斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

本实验的总体目标是诱导斑马鱼肝细胞消融，以分析胆管驱动的肝脏再生过程。首先，使在肝细胞中表达硝基还原酶的转基因幼鱼暴露于甲硝唑（metronidazole，MTZ）中，以实现肝细胞消融。第二步，通过肝脏相对大小评估肝细胞消融程度。

在最后一步经MTZ处理后，收集胆管消融后肝脏极小的幼鱼，随后分别通过落射荧光显微镜和共聚焦显微镜测量肝脏再生过程中的肝脏大小以及肝标志物的表达水平。该技术相较于现有方法（如啮齿类动物卵圆细胞激活模型）的主要优势在于，再生的肝细胞主要来源于胆管上皮细胞。该方法有助于回答肝脏再生领域中的关键科学问题，例如胆管细胞或肝前体细胞如何参与肝脏再生。通常，初次接触该技术的研究人员可能会遇到困难，因为幼鱼肝脏在退变过程中的大小存在较大变异性。

为了进行定时交配，将成年雄性和雌性半合子或纯合子鱼在隔板两侧共同饲养过夜。次日早晨需要交配时，移除隔板，并使用精细的塑料网筛收集胚胎；将筛子倒置，用洗瓶以细流的胚胎培养液冲洗网面。随后将最多100个胚胎转移至含有25毫升胚胎培养液的100毫米培养皿中，并将培养皿置于28°C环境中以抑制色素形成。

在受精后80小时，将PTU加入培养物中，持续至多10小时。个性化处理后，用三卡因麻醉幼虫，并使用落射荧光显微镜收集CFP阳性幼虫，仅保留肝脏大小相似的个体。

然后用添加了PTU的新鲜卵水替换三卡卵水，并将CFP阳性的斑马鱼幼鱼放回28°C的培养箱中。若需先用MTZ处理斑马鱼幼鱼，首先将适当数量的幼鱼分成两组，分别置于两个不同的培养容器中。将实验组幼鱼置于 freshly prepared MTZ 溶液中，对照组则保留在卵水中。

加入DMSO。在消融期结束时，用铝箔覆盖实验组，以防止MTZ发生光失活，并将两组斑马鱼幼鱼均在28摄氏度下孵育。从培养板中移除MTZ溶液，用25毫升卵水对经MTZ处理的幼鱼清洗两到三次，每次清洗后轻轻旋转并弃去卵水。

最后一次洗涤后，使用先前浓度一半的三卡因固定幼鱼，以避免MTZ处理的幼鱼出现心脏水肿和死亡。然后在落射荧光显微镜下使用CFP滤光片，根据MTZ处理幼鱼的相对肝脏大小评估肝细胞消融水平。若斑马鱼肝脏较大，且占比为幼鱼总数的0%至5%，则视为未消融。

将肝脏中等大小、占幼鱼总数10%至20%的个体归为部分消融组，将肝脏非常小、占幼鱼总数80%至90%的个体归为完全消融组。在对所有动物进行分类后，筛选出肝脏未消融或部分消融的幼鱼，仅保留肝脏微小、提示严重肝细胞消融的斑马鱼用于肝脏分析。在再生零小时时间点，将幼鱼转移至1.5毫升微量离心管中。

在MTZ洗脱并提供CFP后，立即将卵水替换为3%多聚甲醛MPEM缓冲液，在4摄氏度的旋转器上进行过夜固定。次日早晨，将固定液替换为1毫升P-B-S-D-T溶液，并继续旋转孵育幼鱼5分钟。随后，在解剖显微镜下将所有固定的幼鱼转移至含有新鲜P-B-S-D-T溶液的100毫米培养皿中，并使用镊子在所有幼鱼完成剪切后手动去除卵黄和胸鳍。

将最多20只动物转移至1.5毫升离心管中，并用1毫升封闭液替换PBSDT。室温下在旋转仪上孵育2小时后，弃去封闭液，加入100微升一抗混合液，于4摄氏度过夜孵育。次日，在摇床上孵育时，移除一抗溶液，并用PBSDT对斑马鱼进行5次洗涤，每次10分钟。

最后一次洗涤后，加入 100 微升二抗，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时。最后，用 P-B-S-D-T 溶液如前所述洗涤幼虫 5 次。将幼虫侧向排列在显微镜载玻片上，并加入一滴封片介质。

然后小心地用盖玻片覆盖每条斑马鱼，并用指甲油密封盖玻片。在受精后3.5至5天期间，使用MTZ处理36小时可显著减小肝脏体积。在洗去MTZ后30小时内，CFP和红色荧光表达明显恢复，这一点通过胆管上皮细胞膜上LCAM的表达得以证实。

肝内胆管网络最初发生塌陷，但在洗脱后54小时重新建立，表明肝脏快速再生并恢复。在这些图像中，显示了表达仅在肝胆管上皮细胞中特异性表达的核红色荧光蛋白的转基因再生肝细胞，再生肝脏中大多数H2B-mCherry阳性细胞在再生0小时即表达HNF4α；在再生48小时时。经MTZ处理的CFP阳性肝细胞仍保留其H2B-mCherry表达，表明在严重肝细胞丢失情况下，胆管上皮细胞转化为肝细胞。

在进行该操作时，重要的是要记住，在 MTT 处理后，应选择完全消融的样本，以用于后续裂解后肝脏再生的研究。该技术为肝脏再生领域的研究人员探索肝脏前体细胞驱动的肝脏再生机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这种肝细胞特异性的操作模型开展胆汁驱动的肝脏再生研究。