一种优化的富集技术用于分离 节杆菌属 从土壤样本分离物中鉴定的噬菌体物种

本实验的总体目标是通过富集方法从土壤样品中分离节杆菌噬菌体。首先采集土壤样品，并从其中分离出具有活性的噬菌体颗粒，同时去除污染的土壤微生物。第二步是利用分离得到的噬菌体颗粒感染宿主节杆菌细胞。

接着将感染的细菌细胞接种到含琼脂的平板上，通过观察噬菌斑的形成来鉴定噬菌体。最后一步是利用划线平板法从清晰分离的噬菌斑中纯化目标噬菌体。最终，该富集技术已针对从节杆菌属KY 3 9 0 1菌株中相对容易地分离节杆菌噬菌体进行了优化。

与现有的富集方法相比，该技术的主要优势在于将经过精细过滤的土壤样品添加到宿主细菌的纯培养物中，从而避免了竞争性细菌的生长。尽管该方法已被证实对节杆菌噬菌体的分离有效，但也应适用于从其他细菌宿主中分离噬菌体。当我们了解到其他研究人员在寻找节杆菌噬菌体方面遇到困难时，首次提出了这一方法的设想。

采用传统的富集技术，我的学生将演示成功分离节杆菌噬菌体所使用的技术。从LB琼脂平板上划线接种的菌落中培养节杆菌细胞，并在30摄氏度下培养两至三天。

使用无菌接种环挑取单菌落，并将其加入 50 毫升 LB 液体培养基中。在装有挡板的培养瓶中，于 30 摄氏度、225 转/分钟的摇床中孵育约 24 小时，以获得用于噬菌体感染实验的对数期或早期稳定期细胞。

密切监测细菌的生长状态，防止细胞进入中后期稳定期。用于噬菌体分离的理想OD 600值应在0.5至0.7之间。由于节杆菌属的细菌是常见的土壤细菌，因此它们及其感染的噬菌体可存在于大多数类型的土壤中。

从目标地点采集 200 至 400 克土壤。将至少 400 毫升噬菌体缓冲液加入足够大的烧杯中的土壤内，确保上清液中至少含有 200 毫升噬菌体缓冲液，能够被提取；轻轻搅拌或旋转混合，直至土壤充分悬浮，然后静置，通常为 30 分钟，使土壤沉淀。接下来，通过真空过滤将土壤提取液经滤纸过滤，以去除土壤沉淀物和杂质。

向200毫升过滤后的土壤提取物中加入4克LB粉末，混匀制成2%的溶液。通过真空过滤将溶液经0.22微米滤膜过滤，得到无菌滤液。如有可能，应立即进行下一步操作。

然而，如有必要，过滤后的样品可在四摄氏度条件下保存长达一周后再进行后续操作。但是，活性噬菌体颗粒的数量将会减少。采用无菌技术，将过滤除菌的 LB 土壤提取液混合物分装至多个独立的 250 毫升锥形瓶中，每瓶 50 毫升。在已灭菌的带挡板摇瓶中加入无菌的 2.0 摩尔/升氯化钙溶液，使其达到最终所需浓度。

由于不同的节杆菌噬菌体在不同氯化钙条件下具有最佳生长状态，因此在开始本实验时，向含有滤膜灭菌LB土壤提取物混合液的每个锥形瓶中加入1至2.5毫升处于对数末期或稳定初期的细菌培养物。若培养物的OD 600为0.5至0.7，则加入1毫升；若OD 600高于0.7，则加入2.5毫升。

将锥形瓶置于摇床培养箱中，在30摄氏度、250 RPM条件下振荡培养约24小时。24小时培养结束后，从摇床培养箱中取出富集用锥形瓶，用噬菌体缓冲液将富集样品稀释十倍。

在培养管中加入0.5毫升对数期末期或早期稳定期的细菌培养物。向培养管中加入5微升至500微升不同体积的稀释后富集培养物。

向培养管中加入氯化钙，使最终体积为5毫升时的浓度与原始富集瓶中的浓度一致。使用一系列不同浓度的氯化钙，以筛选出具有不同氯化钙依赖性的多种噬菌体。向每根培养管中加入4.5毫升LB上层琼脂，混匀后倒入LB琼脂平板中。

轻轻混匀，使液体均匀分布于平板表面，静置约15分钟，待上层琼脂凝固。将平板倒置，于30摄氏度培养过夜至48小时。可根据噬菌体情况调整培养时间；培养24小时后检查平板上噬菌斑的形成，以优化培养时长。

大多数分离得到的噬菌体来自在30摄氏度、含1至2.5毫摩尔氯化钙浓度条件下培养24小时的平板。使用木棒从形态清晰的噬菌斑中纯化目标噬菌体是该实验流程中最困难的步骤。操作者需具备一定的技术经验，以轻柔地将噬菌斑在划线平板上均匀涂布，形成一致的划线。通过将木棒在火焰上灼烧并冷却，对其进行灭菌处理。

用无菌的木棒轻轻接触一个噬斑，然后如图所示以轻柔的动作将木棒在LB琼脂平板上划线。每次划线均需使用一根新的洁净木棒。当LB琼脂平板上已完成至少三次划线后，标记出假定噬菌体颗粒浓度最低的区域。

在标记区域轻轻加入0.5毫升的节杆菌和4.5毫升熔化的LB上层琼脂，使其均匀铺展于平板表面。待上层琼脂凝固至少一小时后，将平板倒置并过夜培养。重复划线噬菌斑技术至少三次，以确保分离得到纯的噬菌体种。

平板可根据需要在两次划线之间于 4 摄氏度保存长达一周，噬菌体活性不会显著降低。当最终划线平板上已长出并分离出目标噬菌斑后，用微量移液枪头接触一个分离良好的噬菌斑，并将其重悬于 100 µL 噬菌体缓冲液中。通过将 20 µL 样品加入 180 µL 新鲜噬菌体缓冲液中，逐步将该溶液稀释至 10⁻⁸ 稀释度。取每个稀释度的溶液 10 µL，加入含有 0.5 mL 培养好的 Arthrobacter 的离心管中，在室温下孵育 5 至 10 分钟。

然后将感染的细菌与4.5毫升熔化的LB顶层琼脂混合，该顶层琼脂中含有与从原始土壤样品中分离噬菌体时所用相同浓度的氯化钙，混匀后涂布平板。将平板在37°C培养过夜。将当天制备的所有稀释液保存在4°C，直至次日。

使用传统的噬菌斑滴定法确定产生网状模式所需的噬菌体谷物稀释度。网状模式平板的特征是几乎无细菌生长，但含有尚未被噬菌体完全裂解的细菌残留物。向无菌的50毫升培养瓶中加入5毫升处于后期对数期或早期稳定期的节杆菌培养物。

取100微升产生网状图案的稀释液加入到节杆菌培养物中，室温下孵育5至10分钟，使噬菌体感染细菌细胞。随后加入含有与最初鉴定噬菌体平板时相同浓度氯化钙的熔融LB上层琼脂至该培养物中。将5毫升此混合物分别涂布于10个新鲜的LB平板上。

待上层琼脂凝固后，倒置平板，并于次日在30摄氏度下培养过夜。随后，每块平板加入5毫升噬菌体缓冲液淹没网状平板，于4摄氏度下保存过夜。将噬菌体裂解液通过0.22微米的一次性注射器滤器过滤。将此最终的噬菌体储备液于4摄氏度长期保存。

在本视频展示的富集过程中，将等量的噬菌体裂解液加入盛有无菌甘油的小管中，于负80摄氏度保存备用。在初始富集后，采用噬菌斑划线法分离纯的噬菌体群体，并在LB琼脂平板上进行培养。图中所示为在室温、30摄氏度和37摄氏度条件下分离噬菌体DI噬菌斑的代表性结果。其中两个平板上的红色圆圈标示出清晰分离的噬菌斑。噬菌体Dylan在三种不同温度下均产生类似的噬菌斑。

或者，也可采用传统的标准噬菌斑滴定实验来分离纯的噬菌体克隆。本研究中使用该实验方法来实证测定噬菌体滴度数值以及在平板上形成网状模式所需的噬菌斑形成单位数量。文中展示了香蕉噬菌体的一系列连续稀释示例，并提供了理想的网状模式应呈现的外观图例。

这些是利用富集技术分离得到的20种节杆菌噬菌体的电子显微镜图像。在目前已分离的25种噬菌体中，23种为长尾病毒科（Caudovirales）病毒，具有相对较长的尾部。另外两种分离得到的噬菌体为肌尾病毒科（Myoviridae）病毒，其头部直径与尾部长度相近。

一旦掌握，富集培养法应能成功地从多种土壤样本中分离出节杆菌噬菌体。观看本视频后，您应充分了解如何利用划线涂布法从环境土壤样本中纯化噬菌体。