Name: 对于纳米颗粒疫苗接种后的分析抗原特异性CD8 + T细胞应答整体动物成像和流式细胞技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习利用脂质纳米颗粒疫苗在小鼠模型中诱导抗原特异性CD8+T细胞扩增的方法。通过整体动物成像和流式细胞术技术，研究人员可实时追踪T细胞动态并精确定量细胞群体，为疫苗开发提供重要的非侵入性评估手段。

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本研究由美国国立卫生研究院资助项目1K22AI097291-01以及美国国立卫生研究院转化科学促进中心资助奖项UL1TR000433支持。我们还感谢麻省理工学院的Darrell Irvine教授和弗雷德·哈钦森癌症研究中心的Matthias Stephan教授在疫苗纳米颗粒及OT-I/Luc转基因小鼠的初期工作中所做出的贡献。

本方案中描述的所有实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）批准，并依照既定的政策与指南进行。
1. 共载蛋白抗原和佐剂分子的ICMV合成与表征
<ol>
	<li>以1:1的摩尔比混合1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酰胺]（MPB）溶于氯仿中，保持每批总脂质含量为1.26 µmol（即， 500 µg DOPC 和 630 µg MPB 置于一个 20 ml 玻璃小瓶（直径 = 28 mm，高度 = 61 mm）中。</li>
	<li>添加脂溶性药物，例如单磷酰脂质A（MPLA）或脂溶性染料（例如， DiD）加入脂质溶液中，使其达到所需浓度。用高纯氮气吹扫以彻底去除有机溶剂，并将样品置于真空环境中过夜。</li>
	<li>通过加入含有水溶性药物的200 µl 10 mM bis-tris丙烷（BTP，pH 7.0）缓冲液水合脂质膜例如， 蛋白质抗原）。在室温下每10分钟涡旋振荡10秒，持续1小时。</li>
	<li>将玻璃小瓶中的内容物转移至1.5 ml微量离心管中，将样品置于冰水浴中，使用125 W/20 kHz探头式超声破碎仪，在40%强度下持续超声处理5分钟。</li>
	<li>向每批样品中加入 4 µl 的 150 mM 二硫苏糖醇（DTT）（工作浓度为 2.4 mM），涡旋混匀，然后使用台式微量离心机短暂离心。</li>
	<li>加入 40 µl 的 200 mM CaCl2 用移液器混匀（工作浓度为 33 mM）。将样品在 37 °C 下孵育 1 小时，以使含 MPB 的脂质层与 DTT 发生交联。</li>
	<li>在 20,000 × g 条件下离心样品 15 分钟，弃上清，用 200 µl 去离子水重悬2O.</li>
	<li>重复步骤 1.7，并在第二次加入 ddiH₂O 后再次离心2O 洗以去除 CaCl₂2，未反应的DTT以及上清液中未包封的货物材料。</li>
	<li>配制 10 mg/ml 的 2 kDa 聚乙二醇-硫醇（PEG-SH）水溶液，使用双蒸水（ddiH₂O）作为溶剂。2O. 将每个ICMV样品重悬于100 µl PEG-SH溶液中，37 °C孵育30 min。</li>
	<li>进行两次 ddiH2O 洗涤（步骤 1.7），并将最终的 ICMV 沉淀重悬于 PBS 中，4 °C 保存。使用前需混匀 ICMV 悬液，因为颗粒在长期储存后可能沉降至管底。</li>
	<li>为表征颗粒，从每批ICMV中取出少量等分试样（约10%），分别加入总体积为1 ml的ddiH₂O中稀释2O. 将单个样品置于Zetasizer样品池中，使用动态光散射（DLS）及zeta电位测量系统，按照制造商提供的操作说明测定样品的粒径、多分散系数和zeta电位。</li>
</ol>
2. 使用共聚焦显微镜检测荧光标记的ICMV的引流淋巴结
<ol>
	<li>制备负载荧光标记抗原和脂溶性荧光染料的ICMVs
	<ol>
		<li>根据制造商说明书制备荧光标记蛋白，例如用Alexa Fluor 555-琥珀酰亚胺酯标记的卵清蛋白。</li>
		<li>为制备在脂质外壳中带有荧光标记的ICMVs，在制备脂质膜（步骤1.2）时加入脂溶性荧光染料（例如，1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青，DiD），其摩尔比例为总脂质的0.05%。在脂质膜水化（步骤1.3）时，使用含有荧光标记抗原的缓冲液，并按照步骤1.4–1.11完成ICMVs的合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在尾部基底皮下注射纳米颗粒
	<ol>
		<li>根据IACUC批准的动物实验方案，使用配备诱导室和可控气流蒸发器的3%异氟烷和1.5 L/min氧气流对小鼠进行麻醉。一旦小鼠失去意识，需在麻醉消退前迅速完成以下操作，以确保注射部位的良好可及性并尽量减少动物不适。或者，可使用合适贴合的鼻罩维持麻醉。若小鼠麻醉时间超过5分钟，术后应使用眼用润滑剂以减少角膜刺激。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒尾部基底以消毒并润湿毛发&#160;分开湿润的毛发，暴露一小片可见皮肤，以便观察皮下针头位置。</li>
		<li>制备含有预定剂量抗原和佐剂的颗粒注射悬液，每100 µl疫苗剂量溶于PBS中（例如，以往研究中使用每100 µl注射剂量含10 µg OVA和0.3 µg MPLA6,9）。</li>
		<li>将颗粒悬液吸入带有27–29 G针头的注射器中，将针头斜面朝上插入尾部基底（距毛际约5 mm），注射50 µl颗粒悬液22。</li>
		<li>等待数秒使压力平衡，防止过多回流，然后拔出针头。在尾部基底另一侧重复注射，以靶向双侧引流腹股沟淋巴结。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>淋巴结冷冻切片的制备及共聚焦显微镜观察
	<ol>
		<li>根据IACUC批准的动物实验方案，采用CO2窒息法处死小鼠，随后诱导气胸。按照Bedoya23展示的方案取出腹股沟淋巴结，并将组织置于1 ml 4 °C PBS中洗涤去除血液。</li>
		<li>用吸水纸吸去组织表面PBS，将组织置于预先装满OCT包埋剂至顶部的组织冷冻模具（10 x 10 x 5 mm3）中24。将组织块在液氮中速冻30秒。或者，可将组织块置于干冰上冷冻30分钟。将冷冻组织储存于-80 °C冰箱中。</li>
		<li>在设定为-20 °C的恒冷切片机中切割5–10 µm厚的组织切片24。</li>
		<li>如有需要，进行免疫荧光标记，并如先前所述方法24通过共聚焦显微镜观察组织切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过全动物成像监测纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性、表达荧光素酶的 CD8+ T 细胞的扩增
<ol>
	<li>OVA的分离257-264来自OT-I/Luc转基因小鼠的特异性表达荧光素酶的CD8+ T细胞
	<ol>
		<li>以 CO₂ 处死一只 OT-I/Luc 转基因小鼠2 根据IACUC批准的动物实验方案，通过窒息法处死动物并诱导气胸。以无菌方式打开腹腔，小心分离脾脏与胰腺之间的组织，摘取脾脏。23，置于5 ml 4 °C的PBS + 2% FBS中，转移至组织培养操作台。</li>
		<li>将脾脏置于覆盖在50 ml锥形离心管上的70 µm尼龙筛网上（每次最多可处理3个脾脏）。使用3 ml注射器的推杆将细胞研磨通过筛网。</li>
		<li>用 PBS + 2% FBS 清洗活塞和滤网，弃去洗涤液。将50 ml离心管中的总体积调整为每只脾脏10 ml，取少量细胞悬液用血细胞计数板进行计数，然后以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>使用市售的磁性阴性选择试剂盒，按照生产商说明书分离CD8+ T细胞群体。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞后，计数分离得到的 CD8+ T 细胞数量。为评估分离的 CD8+ T 细胞纯度，将约 20,000–30,000 个细胞与 20 µl 小鼠 CD16/32 抗体（0.025 mg/ml）在 4 °C 下孵育 10 分钟，随后加入 20 µl αCD8-APC 抗体（0.005 mg/ml），继续在 4 °C 的 PBS + 1% w/v BSA 中孵育 30 分钟。所有孵育步骤均在 4 °C 的 PBS + 1% w/v BSA 中进行。随后进行流式细胞术分析25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离CD8+ T细胞的过继转移及疫苗接种后其扩增的可视化
	<ol>
		<li>将分离得到的OT-I/Luc CD8+ T细胞通过尾静脉注射至幼稚型C57BL/6小鼠，细胞数量为1-10 × 10⁶个。5 通过尾静脉注射将细胞注入200 µl PBS体积中22 （第 -1 天）。考虑到 C57BL/6 小鼠的毛发和黑色皮肤斑块可能干扰生物发光信号，脱毛的白化 C57BL/6 小鼠是此类研究的理想选择。</li>
		<li>一天后（第0天），按照之前所述方法（第2.2节）给予疫苗。</li>
		<li>按每公斤小鼠体重150 mg的剂量，通过腹腔注射300 µl PBS溶解的荧光素酶底物（luciferin）。注射10 min后，用异氟烷（同步骤2.2.1）麻醉小鼠，利用活体成像系统（IVIS；参见Wilson）采集生物发光信号，持续5–10 min，以检测OT-I/Luc CD8+ T细胞。26 如需详细说明，请参见相关指南。根据纵向研究需要重复上述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 用于抗原特异性CD8+ T细胞分析的PBMC肽-MHC四聚体染色
注意：以下实验方案可使用经OT-I/Luc CD8+ T细胞过继转移的C57BL/6小鼠，或未经过继转移的C57BL/6小鼠进行。
<ol>
	<li>在接种疫苗后的预定时间点，通过下颌下出血法从小鼠采集约 100 µl 血液（4–6 滴）27 加入到含有K涂层的试管中2加入EDTA并颠倒混匀数次以防止凝固。</li>
	<li>将100 µl血液转移至微量离心管中，加入1 ml裂解缓冲液，孵育2至3分钟，以去除红细胞（RBCs）。在1,500 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。如果沉淀仍呈红色（表明红细胞未完全去除），则用短暂孵育重复裂解步骤&#60; 1 分钟）裂解缓冲液。</li>
	<li>用1 ml FACS缓冲液（PBS + 1% w/v BSA）洗涤剩余的PBMCs，在1,500 × g离心5 min。</li>
	<li>吸去上清液，将样品重悬于20 µl小鼠CD16/32抗体（0.025 mg/ml）中，以阻断非特异性和FcR介导的抗体结合。室温孵育10分钟。</li>
	<li>将细胞从微量离心管转移至4 ml圆底FACS管中。加入20 µl H-2Kb 根据制造商说明书，向每个样品加入OVA四聚体-SIINFEKL-PE溶液，冰上孵育30分钟。</li>
	<li>制备抗体混合液（例如， αCD8-APC、αCD44-FITC 和 αCD62L-PECy7 抗体（浓度分别为 0.005、0.005 和 0.002 mg/ml）。向每个实验样品中加入 20 µl，冰上孵育 20 分钟。通过使用上述指定浓度的每种荧光标记四聚体或抗体对细胞进行标记，制备单荧光素对照。</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤2次，将最终的细胞沉淀重悬于含有2 µg/ml DAPI的FACS缓冲液中。细胞现在可用于流式细胞术分析（相关细节和示例见Scheffold）25).</li>
</ol>

Perkin Elmer 提供了本文发表期间产生的出版费用。

本文提供的实验方案描述了一种新型脂质基纳米颗粒系统（称为ICMVs）的合成与表征，并阐述了验证基于纳米颗粒的疫苗制剂诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应有效性的过程。ICMV的合成完全在水相条件下完成，相较于其他常用的聚合物纳米颗粒系统（例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物颗粒），这是一个显著优势，因为后者通常需要使用有机溶剂进行制备，往往导致蛋白质抗原抗原性的丧失29,30。此外，ICMVs具有高度稳定性，并能够包封疏水性和亲水性分子6，从而可实现抗原与佐剂共递送至抗原呈递细胞（APCs）内的同一细胞内区室31,32。本文以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒，概述了以下实验步骤：（1）纳米颗粒的合成与表征；（2）纳米颗粒向引流淋巴结（dLNs）迁移的验证；以及利用（3）非侵入性生物发光成像技术和（4）外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色法检测抗原特异性CD8+ T细胞反应的诱导情况。
确保纳米颗粒在不同批次间的合成具有一致性至关重要，尤其是粒径和表面电荷，因为这些因素会显著影响纳米颗粒在体内的淋...

传统的疫苗研发主要采用试错法的经验性方法。然而，随着近年来大量生物材料的发展以及免疫激活分子决定因素的发现，现在已有可能基于病原体提供的生物物理和生化信号，理性设计疫苗制剂1,2。特别是，多种颗粒型药物递送平台已被研究作为疫苗载体，因其可同时负载亚单位抗原和免疫刺激剂，保护疫苗组分免于降解，并增强其向淋巴结（LNs）内抗原呈递细胞（APCs）的共递送，从而最大化免疫刺激与激活效果3-5。在本报告中，我们描述了一种“模拟病原体”的纳米颗粒系统——层间交联多层囊泡（ICMVs）的合成方法。该系统此前已被证明是一种高效的疫苗平台，可在全身和黏膜组织区室中诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和体液免疫应答6-9。特别是，与使用传统佐剂（例如，铝盐和Montanide）相比，ICMV疫苗接种显著提高了针对疟疾抗原的血清IgG水平7，并在小鼠模型中对肿瘤细胞和病毒感染挑战诱导出强效的CTL应答9。在此，以ICMVs作为模型疫苗纳米颗粒系统，我们介绍了疫苗纳米制剂的表征方法，包括粒径与zeta电位测定，以及利用冷冻组织切片的共聚焦成像技术追踪颗粒向引流淋巴结（dLNs）的转运过程7。此外，我们展示了一种基于整体动物成像的方法，用于分析在过继转移表达荧光素酶的抗原特异性CD8+ T细胞后，小鼠体内CTL应答的扩增情况9,10。最后，我们描述了通过四聚体染色外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，用于纵向定量评估纳米颗粒疫苗接种小鼠体内源性T细胞应答6,9。
ICMVs 是一种基于脂质的纳米颗粒制剂，通过将简单脂质体可控融合成多层结构而合成，随后通过二硫醇交联剂对脂质层内马来酰亚胺功能化的磷脂头部基团进行化学交联，从而实现化学稳定。6合成ICMV后，可取少量纳米颗粒用于测定粒径和zeta电位（即， 使用动态光散射（DLS）系统和zeta电位分析仪测定颗粒的表面电荷。DLS通过测量颗粒悬浮液中光散射的变化，可确定颗粒的扩散系数及其流体动力学尺寸。11实现批次间合成颗粒大小的一致性至关重要，因为颗粒大小是影响疫苗颗粒向引流淋巴结（dLNs）淋巴转运及其被抗原呈递细胞（APCs）后续摄取的关键因素之一。12,13此外，通过测量施加电流时颗粒的移动速度，可获得zeta电位，从而确定颗粒的电泳迁移率及颗粒表面电荷。11确保颗粒的Zeta电位值一致非常重要，因为颗粒表面电荷决定了胶体稳定性，这直接影响颗粒在储存期间及储存后的分散性。 体内 给药14,15为了追踪颗粒在引流淋巴结（dLNs）中的定位，可使用所需的荧光染料对ICMVs进行标记，包括脂溶性染料和共价标记的抗原。免疫后，可在不同时间点处死小鼠，切除dLNs，进行冷冻切片，并通过共聚焦显微镜分析。该技术可实现对纳米颗粒疫苗载体及抗原向dLNs淋巴引流过程的可视化观察。此外，组织切片还可使用荧光标记的抗体染色，以获取更多相关信息，例如与抗原相关的细胞类型以及生发中心的形成情况，正如我们先前研究所示。7.
一旦粒子合成得到优化并确认其向dLNs的转运后，验证其诱导免疫应答的能力至关重要。 体内 CTL 扩增。为了分析纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性 CD8+ T 细胞的诱导情况，我们采用了一种模型抗原——卵清蛋白（OVA），以 OVA257-264 肽（SIINFEKL）免疫优势CD8+ T细胞表位，可用于初始疫苗开发中抗原特异性T细胞反应的详细免疫学分析16,17特别是为了研究抗原特异性CD8+ T细胞扩增与迁移的动力学，我们通过将表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠（Luc）与OT-I转基因小鼠杂交，构建了一种双转基因小鼠模型。OT-I小鼠拥有T细胞受体（TCR）特异性识别SIINFEKL抗原肽（与H-2Kb分子结合）的CD8+ T细胞。b）。从这些OT-I/Luc小鼠中可分离出表达荧光素酶的OT-I CD8+ T细胞，并制备用于过继转移至未致敏的C57BL/6小鼠。接种后，若使用含OVA的纳米颗粒成功免疫，将导致转移的T细胞扩增，可通过活体动物成像系统监测生物发光信号来追踪该过程。9,10该非侵入性全身成像技术此前已与其他病毒或肿瘤抗原联合使用18-20，以纵向揭示T细胞在淋巴组织中扩增及其向外周组织扩散的过程。
除了分析过继转移的抗原特异性CD8+ T细胞外，还可通过肽-主要组织相容性复合体（MHC）四聚体检测21来评估疫苗接种后的内源性T细胞应答。该检测利用由四个携带荧光标记的MHC-I类分子组成的肽-MHC四聚体复合物，每个分子均负载有肽表位，可特异性结合T细胞受体（TCR），从而以抗原特异性方式标记CD8+ T细胞。肽-MHC四聚体检测可用于终末解剖研究，以鉴定淋巴组织及外周组织中的抗原特异性CD8+ T细胞；也可用于纵向研究，通过系列采血获得的外周血单个核细胞（PBMCs）进行检测。在使用肽-MHC四聚体对淋巴细胞进行染色后，通过流式细胞术分析，可进一步详细表征细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的表型，或定量其在CD8+ T细胞中所占比例。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. 共载蛋白抗原与佐剂分子的ICMV合成与表征&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷酸乙醇胺-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[4-(&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-马来酰亚胺苯基)丁酰胺]（钠盐）（MPB）</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>870012</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>单磷酸脂质A（合成）（PHAD&amp;trade;）（MPLA）</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 玻璃小瓶</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny 真空干燥箱</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白（OVA）</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>双-Tris丙烷（BTP）</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 超声波破碎仪（125&amp;nbsp;W/20&amp;nbsp;kHz）</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa 巯基化聚乙二醇（PEG-SH）</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&amp;nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer 比色皿</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. 利用共聚焦显微镜检测荧光标记ICMV的淋巴结引流&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青-4-氯苯磺酸盐（DID）</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-琥珀酰亚胺酯（AF555-NHS）</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT冷冻包埋介质&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>组织冷冻模具</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. 通过整体动物成像监测纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性、表达荧光素酶的CD8+ T细胞扩增&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>C57BL/6小鼠</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>白化C57BL/6小鼠</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6小鼠</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 尼龙滤网</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&amp;trade; 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;reg; 整体动物成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. 外周血单个核细胞（PBMCs）的肽-MHC四聚体染色用于抗原特异性CD8+ T细胞的流式细胞分析&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA管</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗CD16/32 Fc阻断剂</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt; OVA四聚体</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>抗CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>抗CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>抗CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo软件</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性cd8+ t细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

传统的疫苗佐剂（如铝盐）诱导的 CD8+ T 细胞反应较弱。为应对疫苗研发中的这一主要挑战，研究人员已设计出多种纳米颗粒系统，通过模拟病原体的特性，以改善抗原向引流淋巴结的递送，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取，从而开发出更有利于诱导抗原特异性 CD8+ T 细胞反应的新型疫苗制剂。本文中，我们描述了一种被称为“病原体模拟”纳米颗粒系统的合成方法，即层间交联多层囊泡（ICMVs），该系统可作为有效的疫苗载体，用于共递送亚单位抗原和免疫刺激剂，并有效激发强烈的细胞毒性 CD8+ T 淋巴细胞（CTL）反应。我们介绍了利用动态光散射和泽塔电位分析仪对疫苗纳米颗粒的流体动力学尺寸和表面电荷进行表征的方法，并提供了一种基于共聚焦显微镜的实验流程，用于分析纳米颗粒介导的抗原向引流淋巴结的递送情况。此外，我们展示了一种新的活体生物发光成像技术，该技术通过将表达荧光素酶的抗原特异性 CD8+ T 细胞过继转移至受体小鼠，随后进行纳米颗粒疫苗接种，从而实现对 CTL 扩增和迁移模式的无创、实时监测。我们还描述了四聚体染色及外周血单个核细胞的流式细胞术分析方法，用于对接受纳米颗粒疫苗接种的小鼠体内内源性 T 细胞反应进行长期定量评估。

ICMV 的合成步骤如图16所示。简而言之，在亲水性药物存在下，对含有任何亲脂性药物或荧光染料的脂质膜进行水化。加入二价阳离子（如 Ca2+），促使带负电荷的脂质体融合形成多层囊泡。加入二硫醇交联剂（如 DTT），使相邻脂质层上的马来酰亚胺功能化脂质“交联固定”，最后通过与巯基化 PEG 结构的反应淬灭残留的外部马来酰亚胺基团。每批样品可取少量直接用于质量控制检测，使用动态光散射（DLS）和zeta电位分析系统测定粒径、多分散系数和zeta电位。所得颗粒相对均一，包载卵清蛋白（OVA）的颗粒平均粒径为 130 ± 20 nm，多分散系数为 0.22 ± 0.02，zeta电位为 -54 ± 3 mV（图1B 和 1C）。以颗粒干重计，典型产率约为 50%6。
利用上述方案，可将荧光标记的蛋白抗原和荧光脂溶性染料共同装载到ICMVs中，从而实现抗原和纳米颗粒在体内的递送过程可视化。in vivo。为比较可溶性抗原与ICMVs中抗原递送...

我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+ T细胞扩增的方法。

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

传统疫苗佐剂（如铝佐剂）诱导的CD8+ T细胞应答较弱。为应对疫苗研发中的这一主要挑战，研究人员已开发出多种...

以下实验的总体目标是合成并表征基于脂质的疫苗纳米颗粒，并评估其在体内诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞扩增的能力。通过构建模拟病原体的、具有交联多层结构的双层间囊泡（ICMVs），共同负载抗原与佐剂，用于对未致敏小鼠进行免疫接种，从而实现该目标。实验中采用过继转移表达荧光素酶的抗原特异性CD8阳性T细胞。在第二步中，通过整体动物活体成像评估抗原特异性CD8阳性T细胞的扩增情况。从ICMV免疫动物中分离外周血单个核细胞，然后用荧光标记的四聚体染色，并通过流式细胞术分析，以定量系统循环 compartment 中内源性抗原特异性CD8阳性T细胞的频率。最终，可利用生物发光成像追踪抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞在纳米颗粒疫苗刺激下的扩增过程。这些方法有助于回答疫苗设计中的关键初步问题，例如细胞毒性T淋巴细胞扩增的程度如何，以及这些细胞在纳米颗粒疫苗接种后如何迁移至不同组织？与现有方法（如组织尸检后的原位T细胞分析）相比，该技术的主要优势在于对T细胞反应进行活体成像具有非侵入性，可实现对同一只动物的长期纵向监测。首先，在20毫升玻璃小瓶中，将DOPC与MPB以1:1的摩尔比在氯仿中混合，每批维持总脂质含量为1.26 µmol。接下来，将脂溶性货物以目标浓度加入脂质溶液中，并用额外的干燥氮气吹扫溶液，以彻底去除有机溶剂。将样品置于真空环境中过夜，次日早晨加入200微升含有目标水溶性货物的10毫摩尔BTP溶液，以水合脂质膜，在室温下每10分钟涡旋振荡10秒，持续1小时。然后将内容物转移至1.5毫升微量离心管中。接下来，将试管置于冰水浴中，使用125瓦、20千赫探头超声仪，在40%强度下持续进行超声处理。五分钟后，向试管中加入4微升150毫摩尔的DTT，涡旋混匀，然后在微量离心机中离心收集样品。随后，将40微升200毫摩尔的氯化钙加入样品中，接着在37摄氏度下用DTT交联含有MPB的脂质层，反应一小时。孵育结束后，将溶液离心三次，在第二次和第三次离心时每次加入200 µL双蒸水，以去除上清液中残留的氯化钙、未反应的DTT以及未包封的货物材料。最后一次离心后，将ICMVs悬浮于100 µL新鲜配制的pegol中，在37°C下孵育30分钟，随后再用双蒸水洗涤囊泡两次。用PBS重悬最终沉淀，并将ICM VS在4摄氏度下保存。为表征颗粒，先将冷藏的ICMV悬液混匀，然后取少量样品稀释至总体积为1毫升的双蒸水中。随后将ICMVs放入zeta电位仪样品池中，按照制造商说明书，使用动态光散射及zeta电位测量系统测定样品的粒径、多分散指数及zeta电位。为了分离卵清蛋白特异性的表达荧光素酶的 CD8 阳性 T 细胞，首先从 OT-I 荧光素酶转基因小鼠中取出脾脏。将组织置于 5 毫升冰上预冷的 PBS 缓冲液（含 2% FBS）中，然后转移至组织培养超净台内。使用一支3毫升注射器的推杆，通过70微米细胞筛，将最多三个脾脏同时研磨至15毫升锥形管中。用PBS和2%FBS冲洗推杆和细胞筛。然后将细胞悬液的总体积调至每只脾脏10毫升。确定总细胞数量，然后离心收集细胞。接下来，使用 commercially available 的磁性阴性筛选试剂盒，按照生产商说明书分离 CD eight 阳性的脾细胞。随后用 PBS 洗涤 T 细胞。计数后，将2×10⁵至3×10⁵个细胞与20 µL小鼠CD16/32封闭抗体在4°C孵育10分钟；随后加入20 µL抗CD8a APC抗体，继续孵育30分钟，通过流式细胞术检测磁珠分选获得的CD8阳性T细胞群体的纯度。接下来，将1×10⁵至10×10⁵个OT-I luciferase标记的CD8阳性T细胞溶于200 µL PBS中，通过尾静脉注射过继转移至未经处理的脱毛白化C57BL/6小鼠体内。接种疫苗后，在相应的时间点进行后续实验操作。注射后10分钟，以每千克150毫克的剂量向动物注射Lucifer，使用活体成像系统采集5至10分钟的生物发光信号，以观察OT-I Lucifer CD8阳性T细胞，从而在适当时间点确定抗原特异性CD8阳性T细胞的数量。疫苗接种后，采用下颌下出血法从接种小鼠采集约100微升血液至含有钾EDTA抗凝剂的采血管中，轻轻倒置管子数次以防止凝血。随后将100微升血液转移至微量离心管中，并加入1毫升CK裂解缓冲液。两到三分钟后，离心细胞并弃去上清液。用一毫升 Fax 缓冲液重悬剩余的 PBMC，并按照前述方法使用 CD16/32 封闭非特异性结合。10 分钟后，将细胞悬液分装至四个毫升圆底 Fax 管中，并根据制造商说明书，向每个样本加入 20 微升 H2-Kb/OVA 四聚体-PE 溶液。冰浴30分钟后，向每个实验样本中加入20微升相应的抗体混合物，并向每个对照样本中加入针对每种荧光四聚体标签或抗体的单荧光四聚体对照抗体。最后，再经过20分钟孵育后，用FACS缓冲液洗涤所有样本，将沉淀重悬于添加了DPI的FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。CMV载体共同负载了荧光四聚体蛋白抗原和荧光脂溶性染料，可实现体内抗原和纳米颗粒递送过程的可视化。例如，共聚焦显微镜成像显示，皮下注射于尾根部的可溶性抗原在给药后4小时内即可到达引流淋巴结，并在24小时内被清除。相比之下，过载型 I 型 CMV 在给药后 24 小时即可首次在引流淋巴结的边缘区域被检测到，并持续积累，最终在引流淋巴组织内形成大量 OVA I 型 CMV 沉积。到第 4 天时，对在免疫当天过继转移了 OT-I Luciferase CD8 阳性 T 细胞的 C57BL/6 小鼠进行生物发光成像，结果显示，免疫后第 4 天 OT-I Luciferase T 细胞的基础信号水平极低。然而，用 OVA MPI CMV 免疫的小鼠在引流腹股沟淋巴结中表现出强烈的生物发光信号。另一方面，接种可溶性卵清蛋白的小鼠在引流淋巴结中OT-I Luciferase CD8阳性T细胞的扩增显著减少。此外，仅接种可溶性卵清蛋白和MPLA但未过继转移抗原特异性T细胞的小鼠，并未表现出明显的卵清蛋白特异性CD8阳性T细胞扩增，这一点通过每周对外周血单个核细胞（PBMC）的监测得以证实。然而，ICMV疫苗接种则诱导出更强且内源性的CD8阳性T细胞应答，在第41天时，PBMC中CD8阳性T细胞群体内四聚体阳性T细胞的比例达到峰值，占28%。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成基于脂质的纳米颗粒、实施免疫接种，以及在体内对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的扩增进行可视化与定量分析。这些方法可进一步改进，以揭示关于CTL应答的更多信息。例如，可在teer染色实验中加入CD127、BCL2和KLRG1等额外标记，以评估细胞的记忆表型。

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对于纳米颗粒疫苗接种后的分析抗原特异性CD8 + T细胞应答整体动物成像和流式细胞技术

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利用多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒与细菌的细胞内化作用

本视频介绍了一种利用磁性纳米颗粒为基础的磁性人工抗原提呈细胞（aAPCs）分离稀有抗原特异性CD8+ T细胞的实验方案，该aAPCs经抗原肽负载的MHC-Ig复合物及抗CD28抗体功能化修饰。aAPCs可特异性结合表达靶向该抗原肽的T细胞受体的CD8+ T细胞，并实现其后续扩增 体外，导致该 CD8+ T...

基于纳米颗粒的抗原特异性CD8+ T细胞富集与扩增

本视频展示了一种用于分析处于不同细胞周期阶段的抗原特异性CD8+...

一种用于抗原特异性CD8+ T细胞细胞周期分析的检测方法

该视频展示了一种用于监测免疫反应的方法 体内 佐剂诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）产生。预先向小鼠注射经基因工程改造、增殖染料标记的供体CD8+ T淋巴细胞。皮下注射含佐剂的卵清蛋白可诱导产生细胞毒性CD8+...

一种监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞生成的免疫学技术

通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。...

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

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纳米抗体与抗体验证 在体 小鼠肿瘤异种移植NIRF成像实验 离体 流式细胞术与显微镜检查

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。...

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

由于抗原特异性T细胞频率极低，因此难以对其进行表征或用于治疗。本文中，我们提供了一种磁性微粒的制备方案，该微粒可结合抗原特异性T细胞，用于富集这些细胞，并将其扩增数百倍，从而用于后续的表征与治疗应用。...

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

本文介绍了一种用于体外定性检测抗原特异性CD8+...

通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

克隆扩增是抗原特异性T细胞反应的关键特征。然而，对抗原应答T细胞的细胞周期研究较少，部分原因是技术上的限制。本文介绍了一种流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结中发生克隆扩增的抗原特异性CD8...

基于DNA/Ki67的流式细胞术检测法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

学习利用脂质纳米颗粒疫苗在小鼠模型中诱导抗原特异性CD8+T细胞扩增的方法。通过整体动物成像和流式细胞术技术，研究人员可实时追踪T细胞动态并精确定量细胞群体，为疫苗开发提供重要的非侵入性评估手段。

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

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