纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

以下实验的总体目标是合成并表征基于脂质的疫苗纳米颗粒，并评估其在体内诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞扩增的能力。通过构建模拟病原体的、具有交联多层结构的双层间囊泡（ICMVs），共同负载抗原与佐剂，用于对未致敏小鼠进行免疫接种，从而实现该目标。实验中采用过继转移表达荧光素酶的抗原特异性CD8阳性T细胞。

在第二步中，通过整体动物活体成像评估抗原特异性CD8阳性T细胞的扩增情况。从ICMV免疫动物中分离外周血单个核细胞，然后用荧光标记的四聚体染色，并通过流式细胞术分析，以定量系统循环 compartment 中内源性抗原特异性CD8阳性T细胞的频率。最终，可利用生物发光成像追踪抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞在纳米颗粒疫苗刺激下的扩增过程。

这些方法有助于回答疫苗设计中的关键初步问题，例如细胞毒性T淋巴细胞扩增的程度如何，以及这些细胞在纳米颗粒疫苗接种后如何迁移至不同组织？与现有方法（如组织尸检后的原位T细胞分析）相比，该技术的主要优势在于对T细胞反应进行活体成像具有非侵入性，可实现对同一只动物的长期纵向监测。首先，在20毫升玻璃小瓶中，将DOPC与MPB以1:1的摩尔比在氯仿中混合，每批维持总脂质含量为1.26 µmol。

接下来，将脂溶性货物以目标浓度加入脂质溶液中，并用额外的干燥氮气吹扫溶液，以彻底去除有机溶剂。将样品置于真空环境中过夜，次日早晨加入200微升含有目标水溶性货物的10毫摩尔BTP溶液，以水合脂质膜，在室温下每10分钟涡旋振荡10秒，持续1小时。然后将内容物转移至1.5毫升微量离心管中。

接下来，将试管置于冰水浴中，使用125瓦、20千赫探头超声仪，在40%强度下持续进行超声处理。五分钟后，向试管中加入4微升150毫摩尔的DTT，涡旋混匀，然后在微量离心机中离心收集样品。随后，将40微升200毫摩尔的氯化钙加入样品中，接着在37摄氏度下用DTT交联含有MPB的脂质层，反应一小时。

孵育结束后，将溶液离心三次，在第二次和第三次离心时每次加入200 µL双蒸水，以去除上清液中残留的氯化钙、未反应的DTT以及未包封的货物材料。最后一次离心后，将ICMVs悬浮于100 µL新鲜配制的pegol中，在37°C下孵育30分钟，随后再用双蒸水洗涤囊泡两次。

用PBS重悬最终沉淀，并将ICM VS在4摄氏度下保存。为表征颗粒，先将冷藏的ICMV悬液混匀，然后取少量样品稀释至总体积为1毫升的双蒸水中。随后将ICMVs放入zeta电位仪样品池中，按照制造商说明书，使用动态光散射及zeta电位测量系统测定样品的粒径、多分散指数及zeta电位。

为了分离卵清蛋白特异性的表达荧光素酶的 CD8 阳性 T 细胞，首先从 OT-I 荧光素酶转基因小鼠中取出脾脏。将组织置于 5 毫升冰上预冷的 PBS 缓冲液（含 2% FBS）中，然后转移至组织培养超净台内。

使用一支3毫升注射器的推杆，通过70微米细胞筛，将最多三个脾脏同时研磨至15毫升锥形管中。用PBS和2%FBS冲洗推杆和细胞筛。然后将细胞悬液的总体积调至每只脾脏10毫升。

确定总细胞数量，然后离心收集细胞。接下来，使用 commercially available 的磁性阴性筛选试剂盒，按照生产商说明书分离 CD eight 阳性的脾细胞。随后用 PBS 洗涤 T 细胞。

计数后，将2×10⁵至3×10⁵个细胞与20 µL小鼠CD16/32封闭抗体在4°C孵育10分钟；随后加入20 µL抗CD8a APC抗体，继续孵育30分钟，通过流式细胞术检测磁珠分选获得的CD8阳性T细胞群体的纯度。接下来，将1×10⁵至10×10⁵个OT-I luciferase标记的CD8阳性T细胞溶于200 µL PBS中，通过尾静脉注射过继转移至未经处理的脱毛白化C57BL/6小鼠体内。接种疫苗后，在相应的时间点进行后续实验操作。

注射后10分钟，以每千克150毫克的剂量向动物注射Lucifer，使用活体成像系统采集5至10分钟的生物发光信号，以观察OT-I Lucifer CD8阳性T细胞，从而在适当时间点确定抗原特异性CD8阳性T细胞的数量。疫苗接种后，采用下颌下出血法从接种小鼠采集约100微升血液至含有钾EDTA抗凝剂的采血管中，轻轻倒置管子数次以防止凝血。随后将100微升血液转移至微量离心管中，并加入1毫升CK裂解缓冲液。

两到三分钟后，离心细胞并弃去上清液。用一毫升 Fax 缓冲液重悬剩余的 PBMC，并按照前述方法使用 CD16/32 封闭非特异性结合。10 分钟后，将细胞悬液分装至四个毫升圆底 Fax 管中，并根据制造商说明书，向每个样本加入 20 微升 H2-Kb/OVA 四聚体-PE 溶液。

冰浴30分钟后，向每个实验样本中加入20微升相应的抗体混合物，并向每个对照样本中加入针对每种荧光四聚体标签或抗体的单荧光四聚体对照抗体。最后，再经过20分钟孵育后，用FACS缓冲液洗涤所有样本，将沉淀重悬于添加了DPI的FACS缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。CMV载体共同负载了荧光四聚体蛋白抗原和荧光脂溶性染料，可实现体内抗原和纳米颗粒递送过程的可视化。例如，共聚焦显微镜成像显示，皮下注射于尾根部的可溶性抗原在给药后4小时内即可到达引流淋巴结，并在24小时内被清除。

相比之下，过载型 I 型 CMV 在给药后 24 小时即可首次在引流淋巴结的边缘区域被检测到，并持续积累，最终在引流淋巴组织内形成大量 OVA I 型 CMV 沉积。到第 4 天时，对在免疫当天过继转移了 OT-I Luciferase CD8 阳性 T 细胞的 C57BL/6 小鼠进行生物发光成像，结果显示，免疫后第 4 天 OT-I Luciferase T 细胞的基础信号水平极低。然而，用 OVA MPI CMV 免疫的小鼠在引流腹股沟淋巴结中表现出强烈的生物发光信号。

另一方面，接种可溶性卵清蛋白的小鼠在引流淋巴结中OT-I Luciferase CD8阳性T细胞的扩增显著减少。此外，仅接种可溶性卵清蛋白和MPLA但未过继转移抗原特异性T细胞的小鼠，并未表现出明显的卵清蛋白特异性CD8阳性T细胞扩增，这一点通过每周对外周血单个核细胞（PBMC）的监测得以证实。然而，ICMV疫苗接种则诱导出更强且内源性的CD8阳性T细胞应答，在第41天时，PBMC中CD8阳性T细胞群体内四聚体阳性T细胞的比例达到峰值，占28%。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成基于脂质的纳米颗粒、实施免疫接种，以及在体内对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的扩增进行可视化与定量分析。

这些方法可进一步改进，以揭示关于CTL应答的更多信息。例如，可在teer染色实验中加入CD127、BCL2和KLRG1等额外标记，以评估细胞的记忆表型。