利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

本实验的总体目标是在斑马鱼中建立一套功能性的TEDon系统，以实现条件性、组织特异性的基因表达，如本视频中再生尾鳍所展示的结果。首先构建Tet激活子转基因品系，使其在目标组织中表达一种与AmCyan标记融合的四环素诱导型转录激活因子；同时构建Tet响应子品系，其中目标基因（带YPE标签）受Tet响应元件调控。随后，建立特定组合的Tet激活子与Tet响应子双转基因鱼。

随后通过给予强力霉素诱导组织特异性的 Tet 应答转基因表达。最后，通过制备鳍再生组织切片来验证 Tet 应答转基因的表达。最终，采用免疫荧光法可视化检测组织特异性的 Tet 应答转基因表达。

与热激诱导基因表达等其他方法相比，该技术的主要优势在于，deed on 系统能够以组织特异性的方式实现可诱导且可逆的基因表达。该方法有助于更深入地理解调控斑马鱼鳍再生的分子信号网络，因为它允许对特定组织中的信号通路和基因功能进行分析。尽管我们使用该技术研究斑马鱼鳍的再生，但它在许多需要组织特异性调控基因功能的其他研究场景中也同样具有重要应用价值。

根据文本方案建立Tet应答鱼系后，通过将单条G0代鱼与已建立的Tet激活子品系交配，评估转基因的生殖系整合及其可诱导性。随后收集胚胎，并将其培育至可评估Tet应答元件诱导作用的发育阶段。使用50%乙醇溶解多西环素，配制2000×的多西环素储备液，使其浓度达到50毫克/毫升。

将避光保护的泊洛沙姆（docks）分装后于负20摄氏度保存。接下来，配制含有泊洛沙姆的E3胚胎培养基，使其终浓度为25微克/毫升。然后，倒出胚胎中的大部分E3培养基。

替换为含有 E3 培养基的培养皿，并将胚胎放回 28.5 °C 环境中孵育至少六小时。孵育结束后，使用荧光体视显微镜筛选胚胎中的 Ypet 荧光信号。从已鉴定的 founder 胚胎中建立多个稳定的转基因 Tet 响应品系。

选择在预期表达区域内诱导效果强、嵌合现象少且个体胚胎间变异小的品系。在建立TED激活子品系和Tet响应品系后，将Tet激活子品系与Tet响应品系杂交，以获得双转基因鱼。通过体视显微镜下筛选am cyan荧光，挑选携带Tet激活子转基因的胚胎，并将am cyan阳性胚胎培育至成年。

通过基于PCR的基因分型，或根据其在目标组织中诱导Tet应答元件表达的能力，鉴定携带Tet应答元件以及Tet激活元件的双转基因成年鱼，以进行尾鳍截断实验。将成年斑马鱼置于含有160微克/毫升三卡因（trica）的鱼用水烧杯中麻醉。当鱼停止活动后，用镊子小心将其转移至倒置的培养皿上，并使用解剖刀对尾鳍进行部分截除，随后用多西环素（docs）处理。准备含有25微克/毫升多西环素（doxycycline）的一升鱼系统用水的繁殖盒。

作为阴性对照，在每个含有1升鱼系统水的繁殖盒中加入250微升乙醇，代替多西环素，将最多10条双转基因鱼转移至每个繁殖盒中，并将繁殖盒置于黑暗环境中以减少应激反应。至少六小时后，将处理后的鱼麻醉并转移至涂有湿琼脂糖的培养皿中，用镊子展开尾鳍。接着，在荧光显微镜下观察鱼再生组织中Y PET的出现情况。

随后，可将鱼类用于进一步处理，或放回鱼房饲养系统，以在部分鳍切除和药物处理后终止响应性转基因的诱导。根据本视频此前所述的实验设计，在特定时间点，使用镊子重新切除再生鳍，切口位于初始截肢平面近端约四到五个骨节处。操作时仅夹持组织的残端部分，小心地将再生组织平铺于含有4%（重量/体积）多聚甲醛（PFA）的PBS溶液的小培养皿中，于4°C固定过夜。次日，用PBS洗涤再生组织两次，随后将其转移至0.5摩尔的EDTA-PBS溶液中，于4°C继续脱钙过夜。接着，将再生组织在蔗糖-PBS溶液系列中室温孵育，每步30分钟；最后，用等体积混合的30%蔗糖-PBS溶液与组织包埋介质孵育额外30分钟。

将鳍转入组织冷冻介质中，在4°C下孵育至少两小时。然后将冷冻模具置于载玻片上，并用组织冷冻介质填充。将再生组织转移至冷冻模具中，并调整组织方向以获得纵向或横向切面。

确保再生组织保持平直，以利于切片。将包埋盒与载玻片一同转移至置于干冰床上的金属架上，开始冷冻过程。当包埋介质完全凝固后，将包埋盒移回室温，使介质在塑料与介质交界处开始解冻。

然后使用笔等工具将冷冻的组织块从冷冻模具中推出，并在负80摄氏度下保存，直至使用冷冻切片机进行切片。在防脱载玻片上收集10至14微米的切片，并将载玻片在负20摄氏度下保存至使用前。为表征鳍组织切片中Tet反应元件的表达，用预冷至负20摄氏度的100%甲醇处理切片30分钟。

用纸巾小心吸去液体。随后用PBT洗涤切片两次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次，每次5分钟。将切片在dappy中孵育10分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。

然后使用Antifa封片剂和盖玻片对样品进行封片，再通过共聚焦或宽场荧光显微镜成像，以观察已在斑马鱼中成功建立功能性TET-on系统的样本。该系统可用于检测特定组织中基因或信号通路的功能。如图所示，由HER 4.3启动子驱动的tet激活因子仅在再生组织的部分区域诱导TED响应元件的表达；YFP荧光在增殖性的近端芽基中被检测到，而远端芽基和表皮则无表达。

WINT β-连环蛋白拮抗剂在含有胚基增殖细胞的 HER 4.3 结构域中表达时，出乎意料地对再生细胞的增殖无影响。这表明，在增殖性近端胚基中，wind 甜菜碱信号通路对胚基ML细胞增殖的调控并无关键作用。相比之下，使用泛素启动子驱动的 Tet 激活剂品系在鳍再生组织的所有部位诱导 axin1 表达，则显著抑制再生细胞的增殖。

此外，在不包含成骨细胞的 HER 4.3 区域中，axon 1 的表达会严重干扰再生组织中的骨形成。因此，利用 TE on 系统在组织特异性水平上干扰 wind 信号通路，揭示了 wind 信号在调控细胞增殖和骨再生中的意外间接功能。一旦掌握，该技术可用于在任何目标组织中实现可诱导的靶向基因表达。

我们已成功应用该方法探究再生S鱼尾鳍中风床尼古丁信号通路的组织特异性功能。使用此方法将有助于更全面地理解调控组织再生的分子决定因素。