甲基绿在胚胎荧光标记中的DNA特异性染色应用

在本视频中，我们将展示常用的组织学染料甲基绿如何作为一种极为便捷的细胞核标记物，应用于荧光显微镜，特别是在整胚等厚生物样本的激光共聚焦显微镜观察中。在简要介绍甲基绿作为一种特异性DNA染料之后，我们将描述配制甲基绿储备液和工作液以进行荧光染色的方法。随后，我们将演示实现细胞核染色的实验步骤，并展示若干鱼类胚胎样本以及所获得的共聚焦图像实例。

最后，将展示并讨论甲基绿优异的理化性质。Freddy Misha 于 1869 年发现了 DNA，并在几年后证明其可与一种相对较新的苯胺染料甲基绿形成沉淀。甲基绿带有两个正电荷，能够与 DNA 的大沟区域发生强烈相互作用，优先结合富含 AT 的区域。

甲基绿最广泛的应用是与RNA染料派洛宁（perine）组合，配制成鼻腔溶液，该方法由UNA和Poppen Heim在20世纪初开发。然而，关于甲基绿的荧光特性却鲜有研究。正因如此，我们决定探索其是否可用作对细胞中DNA具有极高亲和力和特异性的荧光标记物。

甲基绿是一种含有七个甲基基团的三苯甲烷染料。其中第七个甲基基团容易丢失，导致其重新转化为结晶紫。因此，甲基绿中通常混有一定量的结晶紫以去除结晶杂质。

可使用氯仿洗涤甲基绿紫溶液以萃取结晶紫。我们将立即为此目的在通风橱中配制4%ACU溶液。将其与至少两份氯仿混合，并进行离心以加速相分离。

离心后，我们得到含有孔雀绿的水相和含有氯仿与结晶紫的下层有机相。收集上层水相，并重复此过程直至下层有机相变为澄清。最后，收集上层水相并进行稀释。

该溶液在工作台可稳定保存数月。现在我们将演示如何用甲基绿对胚胎层中的整个 MO 进行染色。对于共聚焦显微成像，我们将使用高通透性的斑马鱼胚胎。

例如，获取斑马鱼胚胎，并用滤网洗去碎片。将胚胎置于鱼缸水或胚胎培养基中，孵育至所需发育阶段。用精细镊子去除绒毛膜，并将胚胎在4%多聚甲醛中固定数小时或过夜。

随后用PBST清洗胚胎数次。将储备液用PBST稀释5,000至10,000倍，配制甲基绿工作液。将胚胎在该溶液中于室温孵育至少3小时，或于4°C孵育过夜。

本示例中，将在配备光谱检测器的共聚焦显微镜上获取共聚焦图像。使用633纳米激光可实现最大激发，检测器设置为可见光谱红光区域的宽范围。

甲基绿的红色发射使其能够从整体胚胎等深层样本中获得高质量的细胞核成像，且信号损失极小。第一组图像显示的是用一种成熟的DNA染料Pro Three染色的斑马鱼视网膜细胞核。一分钟后，我们缩小视野。

当我们使用甲基绿进行相同的实验时，ABL扫描区域变得明显，且未观察到明显的漂白现象。在接下来的系列图像中，我们展示了采用本方案可获得的代表性结果：来自斑马鱼表皮的有丝分裂细胞，其中可观察到有丝分裂相；以及同一标本中的IIC期细胞核，其细胞核结构清晰可见。

使用甲基绿阿玛林标记的斑马鱼幼虫表皮细胞部分的三维重建，展示了受精后48小时不同细胞核形态的更全景视图，银鱼，br视网膜。本文展示了一种简便方法，用于制备一种极为廉价的荧光DNA染料，可用于细胞核标记。尽管我们仅以hold several为例进行说明，但该技术可应用于您的胚胎或组织，无论是整体封片还是切片样本。

它还可用于凝胶中的DNA染色，以及通过光度法测定溶液中的DNA含量。