Name: 功能人类肝脏保存和恢复由Subnormothermic机灌注手段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 了解亚常温机械灌注技术用于人体肝脏保存与功能恢复的方法。该技术在21°C下进行灌注，使肝脏保持代谢活性并产生胆汁，便于评估器官活力，为移植前肝脏质量评价提供可靠手段。

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感谢美国国立卫生研究院（资助号 R01EB008678、R01DK096075、R01DK084053、R00DK088962 和 F32 DK103500）、CIMIT 项目编号 12-1732 以及 Shriners 儿童医院提供的经费支持。我们衷心&#160;感谢新英格兰器官库对本工作的支持。

使用人体组织必须经过机构审查委员会（IRB）或同等机构的审查。本研究所描述的工作已获得麻省总医院机构审查委员会批准并被认定为豁免（编号：2011P001496）。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>按照表1所述，无菌条件下向不含酚红的Williams’ E培养基中添加补充剂。该溶液应在使用前新鲜配制，胰岛素应在使用前加入。</li>
</ol>
2. 肝脏的背桌准备
<ol>
	<li>将装有冰块的器官盘置于无菌铺巾的台面上。从包装箱中取出肝脏，保持其处于冷保存液袋中，并使其大部分浸没在液体中。</li>
	<li>辨认肝动脉（HA），其位置位于主动脉补片远端。使用梅岑鲍姆剪刀游离该动脉，暴露沿其长度分布的各个分支。仔细解剖动脉全长，避免切断供应肝脏的血管。对于未见明显断端的分支，不要切断或结扎。</li>
	<li>使用0至4–0号丝线结扎所有不供应肝脏的动脉分支。对于过短无法结扎的分支或动脉上的破口，使用7–0聚丙烯缝线缝合关闭。在腹腔干起始处附近结扎并切断脾动脉和左胃动脉。</li>
	<li>通过在补片正下方切断腹腔干来移除主动脉补片。使用主动脉插管插入股腹腔干。</li>
	<li>辨认门静脉（PV），并钝性游离。结扎任何分支，并使用已准备好的24号导管片段对门静脉进行插管。</li>
	<li>从肝上腔静脉处去除膈肌组织，注意不要切割静脉本身。腔静脉的流出液直接排入器官腔室。</li>
	<li>从胆总管末端切取两段全周组织样本（每段长2–3 mm）；其中一份立即置于液氮中速冻（储存于-80 °C），另一份保存于10%缓冲福尔马林溶液中，分别用于组织学和组织病理学分析。使用血管插管及由膜式氧合器导管制成的引流管对胆总管进行插管。</li>
	<li>辨认胆囊管并用0号丝线结扎。胆囊管位于胆总管与胆囊之间。</li>
	<li>将冲洗管路套装连接至装有冰冻乳酸林格液（LR）的输液袋，并预充管路，彻底排除空气。</li>
	<li>将冲洗管路上的流量调节器调至缓慢滴注状态。在将冲洗管路连接至门静脉插管前，用手指在肝门处暂时阻断门静脉，并用冲洗液充满插管和静脉，以排除门静脉内的空气。冷冲洗过程中，输液袋高度不得超过肝脏水平20 cm，以防对静脉造成过高压力。</li>
	<li>冲洗过程中短暂阻断门静脉最低点，检查是否存在渗漏。如有血管分支渗漏，可按前述方法予以封闭。通过门静脉以总共2 L&#160;的冰冻LR溶液冲洗肝脏。</li>
	<li>对肝动脉（HA）重复步骤&#160;2.10&#160;和2.11，使用1 L&#160;LR溶液进行冲洗。</li>
</ol>
3. 启动 SNMP 系统
<ol>
	<li>通过加入2 L对灌注装置进行预处理&#160;灌流液（21&#176;C）向器官灌注槽中加入液体并启动设备以预冲管路。按照设备说明书进行灌注前准备，将温度设置为21 &#176;C. 首先将门静脉（PV）和肝动脉（HA）的压力分别设置为3 mmHg和30 mmHg。打开气体罐，调节气体流速至3 L/min。</li>
	<li>从HA和PV流入端的采样口各抽取0.3 ml血液，按照制造商说明书在血气分析仪中进行血气检测。确认氧合充分（pO₂）2 &#62;700 mmHg）和 pH（7.35–7.45）。</li>
	<li>在连接肝脏之前，取1.0 ml灌注液作为t=0时间点的样本，置于离心管中，并于-80℃保存。 &#176;C. 剪切两条 &#177; 使用单刃钢刀从肝脏获取250 mg楔形活检组织；取其中一份在液氮中速冻（于–80℃保存） &#176;C）并将另一份组织置于10%中性缓冲福尔马林中保存。灌注前称量肝脏重量。</li>
</ol>
4. 人肝脏灌注
<ol>
	<li>将肝脏转移至装置中。在门静脉（PV）灌注管路中排除空气（如步骤2.10所述）后，将PV流入端连接至PV插管。以类似方式连接肝动脉（HA）。将PV和HA的压力分别设定为3 mmHg和30 mmHg。肝脏应几乎完全浸没在灌注液中。使用湿润的无菌纱布覆盖任何干燥表面，包括流入血管，以防止脱水。</li>
	<li>使胆汁导管流入收集容器中。确保胆汁引流口的位置与肝脏水平持平或更低，以利于胆汁自由流出。</li>
	<li>当肝脏温度升至21 °C后，门静脉（PV）和肝动脉（HA）的目标流量应分别达到275–325 ml/min·kg和50–100 ml/min·kg。由于每例肝脏对灌注的反应不同，需在灌注初期密切监测流量。若未达到目标流量，可适当调节任一血管的压力，但HA压力不得超过50 mmHg，PV压力不得超过5 mmHg。</li>
	<li>可根据研究者需求从肝组织、灌注液和胆汁中采集样本。我们建议在灌注期间至少遵循以下样本采集方案：
	<ol>
		<li>组织活检，每次采集2份，每份250 mg，每小时一次。保存方式：其中一份立即在液氮中速冻，并长期保存于–80 °C；另外，在灌注前后各采集一份活检样本，用10%缓冲福尔马林固定（n = 1）。</li>
		<li>灌注液样本，每次采集2份，每份1 ml，在灌注第1小时内每15分钟&#160;采集一次，之后每30分钟&#160;采集一次。从PV流入端的取样口抽取样本。保存方式：长期保存于–80 °C。</li>
		<li>门静脉（PV）和肝动脉（HA）流入端以及下腔静脉流出端的血气分析。每次采集3份，每份0.3 ml，每30分钟一次。从PV和HA的取样口分别取样。通过将注射器插入下腔静脉直接采集0.3 ml血液样本，并立即送入血气分析仪检测。利用检测结果评估氧合状态和pH值是否适宜。</li>
		<li>胆汁产量测定，每次采集1份，每份1 ml，每小时一次。每小时目测评估胆汁产量，并从收集容器中取样。取样后更换新的收集容器。保存方式：先置于干冰中，再长期保存于–80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>持续灌注3小时，期间持续监测压力、pH值和氧合状态，并按计划采集样本。通过向灌注液中添加碳酸氢钠调节pH值。</li>
	<li>灌注结束时，在肝脏仍处于灌注状态下采集最终样本。断开肝脏连接，并移除胆管插管。按照前述方法采集2份灌注后胆管组织样本，分别保存于–80 °C和10%缓冲福尔马林中。</li>
	<li>按照生物危害物处理规范妥善丢弃人肝脏组织。</li>
</ol>

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</ol>

BE Uygun博士、K Uygun博士和Yarmush博士是与本研究相关的一项待审专利（WO/2011/002926）的发明人，BE Uygun博士、K Uygun博士和Yarmush博士也是与本研究相关的一项待审专利（WO/2011/35223）的发明人。K Uygun博士和Bruinsma博士拥有一项与本工作相关的临时专利申请。K Uygun博士和BE Uygun博士在Organ Solutions公司拥有财务利益，该公司致力于开发器官保存技术。K Uygun博士和BE Uygun博士的利益由麻省总医院（MGH）和Partners HealthCare根据其利益冲突政策进行管理。

为了恢复缺血期间受损的肝脏，我们开发了一种可在冷保存后使用的亚常温机械灌注（SNMP）系统。亚常温机械灌注为传统的冷保存以及低温和常温机械灌注模式提供了一种可行的替代方案。目前存在多种不同的系统，各有优缺点3,9,20。SNMP允许在无氧载体的情况下进行灌注，因为在21 °C时，灌注液的主动氧合即可满足代谢所需的氧气。
尽管在亚常温条件下代谢活动有所降低，但仍较为显著，需要富含营养的灌注液来支持。传统的灌注液（如Belzer机器灌注液）成分通常较为简单，专为低温灌注设计。Williams’ Medium E 已作为肝细胞培养基使用多年，含有支持细胞功能所需的通用组分，尤其适用于温暖的ex vivo环境。
机器灌注期间的测量结果可反映器官功能。胆汁生成和氧摄取等可直接观察的参数属于实时测量指标，可用于评估移植前肝脏的功能状态。同样，细胞损伤和缺血的标志物（如K+、乳酸释放）也可在灌注液中直接测定，可能提示器官功能情况。 20随着机器灌注技术的进一步发展及其在临床中的更广泛应用，准确建立以下各项之间的相关性 离体 功能与临床结果之间的关联将得以建立，灌注参数将在移植或弃用边缘质量肝脏的决策中发挥重要作用。此外，随着床旁分析工具的进步，在机械灌注过程中将可直接获得更为复杂的分析数据 21.
在本研究中，我们证明肝脏可在 SNMP 系统中得到支持，且肝脏损伤极小，这通过组织学检查和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的释放水平得以反映。肝脏功能的恢复情况最佳反映指标为三磷酸腺苷（ATP），其水平已被证实与肝脏活力相关，并在动物模型中强烈提示移植成功的可能性。 22. 离体 移植前肝脏移植物的保护与功能恢复将显著扩大供体肝脏库，缓解移植中供体肝脏供需之间的不平衡。

肝移植是数万名终末期肝病患者唯一的治愈性治疗手段。为了确保移植成功，从供体获取肝脏到受体植入期间，必须对肝脏进行最佳保存，以防止移植物迅速恶化。目前肝脏保存的标准方法称为“静态冷保存”：将肝脏置于冰冻保存液中进行降温，从而降低肝脏代谢，减缓缺血带来的有害影响。尽管这种冷保存技术已实现成功的移植，但质量边缘的器官，如因热缺血或脂肪变性受损的DCD器官，其患者的预后较差 1.&#160; 有越来越多的证据表明 离体 将机械灌注作为肝脏移植物的替代保存方式，有望改善这些边缘性器官的移植预后 2,3.
肝移植已成为其自身成功的一个牺牲品。需要进行移植的患者数量远远超过可用肝脏的数量，每年在美国都有数千名患者在等待名单上死亡。鉴于供体肝脏短缺的现实以及越来越多地使用质量次优的肝脏移植物来满足急需患者的现状，人们普遍认为，在移植前对肝脏移植物进行ex vivo机械灌注有望带来肝移植领域的范式转变。近年来，这一课题的研究兴趣显著增加4-8。在欧洲和北美多个医疗中心，低温机械灌注已进入临床应用8，而生理温度下的常温机械灌注也已应用于原本被废弃的人体肝脏，并正在向临床应用转化9。经过广泛的发展，已建立了多种灌注方案，同时通过持续优化不断确定最佳灌注参数10-12。在过去十年中，边缘质量移植物的使用增加了十倍以上13。与当前肝脏保存的标准方法（静态冷保存）相比，ex vivo机械灌注具有诸多潜在优势，这些优势均可显著扩大可用器官池，并可能降低移植后并发症的发生率。特别是目前在移植后影响次优质量肝脏移植物的胆道并发症，仍然是一个重大问题14-18。
亚常温机械灌注为客观评估移植物功能及其是否适合移植提供了时间窗口 19肝脏灌注的同时 离体 电路中，灌注液以及灌注期间产生的胆汁均可取样，用于检测器官功能的标志物。通过这种方式，可根据其移植适用性，对当前标准下因“严重受损”而被弃用的肝脏进行客观评估。活力评估有望使其中许多器官得以用于移植。机械灌注另一重要优势在于可修复并改善因热/冷缺血而受损的肝脏。在热缺血及随后的冷缺血过程中，三磷酸腺苷（ATP）会迅速耗竭，而通过移植前的一段机械灌注期可使其得到重新补充。 20肝脏在能量储备和代谢状态得到恢复后，已处于预处理状态，从而在移植给受体后更能耐受再灌注损伤的有害影响。
本研究介绍了一种在实验室中对人肝移植物进行离体机械灌注的方法，该方法对于希望研究离体机械灌注技术及其有益作用的研究人员具有重要价值。我们使用的是因不符合移植标准而被弃用、随后被分配用于科研的人体供体肝脏。
标准肝脏获取技术包括在脑死亡供体（DBD）中进行主动脉阻断后，或在心脏死亡供体（DCD）发生循环停止后，对肝脏实施原位动脉灌注冲洗，具体操作细节 elsewhere 有更详细描述20。此外，在获取过程中通过向供体腹腔内填充冰屑来冷却肝脏。不同地区所选用的灌注液有所不同，大多数获取手术采用威斯康星大学液（University of Wisconsin）或组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液（HTK）。在修肝台阶段额外对门静脉进行灌注冲洗，有助于更彻底清除残留血液。通常在获取肝脏时会保留围绕腹腔干的一段主动脉。胆囊被切开，吸除胆汁，并对胆管进行冲洗。肝脏随后被装入含有冰冻保存液的无菌袋中，置于指定的运输箱或冷藏容器内运送。为获得代表性结果，热缺血时间和冷缺血时间应分别限制在60分钟和12小时以内。尽管已常规对可传播病原体进行血清学筛查，但在处理人体器官、从人体器官获取的样本以及任何废弃物时，仍必须采取标准防护措施。
本方案描述了使用一种 commercially available 肝脏灌注装置进行亚常温机械灌注的方法。使用此类装置有助于更快速地将技术转化为临床应用，并可在不同研究团队和移植中心之间对各种方案及设备参数进行交叉验证。

<table><tbody><tr><td>肝脏辅助灌注装置</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>肝脏辅助</td><td></td></tr><tr><td>肝脏辅助一次性套装</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>肝脏辅助一次性用品</td><td></td></tr><tr><td>Williams&amp;rsquo; E 培养基</td><td>Sigma</td><td>W1878&amp;ndash;6×500毫升</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Eli Lilly &amp;amp; Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>MGH 药房</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>95% O₂的碳合气体气罐&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>特种气体减压阀</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格液&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>带齿 Adson 镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey 组织镊，7.75&amp;rdquo;，2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀 7&quot; 弯曲型SureCut钨丝</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo持针器 5.5&amp;ndash;7&amp;rdquo;</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0号黑色编织丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 尼龙缝线，Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>血气分析仪</td><td>西门子</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>压力显示盒</td><td>美敦力</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>一次性压力显示装置</td><td>美敦力</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>手持式热电偶温度计及探头</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 和 EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>橡实尖端血管导管，4 毫米</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>灌注套装 冲洗管路</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>4 L 混合碗</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

通过亚常温机械灌注实现人肝脏功能的保存与恢复

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

目前可用于移植的肝脏供体严重短缺。需要开发新型器官保存技术，以扩大供肝来源。机器灌注供体肝脏是传统肝脏冷保存的一种替代方法，在扩大供体器官池方面具有广阔前景。我们近期已阐述了亚常温机器灌注人肝脏的潜在益处。经机器灌注的肝脏显示出功能改善及组织三磷酸腺苷（ATP）水平的恢复。此外，在亚常温条件下对供肝进行机器灌注，可对肝脏的功能状态和移植适用性进行客观评估。通过机器灌注的修复作用，许多因质量欠佳而原本被废弃的肝脏得以挽救并用于移植。本文中，我们将详细描述亚常温机器灌注技术。用于研究的人体肝脏供体通过肝动脉和门静脉灌注无细胞含氧灌注液，灌注温度为 21 °C。

在肝脏灌注过程中，可进行多种观察和分析，包括直接的实时观察（如灌注流速和胆汁生成）；实时测量（如灌注液的气体分析）；以及在样本采集后进行的事后测量，包括灌注液和组织的生化分析以及组织学分析。此处提到的结果来自22个灌注的人类肝脏。这些肝脏因各种原因被排除在移植之外，包括供体年龄、过长的热缺血时间、活检结果（脂肪变性、炎症、纤维化）以及后勤因素。18个肝脏来自心脏死亡后的供体，4个来自脑死亡后的供体。两种情况下，供体均预先接受30,000单位肝素治疗，并在体内及修肝台上用UW溶液进行灌洗。平均冷缺血时间为531 ± 237（标准差）分钟，平均热缺血时间为27 ± 10（标准差）分钟，从撤除生命支持到冷灌注开始计时。实时观察和测量可用于评估灌注期间的肝脏状态，而事后测量则在灌注结束后得出结果。
实时观察
由于冷肝阻力较高，肝脏灌注初期的血流低于目标流速。当肝脏灌注60分钟后温度升至21 °C时，通常可通过门静脉施加3 mmHg、肝动脉施加30 mmHg的压力，达到目标血流速度（图1A）。胆汁分泌通常在灌注开始后10分钟内即可观察到，并在灌注过程中持续稳定产生（图1B）。胆汁产量取决于肝脏质量，范围为0.3 ml/hr/kg肝组织至18 ml/min/kg。在热缺血时间较长的肝脏中，胆汁分泌往往逐渐减少；而热缺血时间较短的肝脏则可维持更稳定的胆汁生成，甚至出现胆汁产量增加的趋势。
实时测量
通过血气分析对灌注液进行直接且频繁的测定，对于实验目的以及维持充分的灌注条件（尤其是氧合和pH值）至关重要。门静脉（PV）和肝动脉（HA）流入端的溶解氧分压应高于700 mmHg。下腔静脉处测得的流出端氧分压通常随着灌注时间延长而下降，反映出氧摄取量逐渐增加。氧摄取速率可按先前所述方法计算13，在灌注初期为0.5–2.2 ml O2/min/kg，至t=3 hr时升至2.4–9.7 ml O2/min/kg （图1C）。在灌注开始后的前30分钟内可观察到pH值下降 （图1D），这主要是由于灌注液中乳酸的释放所致。可通过补充8.4%碳酸氢钠来纠正，约90分钟后pH值可恢复至正常范围，通常需要30–50 ml的8.4%碳酸氢钠。乳酸浓度在最初15–30分钟内迅速升高，但在灌注1小时后开始下降 （图1E）。
事后测量
可在灌注液中检测肝转氨酶（如ALT）。在灌注开始的前30分钟内，通常会观察到ALT显著升高，这反映了缺血期间释放的ALT被冲洗出来所致。 （图1F）. ALT 与热缺血时间显示出良好的相关性 13机器灌注使ATP含量增加了2.8倍，反映出能量状态的恢复 （图1G）H&amp;组织学分析显示，在机器灌注期间未发生额外损伤图1H, I需要注意的是，本方案中提出的活检方案仅用于科研目的，可能不适用于临床用途。
<img alt="肝脏灌注实验图表（A-G）和组织学图像（H-I），显示代谢参数。" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1：机器灌注期间人肝脏的评估。 SNMP 期间门静脉（PV）和肝动脉（HA）的血流（A），每小时灌注期间的胆汁生成量（B），氧消耗率（OUR），通过流入（PV+HA）与流出（下腔静脉）之间的差异计算得出，虚线表示灌注期间流入和流出中的部分氧分压（C），灌注期间的 pH 值和乳酸水平（D、E），ALT 释放至灌注液中（F），通过每小时肝组织活检测得的 ATP 含量（G），以及肝脏的 H&amp;E 染色图像（54 岁 DCD 供体，热缺血时间 19 分钟，冷缺血时间 559 分钟）在灌注前（H）和灌注后（I）。结果以均值 ± 标准误表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种方法 ex 体内 亚常温（21 °C）下人肝脏移植物的机械灌注

目前可用于移植的肝脏供体严重短缺。需要开发新型器官保存技术以扩大供肝来源。

本操作的总体目标是对人肝脏进行亚常温机械灌注，以实现器官的保存、恢复和评估。在临床前研究环境中，首先准备肝脏以连接设备；第二步，启动机器灌注系统并连接肝脏；最后一步开始灌注。在亚常温状态下，机器灌注的肝脏将恢复功能活性并产生胆汁。最终，可在灌注期间采集肝脏样本，用于分析器官的代谢恢复情况及功能状态。与现有的冷灌注和常温灌注等保存方法相比，该技术的主要优势在于：亚常温机械灌注可在无需满足体温灌注高代谢需求的情况下，实现肝脏的功能性恢复，并对其活力进行评估。该技术的许多方面需要经验或示范才能成功完成。例如，对于没有接受过外科手术培训的研究人员而言，演示如何在后桌进行肝脏准备，包括解剖动脉、静脉和胆管，将非常有帮助。收到肝脏后，将装满冰的器官托盘置于无菌铺巾的台面上，从运输箱中取出肝脏，使其大部分仍浸没在冷保存液袋中。接着，使用Metzenbaum剪刀显露从主动脉至肝固有动脉的肝动脉供血各分支。然后小心地解剖其余的动脉部分，避免切断任何供应肝脏的血管，但不要切断或结扎那些末端不可见的分支。当动脉被分离后，使用0号至4-0号丝线缝合结扎所有不供应肝脏的动脉分支。在靠近脾动脉和胃动脉起始处的位置进行结扎并切断。在腹腔干周围切取一段主动脉组织块。然后使用动脉灌注导管插入腹腔干进行插管。接着游离门静脉，结扎其任何分支或缝合静脉上的孔洞，并用门静脉灌注导管进行插管。从腔静脉的膈肌部分取下组织，注意不要切断静脉本身。然后从胆总管末端切取两到三个长约2至3毫米的完整周径组织样本。处理样本时应轻柔操作。将一份样本在液氮中快速冷冻，用于在零下80摄氏度条件下保存；另一份样本置于10%缓冲福尔马林中固定。随后用血管套管插管胆总管，并连接由细径管制成的引流管。接着用0号丝线结扎胆囊管。将冲洗管路连接至装有冰冻乳酸林格液的袋子，并用液体预冲管路以排出其中空气。将冲洗管路上的流速调节器调至缓慢滴注状态，并夹闭肝门处的门静脉，以排出血管内的空气。随后用冲洗液充满静脉中的套管，以排出门静脉内的空气，注意将液体袋的高度控制在肝脏水平上方不超过20厘米，以避免对静脉造成过高压力。然后用总共两升的 ICEC 冷乳酸林格液冲洗肝脏。冲洗过程中，在最低位置短暂阻断门静脉以检查有无渗漏，接着按照刚刚演示的方法，用一升溶液对肝动脉进行再次冲洗。在肝脏冲洗的同时，向器官槽中加入两升室温的灌注液八，启动设备以预充灌注系统管路，并将温度设定为 21 摄氏度。然后将门静脉压力设定为3毫米汞柱，肝动脉压力设定为30毫米汞柱。打开碳酰气（carbogen）气罐，调节气体流速至每分钟3升。接着，从门静脉和肝动脉流入样本口抽取血气样本，按照仪器制造商的说明在血气分析仪中检测样本，以确认氧合充分且pH值正常。根据需要使用碳酸氢钠或盐酸调节pH。然后在连接肝脏之前，从灌注液中收集一毫升样本作为零时点测量值，并将其储存在负80摄氏度条件下。同时使用单刃钢刀从肝脏切取两份约250毫克的楔形活检样本。将一份样本在液氮中速冻，用于负80摄氏度保存，另一份用10%缓冲福尔马林固定。在开始灌注前，称量肝脏重量，然后将器官转移至仪器的器官室中，并排出导管中的空气。如刚刚演示的那样。当插管完成后，将门静脉和肝动脉的流入端连接至相应的插管。开始灌注，并确保肝脏完全浸没在灌注液中，用湿润的无菌纱布覆盖任何干燥的表面，包括流入血管。为防止脱水，让胆汁导管流入收集容器中。确保胆汁引流管的开口处于肝脏水平或更低位置，以使胆汁能够自由流出。当肝脏温度升至21摄氏度时，门静脉和肝动脉的目标灌注流速应分别达到每分钟每公斤体重275至325毫升和50至100毫升。在灌注过程中，根据需要从灌注的肝组织和胆汁中采集样本。继续灌注三小时，期间监测压力、pH 和氧合情况，并根据需要使用碳酸氢钠调节 pH。灌注结束后，采集最终样本，断开肝脏连接并移除胆管插管。最后，按照前述方法采集两份灌注后胆管组织样本，并丢弃人肝脏。遵循正确的生物危害废弃物处理指南。由于冷肝阻力较高，在门静脉施加3毫米汞柱、肝动脉施加30毫米汞柱的压力时，灌注初始流量较低。通常在灌注60分钟后肝脏温度升至21摄氏度时，即可达到目标流量。通过血气分析频繁监测灌注液的各项指标，对于实验目的以及维持充分的灌注条件均至关重要。例如，门静脉和肝动脉流入血中的溶解氧分压应大于700毫米汞柱。而下腔静脉测得的流出氧分压通常随着灌注时间延长而降低，反映出氧摄取量的增加。此外，例如，也可在PERFU八中检测肝转氨酶。在灌注开始的前30分钟内，通常观察到丙氨酸转氨酶（alanine transaminase）或a LT水平升高，随后在灌注的其余时间内仅有轻微进一步升高。对机械灌注肝脏中a TP生成的进一步评估显示，肝脏中A TP含量增加了2.8倍，反映出能量状态正在恢复。此外，h和e染色组织学分析显示，该操作过程中未造成额外损伤。通过执行此操作流程，可对离体肝脏进行深入分析，从而获得关于肝脏生理学与病理学的独特见解。观看本视频后，您应能充分掌握如何在离体机械灌注过程中维持人肝脏的功能，以促进其在体外状态下的功能评估。

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科研

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Medicine

医学

功能人类肝脏保存和恢复由Subnormothermic机灌注手段

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