一种优化富集技术的隔离节杆菌噬菌体种从土壤样品隔离

该程序的总体目标是使用富集方案从土壤样品中分离节杆菌细菌阶段。这是通过首先收集土壤样本并从污染的土壤微生物中分离活的噬菌体颗粒来实现的。第二步是用分离的噬菌体颗粒感染宿主节杆菌细菌细胞。

接下来，将受感染的细菌细胞接种在螺旋板上，以识别噬菌体，如噬菌斑形成所示。最后一步是使用条纹板法从明确分离的噬菌斑中纯化所需的噬菌体。最终，这种富集技术针对相对容易地从关节杆菌属 KY 3 9 0 1 中分离节杆菌噬菌体进行了优化。

与现有的富集方法相比，该技术的主要优点是将精细过滤的土壤样品添加到宿主细菌的纯培养物中，以避免竞争细菌的生长。尽管这种方法已被证明对分离节杆菌噬菌体有效，但它应该适用于从其他细菌宿主中分离噬菌体。当我们得知其他研究人员难以找到节杆菌噬菌体时，我们第一次想到了这种方法。

使用传统的浓缩技术。我的学生将演示用于成功分离节杆菌噬菌体的技术。节杆菌细胞是从 LB 螺旋板上划线的菌落中培养出来的，在 30 摄氏度下孵育 2 到 3 天。

使用无菌定量环挑取菌落并将其添加到 50 毫升 lb 肉汤中。在挡板培养物中，培养瓶在振荡培养箱中以 225 RPM 的速度在 30 摄氏度下孵育约 24 小时。获得用于噬菌体感染实验的指数或早期固定期细胞。

密切监测细菌生长状态，以防止细胞进入中晚期静止生长。州。用于噬菌体分离的理想 OD 600 在 0.5 到 0.7 之间。由于节杆菌属的细菌是常见的土壤细菌，因此它们和感染它们的噬菌体可以在大多数类型的土壤中找到。

从所需位置收集 200 至 400 克土壤。将至少 400 毫升噬菌体缓冲液添加到足够大的烧杯中的土壤中，使上清液中至少有 200 毫升噬菌体缓冲液，并且能够通过轻轻搅拌或旋转混合提取，直到土壤悬浮，并让土壤沉积物沉淀，通常持续 30 分钟。接下来，通过真空过滤将土壤提取物通过滤纸去除土壤沉积物碎屑。

将 4 克 LB 粉末加入 200 毫升过滤后的土壤提取物中，混合制成 2% 的溶液。通过真空过滤将溶液通过 0.22 微米过滤器，以获得无菌滤液。如果可能，请立即继续执行下一步。

然而，如果需要，过滤后的样品可以在 4 摄氏度下储存长达一周，然后再进行。然而，活噬菌体颗粒的数量将减少作为化粪池技术，将过滤灭菌的 LB 土壤提取物混合物的多个 50 毫升部分分装成单独的 250 毫升。灭菌、振荡、带挡板的培养瓶将无菌 2.0 摩尔氯化钙溶液添加至最终所需浓度。

由于不同的节杆菌噬菌体在不同的氯化钙条件下生长最佳，因此通过向每个含有过滤灭菌的 LB 土壤提取物混合物的培养瓶中加入 1 至 2.5 毫升的晚期指数期或早期固定期细菌培养物来开始此过程。如果培养物的 OD 600 为 0.5 至 0.7，则使用 1 毫升。如果 OD 600 高于 0.7，则使用 2.5 毫升。

在摇动培养箱中以 250 RPM 的转速在 30 摄氏度下摇动培养瓶约 24 小时。孵育 24 小时后，从振荡培养箱中取出富集培养瓶。在噬菌体缓冲液中将富集样品稀释 10 倍。

设置具有 0.5 毫升晚期指数或早期平稳的培养管。阶段细菌培养。向培养管中加入 5 微升至 500 微升不等的稀释富集培养物。

向培养管中加入氯化钙，使最终浓度为 5 毫升，等于原始富集瓶中的浓度。使用一系列不同浓度的氯化钙来选择具有不同氯化钙依赖性的许多噬菌体。向每个培养管中加入 4.5 毫升 LB 顶部螺旋钻，然后将混合物倒入 LB 螺旋板上。

轻轻旋转，使其均匀分布在板上，并让顶部螺旋钻凝固约 15 分钟。倒置板并在 30 摄氏度下孵育过夜至 48 小时。改变孵育时间，以优化孵育 24 小时后存在的噬菌体，检查平板上是否有噬菌斑形成。

大多数分离的噬菌体来自在 30 摄氏度下以 1 至 2.5 毫摩尔氯化钙浓度孵育 24 小时后的平板，使用木棒从明确分离的斑块中纯化所需的噬菌体是该程序中最具挑战性的部分。需要技术专业知识将斑块轻轻地分布在螺旋板上，以产生均匀的条纹板。将木棍穿过火焰并冷却，使其消毒。

用无菌木棍短暂触摸斑块，然后如图所示，轻柔地将木棍擦在螺旋板上。每次通过时，使用干净的摇杆重复此作。一旦 LB 螺旋板划线至少 3 次，标记假定噬菌体颗粒浓度最低的区域。

将 0.5 毫升节杆菌和 4.5 毫升熔融 LB 顶部螺旋轻轻涂抹在标记区域，并使其均匀分布在板上。当板凝固后，让顶部螺旋凝固至少一个小时，倒置并孵育过夜。重复条纹斑块技术至少迭代 3 次，以确保分离出纯噬菌体种类。

板可以在 4 摄氏度下根据需要在条纹之间储存长达一周，而不会显着损失噬菌体活力。在最终条纹板上生长并分离出所需的噬菌斑后，用微量移液器吸头接触一个分离良好的噬菌斑，并连续重悬于 100 μL 噬菌体缓冲液中将该溶液稀释至 10 至负 8 分之一稀释度，方法是将 20 μL 样品加入 180 μL 新鲜噬菌体缓冲液中。在室温下，将 10 μL 的每种稀释液加入培养管中 0.5 mL 生长的节杆菌中，放置 5 至 10 分钟。

然后通过将感染的细菌与 4.5 毫升熔融的 LB 顶部螺旋混合来铺板，该螺旋钻含有相同浓度的氯化钙，用于从原始土壤样品中分离噬菌体。将板孵育过夜。将所有在 4 摄氏度下制作的稀释液保存到第二天。

使用传统的噬菌斑滴度测定法确定制作网状图案所需的噬菌体谷物稀释度。将网状图案板识别为大部分没有细菌，但包含尚未被噬菌体绑扎的细菌残留物。将 5 mL 晚期指数或早期稳态节杆菌培养物添加到无菌 50 mL 培养瓶中。

加入 100 微升稀释液，使关节杆菌培养物形成网状图案，让噬菌体感染细菌细胞 5 至 10 分钟。在室温下，向培养瓶中加入熔融的 lb 顶部螺旋钻，其中含有与最初鉴定噬菌体板相同浓度的氯化钙。将 5 毫升这种混合物放到 10 个新鲜 LB 板中的每一个板上。

第二天，让顶部螺旋钻固化、倒置并在 30 摄氏度下孵育板过夜后，用每板 5 毫升噬菌体缓冲液淹没网状图案板，并在 4 摄氏度下储存过夜。通过 0.22 微米针式过滤器过滤噬菌体裂解物。将最终噬菌体原液储存在 4 摄氏度下，以便长期储存。

视频中演示的富集程序中，将等量的噬菌体裂解物添加到小瓶中的无菌甘油中，以便在零下 80 摄氏度下进行储备存档，在初始富集后分离纯噬菌体群体的噬菌斑条纹方法和在 LB 螺旋上铺板显示是在室温下分离噬菌体 DI 噬菌斑的代表性结果， 30 摄氏度和 37 摄氏度。其中两个板上的红色圆圈围绕着明显孤立的斑块。噬菌体 Dylan 在三种不同的温度下产生类似的噬菌斑。

或者，可以使用传统的标准噬菌斑滴度测定法来分离纯噬菌体分离物。该测定法在这里用于经验性地确定噬菌体滴度数和噬菌斑形成单位的数量，以在板上形成网状图案。显示了一组噬菌体香蕉的连续稀释液，并附有一个好的网型应该是什么样子的示例。

这些是使用富集技术分离的 20 个节杆菌噬菌体的电子显微图像。在目前分离的 25 个噬菌体中，其中 23 个是尾巴相当长的 cifo 病毒。其中两个分离的噬菌体是肌病毒，其头部直径与其尾巴的长度相似。

一旦掌握了，富集铺板应该允许从各种土壤样品中成功分离节杆菌噬菌体。看完这个视频后，你应该对如何从环境土壤样本中纯化 Phage is in the treak paint 方法有一个很好的了解。