上收集10至14微米的切片，并将载玻片在负20摄氏度下保存备用。为表征鳍条切片上Tet反应元件的表达，用预冷至负20摄氏度的100%甲醇处理切片30分钟。

用纸巾小心吸去液体。随后用 PBT 清洗切片两次，每次五分钟，再用 PBS 清洗一次，每次五分钟。将切片在 dappy 中孵育 10 分钟，然后用 PBS 清洗两次，每次 10 分钟。

然后使用Antifa封片剂和盖玻片对样本进行封片，再通过共聚焦显微镜或宽场荧光显微镜成像，以观察斑马鱼中已建立的功能性TETon系统的样本。该系统可用于检测单个组织中基因或信号通路的功能。如图所示，由HER 4.3启动子驱动的tet激活因子仅在部分组织中诱导TED响应元件的表达，再生区域的YFP荧光仅在增殖性近端芽基中被检测到，而远端芽基和表皮则无表达。

WINT β-连环蛋白拮抗剂在含有胚基增殖细胞的 HER 4.3 结构域中表达时，出乎意料地对再生细胞的增殖无任何影响。这表明，在增殖性近端胚基中，wind 甜菜碱及其信号通路在调控胚基 ML 细胞增殖过程中并不发挥关键作用。相比之下，使用泛素启动子驱动的 Tet 激活剂品系在鳍再生组织的所有部位诱导 axin1 表达，则会显著干扰再生细胞的增殖。

此外，在不包含成骨细胞的 HER 4.3 结构域中，轴突素 one 的表达会严重干扰再生组织中的骨形成。因此，利用 TE on 系统在组织特异性水平上干扰 Wnt 信号通路，揭示了 Wnt 信号在调控细胞增殖和骨再生过程中意想不到的间接功能。一旦掌握，该技术可用于在任何目标组织中实现可诱导的靶向基因表达。

我们已成功应用该方法探究再生斑马鱼尾鳍中风床尼古丁信号通路的组织特异性功能。采用此方法将有助于更全面地理解调控组织再生的分子决定因素。