Name: 细胞外离子流的使用离子选择性自引用的微电极技术测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学习使用离子选择性自引用微电极技术测量活体细胞和组织中的细胞外离子流。该方法可实现准确、无创的离子动态评估，为研究生理学和病理学提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了美国国家科学基金会（MCB-0951199）、美国国立卫生研究院（NIH）EY01910 项目、加州再生医学研究所（CIRM）RB1-01417 项目以及葡萄牙科学技术基金会（FCT）SFRH/BD/87256/2012 项目的部分资助。

1. 离子选择性自参考微电极的制备
<ol>
	<li>离子选择性微电极的制备
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪加热拉制无细丝的薄壁硼硅酸盐毛细管（外径 1.5 mm，内径 1.12 mm）。 
		注意：这将得到直径为3-4 µm的尖端。较细的尖端具有更高的电阻，会使微电极更容易受到电子噪声干扰，且对离子浓度变化的响应更慢。相关信息可参见Smith发表的论文 等.26.</li>
		<li>硅烷化电极以使内表面具有疏水性，有助于保留亲脂性离子载体混合物。将微电极置于金属架中，并在烘箱中加热过夜 &#62;100 °C 烘干。支架为一块金属板，上面钻有直径 2 mm、未贯穿的孔。将电极尖端朝上插入孔中，并用一个 250 ml 玻璃烧杯罩住电极。</li>
		<li>早晨，关闭烤箱电源，戴上隔热手套，小心取出带有电极和烧杯的金属架。关闭烤箱门以保留热量。</li>
		<li>佩戴乳胶或丁腈手套、实验服并佩戴护目镜。使用塑料巴斯德移液管，将一滴硅烷化溶液 I 加至每个电极的底部（保持烧杯原位；通过倾倒口插入移液管）。硅烷化溶液在加热板上挥发，使电极内部发生硅烷化。此步骤需在化学通风橱中进行。将支架/烧杯/电极放回热烘箱中数小时，以使残留的硅烷化溶液完全蒸发。 
		注意：出于安全考虑，切勿重新开启烤箱。在烤箱上贴上标签，注明不得接通电源，因其可能含有有害且易燃的蒸气。</li>
		<li>冷却后，将微电极存放在装有400 g干燥剂的玻璃干燥器内的微电极储存罐中。微电极可在此条件下保存数周。 
		注：Smith 中描述了一种替代的硅烷化方法 等26</li>
		<li>用含有待测离子浓度为 100 mM 的溶液反向填充微电极，体积为 50 至 100 µl（长度约 1 cm）（参见 表1 和 图1B）。使用一次性塑料巴斯德吸管，在本生灯上加热拉制成细丝状。用去离子水冲洗吸管2O 随后以防止堵塞。 
		注意：或者，可调节灌注液的离子浓度，使其与外部溶液中的离子浓度相匹配27.</li>
		<li>在解剖显微镜下观察微电极，确保无气泡存在。
		<ol>
			<li>若有气泡存在，可将微电极垂直持握（尖端朝下），用指甲轻敲电极，和/或使用装有硅胶管替代针头的注射器施加反向压力，将气泡从尖端推出。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用微电极填充仪将15至20 nl（长度为30–50 µm）的离子选择性离子载体混合液填充至微电极中（参见 表1将一小滴离子载体混合液置于载玻片的短边上。在解剖显微镜下观察微电极尖端，移动微电极使其尖端接触离子载体混合液约半秒钟。通过毛细作用力将离子载体混合液吸入微电极内。 
		注意：避免形成过长的离子载体混合液液柱，因为这会增加探针的电阻，可能导致电子干扰（噪声），并减缓响应速度。</li>
		<li>将微电极安装在带有1 mm金色公头连接器和AgCl(Ag)的直式微电极夹持器中+）导线（图1B).</li>
		<li>将微电极夹持器连接到安装在三维计算机控制电子显微操作器上的头架上（图1A).</li>
		<li>将微电极尖端置于适合待测样品的测量溶液中（如生理盐水、培养基， 等等。以使微电极稳定1至2小时，甚至过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参比电极的制备
	<ol>
		<li>参比电极（图1C）与上述毛细管相同。使用金刚石笔将毛细管切割为5 cm长的片段，并在每端用火焰抛光1–2秒。&#160;在本生灯火焰中。</li>
		<li>用约 200 µl 的 3 M NaCl 溶液填充这些电极，CH3CO2K（乙酸钾）或 KCl 加 2% 琼脂糖。根据待测离子选择溶液（参比电极中不应含有待测离子；见 表1）。将琼脂糖与溶液混合，放入微波炉加热至接近沸腾。搅拌以溶解琼脂糖（溶液变为澄清）。</li>
		<li>将参比电极固定在塑料巴斯德移液管上，并将热溶液吸入毛细管中。</li>
		<li>将电极浸入冰冷的 3 M NaCl 溶液中，CH3CO2K 或 KCl 溶液，并在使用前将其储存在密封管中的 3 M 溶液中。若参比电极中存在气泡，则应弃用。</li>
		<li>将参考电极安装在直型微电极夹持器中（预先填充3 M溶液），并使用AgCl(Ag)+)沉淀物内部和一个2 mm金色公头连接器（图1C并将电极及其固定器安装到磁性支架上固定的机械微调装置上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 离子选择性自参照微电极校准
<ol>
	<li>配制含有目标离子的校准溶液，其离子成分与参考溶液相同；参见表1。待测样品所处溶液中的离子浓度应位于校准溶液浓度范围之内（例如培养基、生理盐水）。即其中一种校准溶液的离子浓度应低于待测溶液，另一种则应高于待测溶液。
	<ol>
		<li>例如，使用含有1 mM K+的生理盐水。为涵盖该浓度范围，将KCl粉末溶于去离子水中，通过连续稀释配制成10、1和0.1 mM的溶液。使用这些溶液作为校准液。或者，至少使用其中两种浓度的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将离子选择性微电极和参比电极浸入每种校准溶液中，待电压值稳定1至3分钟&#160;后，使用专用软件记录相应的电压值（参见表1）。</li>
	<li>由于软件将数据（放大器输出）保存为txt文件，需将数据复制到电子表格中。绘制微电极输出（mV）相对于摩尔离子浓度对数值的关系图（图2A）。</li>
	<li>进行线性回归分析，计算能斯特斜率、截距和R2值。对于单价离子，若能斯特斜率为58 ± 11 mV/十倍浓度；对于二价离子，若为29 ± 11 mV/十倍浓度，则可接受该微电极（阳离子的能斯特斜率为正值，阴离子为负值）。此外，性能良好的微电极应具有较强的线性相关性（R2 &#62;0.9；图2B）。 
	注意：此处使用的放大器输出的mV值具有10倍增益，因此读数需除以10进行校正。</li>
	<li>利用线性回归公式将微电极的原始mV输出转换为实际的离子浓度（图2B）。</li>
</ol>
3. 离子选择性微电极技术的验证
<ol>
	<li>制备人工来源
	<ol>
		<li>人工制备的毛细管与上述毛细管相同。使用微电极拉制仪按照步骤1.1.1进行加热拉制。</li>
		<li>用 200 µl 的 1 M NaCl、KCl、CaCl 溶液回填这些毛细管22 H2O 或 pH 4 缓冲液。根据待测离子选择相应的人工源溶液（参见 表1). 
		注意：也可使用尖端直径较大（约 20 µm）的电极，并用含有 0.5–1% 琼脂糖的相同溶液填充尖端（琼脂糖可防止溶液产生整体流动）。</li>
		<li>将人工源毛细管安装在显微操作器上，并浸入用于测量样品中离子流速的溶液中。将人工源在溶液中静置30分钟。&#160;1小时内使梯度稳定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离子选择性微电极的验证
	<ol>
		<li>将离子选择性微电极浸入用于测量样品离子流的溶液中，位置位于人工源毛细管约一厘米处，并如前所述用参比电极闭合电路。让电压值稳定1至3分钟。&#160;使用专用软件记录1至2分钟的相应电压值。该值对应于缓冲液值（在文献中也称为参考值、背景值或空白值）。</li>
		<li>将离子选择性微电极移至距人工源约5 µm处，使电压值稳定1至3分钟&#160;使用软件记录相应电压1至2分钟。</li>
		<li>将离子选择性微电极分别置于距离人工源毛细管 10、20、40、80、160、320、640 和 1280 µm 的位置，重复上述操作步骤。</li>
		<li>将数据导出为 txt 文件，并将数值复制到电子表格文件中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据校准值的相同方法，计算与毫伏（mV）值对应的离子浓度。绘制该数值。 
	注意：如果存在离子流，微电极会检测到两个位置之间的离子浓度差异 （图3B））。如果人工源中所测离子的浓度高于溶液中的浓度，则靠近源的位置离子浓度应高于远离源的位置，从而验证离子选择性微电极能够正确检测离子流的方向（本例中为外流；对于人工汇，即特定离子浓度低于测量介质的情况，则应为内流）。
	<ol>
		<li>使用菲克扩散定律计算离子流： J = c µ (dc/dx) 其中 c 溶液中的离子浓度（mol/cm³）-3), µ 是离子迁移率（mol cm N-1 秒-1），以及 直流 是单位距离上的浓度差 dx （厘米）（图2C）。离子流数据通常以 pmol cm-2 s-1或 nmol cm-2 秒-1. 
		注意：Smith 描述了一种离子流计算的替代方法 等26. 可使用该方法。主要区别包括采用扩散系数替代离子迁移率，以及减去背景离子流（也称电压漂移或校正因子），后者通过测量不含样品的盐溶液中的离子流获得。</li>
		<li>将每一步离子流的平均值对距离源的距离作图（图 2D). 远离信号源时，可观察到通量值呈指数下降，验证了离子选择性微电极感知不同强度离子通量的能力。</li>
		<li>对每种拟记录的特定离子，均需进行一次人工源验证，以确认其方向和幅度测量的准确性，并确保具有较高的信噪比。 
		注意：在无样品的情况下对缓冲液进行离子流测定，可得到背景水平或噪声值。通常情况下，缓冲液的测定结果显示离子浓度无明显波动，因而离子流极小，且方向多变。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 测量室的准备
注意：在实验前，需考虑待测样品及其在微电极测量中如何安装和固定。
<ol>
	<li>进行Xenopus laevis卵母细胞测量时，剪取一块1 cm见方的800 µm尼龙网（nitex网），并将其粘接到塑料培养皿中（图1E）。</li>
</ol>
5. 离子流测定
<ol>
	<li>以与校准溶液相同的方法，测定用于样品测量的缓冲液中的离子浓度。X. laevis 卵母细胞需使用Mark’s改良林格液（MMR）。将NaCl、KCl、CaCl、MgCl和HEPES溶解于去离子水中，使其终浓度为（mM）：100 NaCl、2 KCl、2 CaCl、1 MgCl和5 HEPES。用NaOH将缓冲液的pH值调节至7.5。</li>
	<li>将样品放入测量室中，使用显微操作器将离子选择性微电极移至靠近样品的位置（距离约10 µm），以确定微电极的“近位”位置（图3A）。</li>
	<li>使用专用软件启动微电极在“近位”与远离样品的“远位”之间的低频（0.3 Hz）往复运动（行程100 µm）。确保微电极的运动方向垂直于样品表面。 
	注意：微电极的往复行程可在软件中设定。较大的行程可增强梯度读数，有助于在测量过程中更易检测到微小的离子流，但会延长采样间隔，降低时间分辨率。示例见图3A。</li>
	<li>使用软件开始记录。微电极在每个位置短暂停留，计算机记录以mV为单位的电势值。至少记录2分钟，以确保信号稳定。对于短时间序列实验，需在整个实验过程中持续记录感兴趣位置的电势变化。</li>
	<li>将数据导出为txt文件，并将数值复制到电子表格文件中。</li>
	<li>按照与校准值相同的方法，计算对应mV值的离子浓度，并绘制数值曲线。 
	注意：若存在离子流，微电极将在两个位置之间检测到离子浓度的差异（图3B）。</li>
	<li>如前所述（步骤3.3.1），利用菲克扩散定律计算离子流。</li>
	<li>在测量新样品前需重新测定缓冲液，并对每个新样品重复离子流的测量与计算过程。</li>
</ol>
6. 统计分析与数据展示
<ol>
	<li>使用具有混合效应的协方差分析（ANCOVA）模型28，检验在对照条件下位置和/或时间对离子流的独立影响。 
	注意：协方差分析（ANCOVA）是一种广义线性模型，通过结合常规方差分析（ANOVA）与回归分析，允许将分类变量和连续变量同时作为自变量使用。此外，当因个体重复测量或潜在的嵌套效应导致误差相关时，采用混合效应模型可准确估计固定效应与随机效应。</li>
	<li>采用 Student t 检验进行组间水平的两两比较，并对多重检验进行 Bonferroni 校正28。</li>
	<li>绘制箱形图，按位置和时间汇总离子流测量结果。图中应包含上述两两比较 Student t 检验所得的 p 值（图 3D），并按以下方式标示 p 值的显著性水平：*：p &#60;0.05；**：p &#60;0.01；***：p &#60;0.00129</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功测量细胞外离子流的最关键步骤 体内 包括：降低噪声、正确制备离子选择性微电极和参比电极，以及样品和两支电极的准确定位。
为尽量减少噪声，记录系统应置于接地的法拉第屏蔽笼内，最好使用带有金属顶板的隔振台，且该隔振台也应接地。此外，显微镜的机架也应接地。电噪声的来源包括光源。采用光纤“无风扇”光源可产生最小的电噪声。最后，保持微电极夹持器中的银丝和银粒处于氯化状态也有助于最小化噪声（浸入次氯酸钠漂白液中氯化，随后用去离子水冲洗）。2O) 离子选择性微电极或参比电极中若存在气泡，将导致测量失败，因为微电极的导电性会因此丧失或受损。因此，在将电极安装至电极夹持器前，必须在显微镜下检查电极。有关去除气泡的详细步骤，请参见实验方案。为确保结果可靠且可重复，必须准确定位样品和微电极。离子流的测量依赖于微电极的位移及其相对于样品的位置。必须精确定位样品上待测的目标区域，并调整微电极使其相对于样品表面做垂直移动。若微电极的移动方向不垂直于样品表面，将导致离子流测量值发生偏差，并增加样品间的变异程度。
...

所有动物细胞都被一层脂质双分子层膜所包围，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。细胞通过主动运输离子来维持膜内为负的电膜电位1。膜电位是一种储存的能量形式，细胞可利用它驱动膜上的各种分子装置2。神经元及其他可兴奋细胞具有较大的膜电位。钠离子通道的快速开放会导致膜电位崩溃（去极化），从而产生动作电位，并沿神经元传导2。除了这些快速的电变化外，许多组织和器官还能产生并维持显著的长期电位。例如，皮肤和角膜上皮细胞通过定向泵送离子（主要是钠离子和氯离子）来产生并维持跨上皮电位和细胞外电流传导3。
尽管使用振动探针4-6测量内源性细胞外电流传导，以及使用微电极系统7-10测量膜电位或跨上皮电位，能够实现对细胞膜和上皮细胞层电学参数的测定，但这些方法无法指明所涉及的离子种类。
带有选择性离子载体的微电极可测量溶液中特定离子的浓度。通过在不同位置放置两个或多个电极，可以测量离子梯度或通量。然而，每个探针固有的电压漂移各不相同，可能导致测量结果不准确，甚至检测出实际不存在的梯度。采用“自参考”模式的单个电极在两个点之间以低频移动，可解决这一问题。此时，离子通量可在相对缓慢且稳定的信号漂移背景下被检测到（见图3B）。
离子敏感测量系统采用离子选择性自参考微电极，用于检测靠近组织或单个细胞的微小细胞外离子流。该系统由一个放大器组成，用于处理微电极的信号，以及一个微步进电机及其驱动装置，用于控制微电极的运动。离子选择性微电极和用于闭合电路的参比电极通过前置放大头段连接至放大器（图1A）。计算机软件设定微电极运动的参数（频率、距离），并同时记录放大器的输出信号。步进电机通过三维微位移装置控制微电极的移动。低频振动式离子选择性微电极最早于1990年开发，用于测量特定的钙离子流11。除了钙离子外，目前已有 commercially accessible 离子载体混合物，可用于制备对钠、氯、钾、氢、镁、硝酸根、铵、氟、锂或汞离子敏感的微电极。
基本原理是，自参照离子选择性微电极技术可将溶液中特定离子的活度转化为可由电压表测量的电势。离子载体混合液是一种不混溶的液体（有机、亲脂性）相，具有离子交换特性。离子载体可逆地选择性络合（结合）特定离子，并将其在微电极内部的水溶液（电解液）与微电极所浸入的外部水溶液之间进行转移（图1D）。这种离子转移导致电化学平衡，电压表测量的是微电极与参比电极之间电势的变化。根据能斯特方程，测得的电压与特定离子活度的对数成正比，从而可计算出该离子的浓度（图2A 和 B）。
目前，已有多种系统可采用类似的概念或原理来测量离子流。例如，扫描离子选择性电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）12,13，以及由Newman和Shabala开发的微电极离子流估算技术（Microelectrode Ion Flux Estimation, MIFE）14-16，均已实现商业化，并被科研界广泛用于测定多种动物、植物及单细胞模型中细胞膜和组织上的特定离子流。离子选择性微电极已被用于测量植物根部的氢离子、钾离子和钙离子流17，大鼠脑动脉18和花粉管19中的氯离子流，鳐视网膜细胞中的氢离子流20，小鼠骨骼中的钙离子流21，真菌菌丝22和大鼠角膜23中的多种离子流，以及单细胞伤口愈合过程中的钙离子流12,24。有关离子选择性自参考微电极的详细信息，请参见以下综述25。
以下文章详细描述了如何在单细胞水平上利用离子选择性自参照微电极技术，制备并测量内源性细胞外离子流。

<table><tbody><tr><td>IonAmp&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>无</td><td>由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制的放大器；类似系统可从&amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo;（http://www.xuyue.org/）或&amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo;（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>IonAmp32&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>无</td><td>由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心开发的软件；类似系统可从&amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo;（http://www.xuyue.org/）或&amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo;（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>前置放大器探头</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>INA116</td><td>由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心设计的BSR电压跟随器INA116；类似系统可从&amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo;（http://www.xuyue.org/）或&amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo;（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>MicroStep驱动器</td><td>&amp;nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>无</td><td>需要三个MicroStep驱动器用于X、Y和Z方向的定位；由美国马萨诸塞州伍兹霍尔BioCurrents研究中心研制；类似系统可从&amp;ldquo;XBL function matters&amp;rdquo;（http://www.xuyue.org/）或&amp;ldquo;YoungerUSA&amp;rdquo;（http://www.youngerusa.com/）或Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>手动微调定位器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>型号 KITE-R</td><td>类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>磁性支架&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>型号 M10</td><td>类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>防震台&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>型号 VW-3036-OPT-023040</td><td>类似系统可从Applicable Electronics（http://www.applicableelectronics.com/）购买</td></tr><tr><td>三维微调定位器组件：带槽面90&amp;deg;角支架</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>型号 360-90</td><td>组装三维微调定位器还需配备三个用于X、Y、Z控制的电动旋转电机，MPH-1安装臂配MCA-2可调角度立柱，以及多种Newport连接件和螺钉，用于固定在防震台上</td></tr><tr><td>三维微调定位器组件：0.5英寸X向行程燕尾槽滑台</td><td>Newport Inc.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>无</td></tr><tr><td>三维微调定位器组件：快速安装线性滑台，0.5英寸XY行程</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>无</td></tr><tr><td>无内丝薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管，Kwik-Fil型&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>无</td></tr><tr><td>电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&amp;nbsp;PC-10</td><td>无</td></tr><tr><td>金属支架</td><td>自制</td><td>无</td><td>自制金属电极架，使用钢制10 cm × 15 cm矩形底板，钻出直径2 mm、间隔0.5 cm的孔</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>QL</td><td>型号 10 实验室烘箱</td><td>无</td></tr><tr><td>硅烷化溶液I&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>具有危险性，请按供应商建议操作&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃培养皿；派热克斯（Pyrex）</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>无</td></tr><tr><td>电极/微量移液管储存罐</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>E215</td><td>无</td></tr><tr><td>玻璃干燥器</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>内含Drierite干燥剂（W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA）。在密封圈上涂抹凡士林以确保气密性。</td></tr><tr><td>塑料巴斯德移液管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>无</td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>无</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>无</td></tr><tr><td>直型微电极架</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>配有1 mm金质公接头和Ag/AgCl导线</td></tr><tr><td>直型微电极架&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>内部含AgCl（Ag&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;）压片，配有2 mm金质公接头&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm 培养皿</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>无</td></tr><tr><td>Nitex筛网</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>无</td></tr><tr><td>胶水；Loctite环氧树脂</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>在塑料称量皿中按等比例混合胶水与固化剂，并充分搅拌。固化迅速，但建议在室温下放置24小时以确保完全固化</td></tr><tr><td>去离子水&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>无</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>无</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>无</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>无</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>无</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>无</td></tr></tbody></table>

使用离子选择性自参考微电极技术测量细胞外离子流

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

动物、植物及单细胞的细胞由一种称为细胞膜的屏障包裹，该膜将细胞质与外部环境分隔开来。上皮等细胞层也形成屏障，将多细胞生物体的内部与外部或不同区室分隔开。这些屏障的一个关键特征是离子在细胞膜或细胞层两侧的差异性分布。这种分布依赖于两个特性：1）细胞膜和上皮对特定离子具有选择性通透性；2）离子通过泵在细胞膜和细胞层中被主动转运。这些特性在维持组织生理功能中起着至关重要的作用，并在损伤后、修复过程中或病理状态下作为信号提示发挥作用。离子选择性自参照微电极可用于测量钙、钾或钠等离子在单个细胞和组织水平上的特定通量。该微电极内含一种对特定离子具有选择性通透性的离子载体混合物。电极内部填充液含有已知浓度的目标离子。微电极的电势由外部环境中该离子的浓度决定。随着离子浓度的变化，微电极的电势随之呈离子活度对数函数关系改变。当微电极在某一离子源或汇附近来回移动时即 由于离子流动形成的浓度梯度，微电极电位会发生振幅与离子流/浓度梯度成正比的波动。放大器对微电极信号进行放大，输出信号被记录在计算机中。随后，可利用菲克扩散定律，结合电极电位波动、微电极的位移以及其他参数（如特定离子的迁移率）计算出离子流。本文详细描述了使用离子选择性自参照微电极测量细胞外离子流的方法，并展示了一些代表性结果。

我们先前已证明，单细胞损伤后会出现钙离子内流24。因此，我们提出疑问：单细胞损伤是否还会引发其他离子流变。我们采用了X. laevis卵母细胞，这是一种广泛用于单细胞伤口修复30-34和电生理记录研究的成熟模型24,35-39。有趣的是，X. laevis卵母细胞内部的钾离子浓度（约110 mM）40高于所用的细胞外溶液（在MMR 1x中：1 mM），这提示损伤后可能发生钾离子外流。为验证这一假设，我们利用离子选择性自参照微电极，检测了X. laevis卵母细胞细胞膜修复过程中钾离子的流动情况。
为损伤卵母细胞，首先拉制一个尖端较大（约 50 µm）的毛细管电极。将电极固定在直型电极夹持器上，并安装至手动微操纵器。通过电极尖端接触细胞膜来造成损伤24。损伤后不久，我们检测到大量钾离子外流（最高达 250 nmol cm-2 sec-1；图 3B...

细胞膜中的转运蛋白能够介导离子在细胞膜或细胞层之间的选择性分布，在组织生理、修复及病理过程中发挥关键作用。本文介绍了离子选择性自参照微电极技术，该技术可用于测定单个细胞和组织的特定离子流。 体内.

动物、植物及单细胞生物的细胞均被一种称为细胞膜的屏障所包裹，该屏障将细胞质与外部环境分隔开来。细胞层……

本实验的总体目标是利用离子选择性自参照微电极技术在体内测量细胞外离子流。首先需要制备离子选择性微电极和参比微电极，第二步是对离子选择性自参照微电极进行校准和验证。接下来，以电压记录的形式对生物样品进行离子特异性通量测定。最后，将电压记录转换为离子通量。最终，该技术可实现对活细胞或组织中特定细胞外离子通量的精确、非侵入性测量。这些方法有助于回答生理学或衰老以及再生与病理学中的关键问题。例如，该方法可用于鉴定调控生物过程（如组织形态发生、生长或分化）的特定离子流。本实验操作将由博士后吉姆·阿迪（Dr. Gim Ardi）和本雅实验室的成员进行演示。在电极校准安装之前，需将预填充的离子选择性电极安装在微型电极夹持器中，该夹持器配备一个直径一毫米的金质公接头和一根镀有氯化银的银丝。然后将微电极夹持器连接至由计算机控制的三维电子微位移器。离子选择性电极本身应已包含电解质以及针对目标离子的离子载体混合溶液。安装完成后，应将电极浸入含有1 mmol/L氯化钾的溶液中。此外，将参比电极安装在一个直型微电极夹持器中，该夹持器内含有3摩尔的盐溶液（溶于琼脂）、一个镀有氯化银的银颗粒以及一个直径2毫米的金质公接头，用于连接参比电极。盐溶液的选择取决于待测的离子种类。制备好参比电极后，将电极夹持器固定在已预先安装于磁力支架上的手动微调定位器上。安装完成后，应将电极浸入含有1 mmol/L氯化钾的溶液中。开始实验前，离子选择性电极系统需预先配制一系列含有目标离子的电解质校准标准品稀释液。例如，若需检测生理浓度约为1 mmol/L的钾阳离子，则应配制浓度分别为10、1和0.1 mmol/L的三组对数梯度氯化钾溶液。这可以最大化检测方法所需的动态范围。校准离子选择性电极时，首先将离子选择性电极和参比电极浸入浓度最低的校准溶液中（本例中为 0.1 毫摩尔）。在室温下短暂稳定 1 至 3 分钟后，测量并记录稳态电压。对剩余的校准标准品重复电压测量，将测得的电压值对摩尔离子浓度的对数作图。针对每种标准溶液，应用线性回归以确定校准曲线的N斜率截距以及决定系数（R²）值。计算能斯特斜率时，需记住将测得的电压除以电压放大器的总增益。为了演示测量方案，将使用对钾离子敏感的微电极来表征穿孔的非洲爪蟾卵母细胞中钾离子的流速。在开始离子选择性电极实验之前，剪取一块直径一厘米的800微米尼龙网片，并将其粘附至一个塑料培养皿上。同时，预先配制好Mark's改良林格氏液，其成分为：100毫摩尔氯化钠、2毫摩尔氯化钾、2毫摩尔氯化钙、1毫摩尔氯化镁以及5毫摩尔HEPES。用氢氧化钠将缓冲液的pH值调节至7.5，并将适量配制好的缓冲液加入培养皿中。小心地将蛙细胞、离子选择性电极和参比电极放入培养皿中。然后穿刺细胞，并操作微调定位器，使离子选择性电极距离样本约10微米。按照命名惯例，样本与电极之间的当前距离将被定义为“近距离”位置。接下来，驱动微位移器，使离子选择性电极以0.3赫兹的频率，即每10秒完成3次完整行程，周期性地从距离10微米的近端位置移动至100微米的远端位置，然后再返回近端位置。在微位移器驱动过程中，需确认电极的运动方向严格垂直于细胞切向表面的损伤区域，并启动电压测量与记录软件。微位移器程序设定在近端和远端位置短暂停留，以便采集电压数据。卵母细胞伤口愈合过程中持续记录数据，该过程大约需要15分钟；而对于较长时间的实验，例如观察澳洲魔蟾蝌蚪尾部再生的多日过程，则在不同时间点分别记录两分钟的数据，例如在1、3、6、12和24小时。实验结束后，将电压数据导出为文本文件，并将数值复制到电子表格中。利用先前确定的校准曲线，将测得的电压值转换为其对应的离子浓度。将外推得到的离子浓度作为距离生物样品远近的函数进行作图。最后，根据扩散的费克定律计算离子流速。其中 C 是溶液中的离子浓度，MU 是离子迁移率，DC DX 是距离 dx 上的浓度差。在进行生物学实验之前，可通过在培养皿中放置一摩尔离子源生成的人工离子梯度，来验证离子选择性电极的 NER 斜率截距值及整个校准曲线。当绘制靠近或远离 annu site 伤口处钾离子浓度的变化时。数据表明，在细胞损伤初期会立即发生大规模的钾离子流动事件，随着伤口愈合的进行，该钾离子流动在15分钟后伤口完全愈合时逐渐恢复至静息水平。此外，当将测得的钾离子浓度转换为离子流时，与完整的对照卵母细胞相比，损伤后钾离子流的突然增加和随后的逐渐减少呈现出统计学上的显著差异。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如荧光生物电标记）来探究细胞内及亚细胞水平离子流动特性的更多相关问题。

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞外离子流的使用离子选择性自引用的微电极技术测量

本方案提供了一种利用细胞外通量分析法测定原代白血病细胞胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）的生化方法。对这些细胞代谢特征的评估有助于明确其代谢需求，从而实现个体化治疗。...

细胞外通量测定：一种用于测量细胞代谢特征的方法

在本视频中，表达与荧光报告蛋白融合的光依赖性离子通道蛋白的胚胎肾细胞培养物展示了光对离子移动的影响。采用全细胞膜片钳技术来监测离子的移动。...

光遗传电生理记录具有光依赖性离子通道的细胞

本视频演示了如何利用离子选择性微电极和电泳微电极测量并比较电信号，以表征脑切片中的细胞外间隙。该过程有助于确定细胞外间隙的体积分数及其迂曲程度。...

利用离子选择性微电极与离子电渗微电极表征脑切片中的细胞外空间

本文的第一部分介绍了如何筛选在细胞质膜上表达囊泡型 Na+/H+ 交换体的突变细胞系。第二部分提供了基于细胞内 pH...

利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。...

用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

本方案描述了利用Ramsay法测定黑腹果蝇（Drosophila...

利用Ramsay测定法测量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）马尔皮基氏小管中的液体分泌及离子流速率

本文介绍了如何利用HEK293细胞进行电生理全细胞膜片钳记录，以测定通道视紫红质的离子选择性。此处演示了研究一种阴离子选择性通道视紫红质对氯离子选择性的实验步骤。然而，该方法同样适用于其他具有不同选择性的通道视紫红质。...

全细胞膜片钳记录法用于光敏通道蛋白离子选择性的电生理测定

本文描述了使用质子选择性电极和膜片钳技术来测量质子转运系统活性的方法。这些方法克服了常用于研究质子转运活性的技术中存在的一些局限性，例如灵敏度中等、时间分辨率不足以及对细胞内环境控制不充分。...

电生理学测量在研究电中性转运蛋白活性中的应用

钾离子参与 细胞静息膜电位和细胞外K+ 浓度是细胞兴奋性的关键调节因素。我们介绍了如何制备、校准和使用单极K⁺+选择性微电极。使用此类电极可测量电刺激诱发的K⁺+...

制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

本方案概述了用于研究成年蚊虫排泄系统（包括马氏管和后肠）的拉姆齐测定法、离子选择性微电极、扫描离子选择性电极技术（SIET）以及体外收缩测定法，这些方法可共同用于测量离子和液体分泌速率、收缩活动以及跨上皮离子转运。...

研究神经肽及其他调节因子在成年蚊子排泄系统中的活性

学习使用离子选择性自引用微电极技术测量活体细胞和组织中的细胞外离子流。该方法可实现准确、无创的离子动态评估，为研究生理学和病理学提供重要工具。

使用离子选择性自参考微电极技术测量细胞外离子流

探索更多视频