Name: 从大鼠的侧尾静脉血液取样 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学习大鼠侧尾静脉采血技术，通过尾静脉穿刺实现低应激血液采集。该方法使用蝴蝶导管快速取样，适用于重复采样和生理学研究，能有效降低动物应激反应并保证样本质量。

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感谢 Virginia Doherty 和 Junmei Yao 提供的技术支持。本研究由美国国家心理健康研究所（NIMH，项目编号 R01 MH084966）以及美国陆军研究办公室和国防高级研究计划局（资助号 W911NF-10-1-0059）资助，资助对象为 KAG。

所有实验均使用成年雄性Long-Evans大鼠进行。所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》，并经麻省理工学院机构动物护理和使用委员会以及美国陆军医学研究与材料司令部动物护理和使用审查办公室批准。
1. 准备
<ol>
	<li>将带保护套的针头插入含有肝素（1,000 USP 单位/ml）的 500 µl 离心管中，通过针头抽吸并排出肝素溶液，以对导管和注射器进行肝素化处理。
	<ol>
		<li>将蝶形导管连接至注射器。保持针头上的保护套处于覆盖状态，以防止针尖受损。</li>
		<li>抽取略多于待采集血量的肝素溶液。取下注射器并吸入空气。</li>
		<li>将注射器重新连接至导管，利用空气排出多余的肝素溶液；确保导管、针头和注射器内仅残留微量肝素。</li>
		<li>将已连接注射器的无菌导管置于无菌表面上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用干净的布迅速固定大鼠，确保其前肢和后肢处于舒适位置，且呼吸不受限制。
	<ol>
		<li>使用魔术贴将包裹固定；注意不要压迫外生殖器。</li>
		<li>由助手在稳固的工作台面上轻轻而牢固地固定大鼠（腹部和尾根部），使尾巴悬垂于台面边缘。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 血液采样
<ol>
	<li>将尾巴浸入42 °C的水中40-50秒以扩张血管，然后用纸巾擦干尾巴。确定采血的尾静脉位置（通过旋转整个身体来调整尾巴位置，避免扭转尾巴）。 
	注意：充分加热尾巴对于快速采集血样至关重要。如果血管收缩，则导管放置困难，且血流会显著减少。可使用加热垫代替水浴作为替代方法。</li>
	<li>确定采样点。 
	&#8203;注意：动脉位于尾巴的背中线位置；请勿在此处采样。
	<ol>
		<li>选择位于动脉外侧的左侧或右侧尾静脉作为目标。尾巴的色素沉着因品系而异，并随年龄增长而加深，可能遮蔽部分血管结构。应选择尾巴下部的一段静脉作为穿刺部位。</li>
		<li>用2%氯己定消毒液擦拭目标区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将注射器活塞从零位回抽至约50 µl处，在注射器和导管内建立负压。</li>
	<li>在靠近尾尖处轻轻而牢固地握住尾巴，确保在整个采样过程中保持尾巴伸直。注意握力不可过紧，以免阻断血流。</li>
	<li>将导管以较浅的角度缓慢插入距尾尖约5 cm处的静脉。当刺入静脉时，血液将流入导管。缓慢回抽注射器活塞，以稳定的速度收集所需体积的血液（约每秒20 µl）。
	<ol>
		<li>有关可采集的最大血量信息，请咨询兽医人员。最大采血量取决于大鼠的体重和健康状况。在14天内采集的血液总量不应超过总血容量的15%。 
		注意：若动物在采样前数分钟内经历了急性应激，则采血将变得困难得多，因为应激激素会引起血管收缩。例如，将大鼠的饲养笼转移至新环境、花费数分钟包裹动物，或反复将导管插入静脉等操作均可能引发急性应激反应。</li>
		<li>通过“挤奶”方式促进血液流动。用手指沿静脉从近端向尾尖方向轻轻挤压，但手指应距离针尖或导管插入点超过2 cm，以防导管从静脉中脱出。</li>
		<li>若在初次穿刺位置无法成功采血，可将针头沿静脉向上重新插入。若已在初次位置采集到血液，在再次插入静脉前，应通过断开并重新连接导管与注射器的方式使针头重新加压。通常应尽量避免多次穿刺。</li>
		<li>由于多次穿刺可能导致尾静脉塌陷，进而中断尾部血液供应并引起软组织坏死，一旦发生尾静脉塌陷，应实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当采集到足够的血样后，通过断开并重新连接导管的方式释放注射器内的压力。使用注射器活塞轻微抽吸（约50 µl），然后将针头从静脉中撤出。 
	注意：若在未先释放注射器内压力的情况下拔出针头，血液会从针头滴出。</li>
	<li>短暂按压穿刺部位以止血，并用消毒液擦拭该区域。将大鼠放回其饲养笼中。</li>
</ol>
3. 血液样本的处理
<ol>
	<li>吸取空气以确保导管针内无残留血液，然后用剪刀在针头上方剪断导管管路。将血液排入无菌的1.5 ml微量离心管中。 
	注意：若血液经针头推出，剪切力可能导致红细胞破裂，从而干扰多种下游检测。为避免溶血，请移除针头。
	<ol>
		<li>采集血浆时，使用含有EDTA作为抗凝剂的试管（此处，每200–400 µl血液使用10 µl的0.1 M EDTA；确保所用EDTA浓度不会干扰下游检测），并置于冰上。
		<ol>
			<li>在采血后10分钟内，将全血样本于4 °C预冷的离心机中以2,100 × g离心10分钟。小心收集上清血浆，避免扰动红细胞和白细胞层。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采集血清时，将样本（不含抗凝剂）于室温放置最多30分钟，以促进凝血。随后将采集管于4 °C预冷的离心机中以2,000 × g离心，之后可收集血清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本应立即使用，或于-80 °C保存不超过一年。</li>
</ol>

<ol><li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li>
<li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps%3A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li>
<li>Chan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+blood-based+protein+biomarker+strategies+in+the+study+of+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders.</a> Prog Neurobiol. , (2014).</li>
<li>Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induces+learning+impairment+that+is+mediated+by+interleukin+1beta+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents.</a> PLoS One. 7 (12), e51431(2012).</li>
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<li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li>
<li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynorphin%2C+stress%2C+and+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li>
<li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical%2Fhippocampal+monoamines%2C+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种快速且简便的大鼠采血方法，相较于其他常用技术具有显著优势。首先，该方法无需麻醉，而颈静脉或眶后窦采血则通常需要麻醉。当在行为学实验前后采集血样时，使用麻醉剂是不理想的，因为它可能干扰学习和记忆过程4,5。其次，与其他静脉穿刺技术（如隐静脉或背足静脉采血）相比，该方法可采集更多的血液量。采用本方法，单次可从大鼠采集多达1.5 ml的血液，足以支持多项检测同时进行。最后，与断尾采血或眶后出血法相比，该方法显著降低了组织损伤的风险。使用本方法有助于符合《动物福利法》和《实验动物护理与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）的要求，这些法规强调应尽量减少实验动物在操作过程中所经历的疼痛与痛苦。
建议初次使用该方法的研究人员练习固定和尾部采血技术，以尽量缩短实验动物的束缚时间。从开始束缚起3分钟内采集的血液可获得最佳结果。
此处所述的采样方案每周可进行1至4次，但每天不得超过两次。虽然可以进行多次采血，但应从尾部基端开始逐步向上选择不同的采样位点，并交替使用左尾静脉和右尾静脉作为采样部位。啮齿类动物的总血容量为其体重的6-7%，在两周内采集的血量不应超过总血容量的15%。血清或血浆约占采集样本体积的40-60%。
也可通过小鼠的侧尾静脉进行采血，具体方法如上所述，仅需少量修改。首先，只能使用小规格（27 G）导管。其次，建议使用管状固定器而非包裹方式来固定小鼠。通过下颌下血管束穿刺获取的血量（200–500 µl）大于从尾静脉安全采集的血量（最多200 µl）。由于从下颌下血管束采血所需固定程度较小且可获得更多的血液，因此这是小鼠采血的首选途径。
该操作可快速完成，且具有微创性，因此也能最大程度地减少急性应激反应对血液检测指标的潜在干扰6。急性应激反应可改变多种分子的循环水平，包括白细胞介素及其他免疫活性因子7、下丘脑-垂体-肾上腺轴激素8、交感神经系统中的激素9、胃饥饿素（ghrelin）10、内源性阿片类物质11、多巴胺和5-羟色胺12。如果需要获取这些分子或受其调控的其他分子在静息状态下的循环水平，则必须尽可能减少应激反应，因为应激反应在接触应激源后短短一分钟内即可被激活。
应激反应不仅会改变血液成分，还会因交感神经系统活动增强导致血管收缩，从而给采血带来技术上的困难。当大鼠出现急性应激反应时，获取稳定的血流变得越来越困难。因此，必须尽量减少动物的痛苦，以快速获得能够反映目标生理状态的血样。

从血液中获得的生物标志物在许多临床背景下提供了有用的诊断、预测和分层指标，包括心血管疾病1、癌症科学2和精神疾病3。这些指标也可用于基础科学研究，以评估机体的“状态”，如饥饿、炎症或应激的程度。这些测量结果可能受到各种变量的影响，其中一些变量可能与研究问题相关，也可能不相关，例如采样时间以及受试者的性别。此外，采血过程本身所引起的应激也可能影响结果。应激激素水平以及对疼痛的感知会迅速改变血液的成分。
啮齿类动物是最常用的实验动物，已开发出多种采血方法。理想的采血方法应对动物的生理影响最小，无需麻醉，能够快速且重复采样，并能提供足够体积的血液用于多种下游应用。一些常用的采血技术，如颈静脉插管或尾尖截除，均无法满足这些要求。
本方案的目的是描述一种用于大鼠的采血技术，该技术应尽可能减少应激反应，无需麻醉，允许对单个动物进行多次采血，并能提供相对较大的样本量，从而可在单一样本上进行多种检测。该方法的目标是获取受急性应激反应影响最小的血液样本。

<table><tbody><tr><td>肝素钠（1,000 USP 单位/毫升）</td><td>Patternson Veterinary Supply</td><td>25021040010</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>JT Taylor</td><td>JT2020-01</td><td></td></tr><tr><td> Dermachlor 洗剂-氯己定</td><td>Butler Schein</td><td>6356</td><td>外用抗菌溶液，2% 葡萄糖酸氯己定</td></tr><tr><td>SURFLO 翼状输液套件，Terumo，蝶形导管</td><td>VWR Scientific</td><td>TESV25BLK</td><td></td></tr><tr><td>BD 结核菌素 1 毫升注射器</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>1.5 毫升微量离心管</td><td>VWR Scientific</td><td>89202-682</td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;mu;l 微量离心管</td><td>VWR Scientific</td><td>21150-330</td><td></td></tr><tr><td>剪刀，不锈钢，5&quot;</td><td>VWR Scientific</td><td>82027-586</td><td></td></tr><tr><td>500 毫升塑料烧杯</td><td>VWR Scientific</td><td>414004-149</td><td></td></tr><tr><td>洁净布包裹材料</td><td>Butler Schein</td><td>2993</td><td></td></tr><tr><td>魔术贴带，0.75 英寸宽</td><td>Monoprice</td><td>B004AF9II6</td><td>钩环带</td></tr><tr><td>计时器</td><td>VWR Scientific</td><td>62344-641</td><td></td></tr></tbody></table>

从大鼠尾侧静脉采血

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

在许多实验情境中，通常通过采集血液样本来测定感兴趣的靶标物，包括激素、免疫因子、生长因子、蛋白质和葡萄糖等。然而，血液成分受到动态调控，且容易受到干扰。其中，采样过程引发的应激反应是改变血液成分的一个因素，可能导致目标检测指标的变异性。本文介绍一种从大鼠尾侧静脉采血的操作方法。该方法相较于其他常用技术具有显著优势：可在无需麻醉或镇痛的情况下实现快速采样，且疼痛和侵入性最小；此外，该方法可采集较大体积的血液样本（某些大鼠单次采样量可超过1 ml），并可在多个实验日重复使用。通过最大限度地减少采血引起的应激反应和疼痛，所获得的检测结果能更准确地反映动物真实的基线状态，受采样操作本身的影响降至最低。

按照本方案所述，从侧尾静脉采集的血液血浆呈半透明淡黄色。如图1所示，样本发生溶血会使血浆呈现红色色调。急性应激反应可迅速改变血液成分。例如，循环中皮质酮浓度在应激暴露后10分钟内即可显著升高，如图2所示。在应激暴露前，采用本方法获得的皮质酮基础水平较低，表明采样过程本身并不会引起明显的应激反应。
<img alt="血液分离实验，离心管对比，标记为 A 和 B，实验室分析。" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1: 样本外观。 (A) 显示溶血样本。离心后，血浆或血清层（黑色箭头所示表面）呈现粉红色或红色调。颜色越深，表明溶血程度越高。(B) 离心后，正确采集的样本上层（黑色箭头所示表面）应呈清澈淡黄色，对应于未溶血的血浆或血清。在移取该层时，应注意不要扰动下层的全血，避免将移液器吸头插入全血层或将全血吸入吸头中。任何被全血污染的血浆或血清均应弃用。
<img alt="皮质酮浓度图；采样时间点；基线与实验后分析结果对比。" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2：经历应激事件后，血浆皮质酮迅速升高。在成年雌性Long-Evans大鼠暴露于4次声音刺激（10秒，2 kHz，85 dB）并伴随足底电击（1秒，350 µA）之前及之后10分钟，从其尾侧静脉采集血液。基线时的血浆皮质酮水平（290.4 ± 138.8 pg / ml）显著低于电击应激后10分钟的水平（2204.8 ± 454.5 pg / ml，p = 0.02，n = 4），经配对t检验确定。*，p &lt;0.05

血液样本可用于评估生理状态或疾病的生物标志物 in vivo。本文描述了从大鼠尾侧静脉采血的方法。该方法可快速获取样本，且疼痛轻微、侵入性最小。

血液样本在许多实验环境中常被采集，用于检测目标物质，包括激素、免疫因子、生长因子等。

本实验方案的总体目标是通过侧尾静脉采血，以最大限度减少大鼠采血过程中的应激反应。首先固定大鼠并加热尾部使静脉扩张；第二步将蝶形套管插入一条扩张的侧尾静脉；最后一步完成血液抽取。拔除导管并停止穿刺部位的血液流出。最终，从尾侧静脉采血可在大鼠采血过程中产生极小的应激反应，从而降低急性应激反应对血液成分的影响。与尾尖截除等现有方法相比，该技术的主要优势在于对动物造成的痛苦显著减少，并且允许对同一受试对象进行多次重复采血。该操作将由本实验室的两名成员演示：博士后Graham Lee和技师Elia Harmatz。首先，将蝶形针头导管连接到注射器上，同时保持针头保护套覆盖针尖以保护其尖端。然后，抽取略多于待采集血液体积的肝素溶液。取下注射器，并用空气充满注射器。将注射器重新连接到导管上，并排出管路、针头和注射器中除微量以外的全部肝素溶液。然后将导管和注射器置于无菌表面。接着，迅速用一块洁净布料固定大鼠，注意使其前肢和后肢处于舒适位置，并确保呼吸不受限制。使用尼龙搭扣胶带固定包裹。然后在稳固的工作台面上，由助手用手轻轻而牢固地抓住大鼠的腹部和尾根部，使尾巴悬垂于台面边缘，以采集血样。接着，将尾巴浸入42摄氏度的水中40至50秒，以扩张尾部血管。然后用纸巾擦干尾巴，并握住尾巴旋转整个小鼠身体，以找到位于动脉侧方的右侧或左侧尾静脉，用于采血。选择尾部下方一段静脉作为目标区域，并用2%氯己定消毒液擦拭该部位。接下来，将注射器活塞从零刻度缓慢拉至约50微升处，使注射器内形成负压，然后轻轻而牢固地握住尾尖附近部位，保持尾巴伸直，以便采集样本。现在，以较小的角度将导管缓慢插入静脉，进针位置距离尾尖约五厘米。当导管刺入静脉后，血液将流入导管，此时缓慢回抽注射器活塞，以大约每秒20微升的稳定速度采集所需血量。为促进血液流动，用手指从尾根部向尾尖方向沿静脉轻柔推压，注意手指应距离导管针尖至少两厘米以上，以帮助血液流出。如果无法从导管穿刺的初始位置成功采集血液，可将针头沿静脉更远的位置重新插入。当采集到足够的血样体积后，断开并重新连接导管以释放注射器内的压力。然后将针头从静脉中撤出，并在穿刺部位短暂施加压力以止血，直至出血停止。用消毒液擦拭操作区域，然后将动物放回其饲养笼中。处理血样时，吸取空气以确保导管针内无残留血液，并用剪刀在针头上方剪断导管管路。取下针头后，收集血液血浆，并将血液排入含有EDTA的微量离心管中。作为抗凝剂。轻轻弹动试管，使抗凝剂与血液充分混匀，然后将样本置于冰上。采样后10分钟内离心全血并收集血浆，注意不要扰动红细胞和白细胞层，以获取血清。将血液置于不含抗凝剂的微量离心管中，在室温下静置最多30分钟。待血液凝固后，将采集管在冷藏离心机中离心，并收集血清。这两种样本均可立即使用，或在负80摄氏度下保存长达一年。如图所示，从尾侧静脉采集的血液血浆，外观呈半透明淡黄色。若发生溶血，血浆将呈现红色色调。急性应激反应可迅速改变血液样本的成分。例如，在此代表性实验中，暴露于应激源后10分钟内，循环皮质酮浓度会显著升高。然而重要的是，通过该方法在施加应激源前获得的皮质酮基础水平较低，表明采样过程本身并不会造成明显的应激反应。我们建议您在麻醉动物上练习此操作，直至熟练掌握针头插入和血液采集技术。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五分钟内完成。在执行此操作过程中，重要的是要记住尽量减少任何潜在的应激源，例如环境噪音，并尽可能快速地完成操作。

sampling-blood-from-the-lateral-tail-vein-of-the-rat

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从大鼠的侧尾静脉血液取样

在大量研究中都需要进行采血，例如用于研究化合物的药代动力学特征。本文中，我们演示了两种从大鼠采血的技术：从隐静脉采血或经心脏穿刺采血。...

通过隐静脉采血和心脏穿刺法从大鼠采血

本文介绍一种使用真空采血管系统在未麻醉大鼠中进行尾静脉采血的简便方法。该方法可降低直接接触血液的风险，并简化单次穿刺后多次采样的操作。...

使用真空采血系统对未麻醉大鼠尾静脉进行重复采血

本文介绍了一种从大鼠锁骨下静脉采集血液样本的实验方案。...

经颈静脉穿刺作为大鼠采血的替代方法

本研究报道了使用真空采血管系统结合眼镜式放大镜从小鼠尾静脉采血的方法。该方法易于操作，可用于小鼠的重复采血。...

使用真空采血系统和眼镜式放大镜对未麻醉小鼠尾静脉进行改良采血

本方案描述了一种从大鼠锁骨下静脉采集血液的简单且高效的方法。该方法无需麻醉，可实现快速、及时且易于识别的采样，并通过重复采样获得高质量的血液样本。...

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本文介绍了一种为大鼠模型提供快速、简便且可靠的血液采集替代方法的实验方案。我们根据不同的实验条件描述了三种不同的采血方法：在麻醉状态下或清醒动物上进行的尾静脉穿刺，以及在麻醉状态下进行的背侧阴茎静脉穿刺。...

大鼠模型中改良尾静脉和阴茎静脉穿刺采血法

该方案展示了对癫痫大鼠进行重复的脑脊液和血液采集，同时并行持续视频脑电图（EEG）监测。这些操作对于探索多种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能关联至关重要。...

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本文介绍了一种有效的大鼠约束与锁骨下静脉穿刺方法的组合，可在无需麻醉的情况下实现大鼠快速、安全且可重复的采血。...

清醒大鼠锁骨下静脉采血

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利用 StemCell Technologies 公司的 RosetteSep 试剂盒从人血液中富集自然杀伤细胞

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学习大鼠侧尾静脉采血技术，通过尾静脉穿刺实现低应激血液采集。该方法使用蝴蝶导管快速取样，适用于重复采样和生理学研究，能有效降低动物应激反应并保证样本质量。

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