Name: 肝细胞特异性消融在斑马鱼研究胆驱动肝再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解利用甲硝唑处理转基因斑马鱼幼鱼诱导肝细胞特异性消融的方法，以研究胆驱动肝再生机制。该技术通过荧光显微镜评估肝脏大小和标志物表达，为肝脏再生生物学提供新见解。

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作者感谢 Hukriede 和 Tsang 博士的讨论。M.K. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）培训基金（T32EB001026）的支持。本工作部分由美国肝脏基金会、March of Dimes 基金会（5-FY12-39）以及美国国立卫生研究院（NIH）（DK101426）向 D.S. 提供的基金资助。

斑马鱼的饲养和繁殖按照标准程序进行；实验已获得匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 胚胎/幼虫的制备
<ol>
	<li>为进行定时交配，将成年雄性和雌性半合子或纯合子 Tg(fabp10a:CFP-NTR)s931 斑马鱼过夜共养，并在它们之间放置隔离板。次日早晨需要交配时，移除隔离板。使用细塑料网筛过滤水体以收集胚胎。</li>
	<li>将网筛倒置，用挤压瓶挤出的细流蛋水冲洗网面。将100个胚胎转移至含有25 ml蛋水的100&#160;mm培养皿中。每培养皿中培养的胚胎数不超过100个，并在28 °C条件下培养。</li>
	<li>为抑制色素形成，在受精后10小时（hpf）之前向培养皿中加入苯硫脲（PTU），并将胚胎/幼鱼培养至80 hpf。PTU的终浓度为0.2 mM。注意：PTU具有毒性，应按照适当的处理规范使用。</li>
	<li>通过向培养皿中加入终浓度为0.016%的3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）对幼鱼进行麻醉。然后使用落射荧光显微镜筛选CFP阳性幼鱼。选择肝脏大小相近的幼鱼，剔除肝脏过小或过大的个体。 
	注意：任何CFP阳性的幼鱼均可使用，无论其荧光强度如何，因为半合子与纯合子幼鱼在肝细胞消融程度上无差异。注意：Tricaine具有毒性，应按照适当的处理规范使用。</li>
	<li>移除含有Tricaine的蛋水，更换为添加了0.2 mM PTU的蛋水。将胚胎/幼鱼继续在28 °C条件下培养。</li>
</ol>
2. Mtz 处理
<ol>
	<li>通过将 0.171 g 甲硝唑（Mtz）粉末溶解于 100 ml 含 0.2% DMSO 和 0.2 mM PTU 的卵水中，配制新鲜的 10 mM Mtz 溶液。为完全溶解 Mtz，需在室温下&#160;快速搅拌 20–30 分钟。为促进 Mtz 溶解并增强其向幼鱼体内的渗透，在配制 Mtz 溶液时加入 DMSO。注意：长时间暴露或高浓度 Mtz 具有毒性，应按照适当的处理规范使用。</li>
	<li>将幼鱼转移至两个不同的 100&#160;mm 培养皿或多孔板中，分为对照组和实验组。实验组幼鱼置于 10 mM Mtz 溶液中；对照组则置于含 0.2% DMSO 的卵水中。</li>
	<li>用铝箔覆盖含 Mtz 溶液的培养皿或培养板，防止 Mtz 光照失活，并在 28 °C 下孵育。Mtz 处理的持续时间取决于幼鱼发育阶段和转基因品系。</li>
	<li>为在 Tg(fabp10a:CFP-NTR) 品系中观察到类似的严重肝细胞消融效果，可从受精后 3.5 天（dpf）开始处理（持续 36 小时），或从 5 dpf 开始处理（持续 24 小时）。</li>
</ol>
3. 胆汁驱动的肝脏再生分析
<ol>
	<li>消融期结束后，从培养板中移除 Mtz 溶液。加入 25 ml 卵水清洗经 Mtz 处理的幼鱼。轻轻晃动培养板 2–3 次以清洗幼鱼，然后弃去卵水。重复此步骤三次，最后再将幼鱼浸入一次卵水中。为避免 Mtz 处理幼鱼出现心脏水肿和死亡，使用较低浓度的 Tricaine 进行麻醉，终浓度为 0.008%，以固定幼鱼。</li>
	<li>进行肝脏分析时，在落射荧光显微镜下使用 CFP 滤光片观察 Mtz 处理幼鱼的肝脏大小。根据相对肝脏大小评估肝细胞消融程度：大（未消融；0–10% 幼鱼）、中等（部分消融；10–20%）、极小（完全消融；80–90%）。</li>
	<li>剔除肝脏未消融或部分消融的幼鱼，仅保留肝脏极小的个体，这表明肝细胞严重消融。若需在肝脏再生 0 小时时间点（R0h）进行分析，则在 Mtz 洗脱并完成 CFP 分选后立即收集幼鱼；否则，将分选后的幼鱼保留在补充有 0.2 mM PTU 的卵水中，直至准备收集。</li>
	<li>将收集的幼鱼转移至 1.5&#160;ml 微离心管中，弃去卵水，加入含 3% 甲醛的 PEM 缓冲液固定液。将离心管置于 4 °C 条件下，在摇床上避光固定过夜（O/N）。</li>
	<li>弃去固定液，加入 1 ml PBSDT 溶液，将离心管置于摇床上旋转清洗 5 分钟。</li>
	<li>将固定后的幼鱼转移至含有 PBSDT 的 100&#160;mm 培养皿中，在体视显微镜下用镊子手动去除卵黄和胸鳍。将最多 20 条解剖完成的幼鱼转移至 1.5&#160;ml 离心管中。</li>
	<li>弃去 PBSDT 溶液，加入 1 ml 封闭液，在室温（RT）下于摇床上轻摇封闭 2 小时。</li>
	<li>弃去封闭液，加入含一抗的封闭液共 100 µl。在 4°C 条件下于摇床上缓慢摇动过夜（O/N&#160;）。</li>
	<li>移除一抗溶液，用 PBSDT 溶液清洗 5 次，每次 10 分钟。随后加入含二抗的封闭液 100 µl，在室温下于摇床上轻摇 2 小时。</li>
	<li>在室温下，于摇床上用 PBSDT 溶液清洗 5 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将幼鱼侧向置于载玻片上，滴加一滴封片剂，小心盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。样本现已准备就绪，可用于共聚焦显微镜观察。</li>
</ol>

<ol><li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroen+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li>
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<li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+by+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li>
<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

严重的肝细胞消融（而非轻度消融）会引发胆管驱动的肝脏再生。因此，在甲硝唑（Mtz）处理并洗脱后，有必要观察经Mtz处理的幼鱼的肝脏大小，可通过fabp10a:CFP-NTR转基因的内源性CFP荧光进行评估。由于少数经Mtz处理的幼鱼会出现未消融（0–5%）或部分消融（10–20%）的肝脏，因此必须筛选并仅分析肝脏明显缩小的幼鱼，这表明发生了严重的肝细胞消融。
尽管在本实验方案中，我们使用甲硝唑（Mtz）处理斑马鱼幼鱼的时间为3.5至5天（共36小时），但也可采用其他发育阶段和不同处理时长。例如，在5至6天期间（共24小时）进行甲硝唑处理的幼鱼同样表现出严重的肝细胞消融，与前述36&#160;小时处理组效果相似。另外两个研究团队独立构建了类似的fabp10a:NTR转基因品系，并分别报道了在肝细胞特异性消融后由胆管驱动的肝脏再生过程。其中一个团队在6至7天期间对幼鱼进行甲硝唑处理21，另一团队则在3.5至4.5天期间进行处理，均得出了相似的结论20。由于不同的fabp10a:NTR转基因...

肝脏是一种高度可再生的器官。在肝脏再生过程中，新生的肝实质细胞（即肝细胞）来源于已有的肝细胞（肝细胞驱动的肝脏再生）或胆管上皮细胞（BECs，胆管驱动的肝脏再生）1,2。通常情况下，肝脏损伤会引发已有肝细胞的增殖；然而，当肝细胞增殖能力受损时，BECs 可以转分化为肝细胞2-4。这两种肝脏再生模式在临床上具有重要意义。在人类部分肝脏手术切除后（例如，因肝脏肿瘤或活体肝捐献），残余肝脏中的肝细胞通过增殖以恢复失去的肝脏质量。相比之下，在患有严重肝病的患者中，肝细胞增殖能力显著受限，此时 BECs 或肝脏前体细胞（LPCs）似乎参与了新生肝细胞的生成5,6。啮齿类动物的2/3部分肝切除模型中，肝细胞通过增殖恢复肝脏质量，该模型极大地促进了人们对肝细胞驱动型肝脏再生机制的理解7,8。然而，目前尚无有效的啮齿类动物模型能够实现再生肝细胞主要来源于 BECs 的情况。尽管已有多种啮齿类肝脏毒素模型曾用于鉴定胆管驱动的肝脏再生过程2-4，但近期的小鼠谱系追踪研究表明，在这些模型中 BECs 对再生肝细胞的贡献极小9,10。部分啮齿类肝脏损伤模型，包括部分肝切除11-13 和对乙酰氨基酚诱导的肝损伤14,15，已被应用于斑马鱼，并由此鉴定出一些与肝脏再生相关的新基因或信号通路。然而，这些斑马鱼肝脏损伤模型中仅发生肝细胞驱动、而非 BEC 驱动的肝脏再生。因此，建立一种新型的肝脏损伤模型，使 BECs 能够广泛地转化为再生肝细胞，对于深入理解 BEC 驱动的肝脏再生机制至关重要。
本文所述肝细胞消融模型的总体目标是：（1）建立一种肝损伤模型，在该模型中胆管上皮细胞（BEC）广泛参与再生肝细胞的形成；（2）阐明BEC驱动肝脏再生的分子与细胞机制。我们假设，损伤的严重程度决定了肝脏再生的模式；因此，我们预测，严重的肝细胞损伤将启动胆管来源的肝脏再生。为验证这一假设，我们构建了一种转基因斑马鱼肝损伤模型，即Tg(fabp10a:CFP-NTR)s931品系，该品系在肝细胞特异性启动子fabp10a的驱动下，高效表达细菌硝基还原酶（NTR）与青色荧光蛋白（CFP）的融合蛋白。由于NTR可将无毒前体药物甲硝唑（Mtz）转化为细胞毒性药物，因此仅特异性消融表达NTR的细胞16-18，即本模型中的肝细胞。通过调控Mtz处理时间，可精确控制肝细胞消融的程度。利用该模型，我们近期报道了在严重肝细胞丢失后，BEC可广泛分化为再生肝细胞19，这一发现随后被另外两项独立研究进一步证实20,21。因此，与前述啮齿类动物及斑马鱼肝损伤模型相比，我们的肝细胞消融模型在研究BEC驱动的肝脏再生方面具有明显优势。
本方案描述了利用斑马鱼肝细胞消融模型进行肝脏再生实验的步骤。该模型适用于研究胆管驱动的肝脏再生机制，以及开展化学筛选以鉴定能够抑制或增强肝脏再生的小分子化合物。

<table><tbody><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>配制0.4%（15 mM）Tricaine储备液：将0.4 g Tricaine溶于100 mL卵水中。调节pH至7。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>甲硝唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>二水合硫酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-苯基硫脲（PTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（Vectashield）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A 和 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5（小鼠抗Alcam）</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 稀释</td></tr><tr><td>山羊抗Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 稀释</td></tr><tr><td>大鼠抗RFP</td><td>Allele Biotechnology</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 稀释</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure 驴抗山羊IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure 山羊抗小鼠IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>Cy3 驴抗大鼠IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>卵水</td><td></td><td></td><td>在蒸馏水中加入0.3 g/L 海盐 &amp;lsquo;Instant Ocean&amp;rsquo; 和 0.5 mM CaSO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;。&lt;br /&gt;
&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&amp;middot;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4。&amp;nbsp; 加蒸馏水至1 L。&amp;nbsp; 调节pH至7。&amp;nbsp; 在121&amp;deg;C下高压灭菌20分钟。</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>在1X PBS中加入0.2% Triton X-100和0.2% DMSO。</td></tr><tr><td>PEM缓冲液</td><td></td><td></td><td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4。&amp;nbsp; 加蒸馏水至1 L。&amp;nbsp; 调节pH至7。</td></tr><tr><td>封闭液</td><td></td><td></td><td>将1 mL热灭活马血清与9 mL 1X PBSDT混合。</td></tr></tbody></table>

斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

肝脏具有强大的再生能力。肝实质细胞（即肝细胞）可通过两种方式之一进行再生：肝细胞驱动型肝再生或胆管驱动型肝再生。在肝细胞驱动型肝再生中，新生肝细胞来源于已有的肝细胞；而在胆管驱动型肝再生中，新生肝细胞则来源于胆管上皮细胞（BECs）。对于肝细胞驱动型肝再生，已有多种优良的啮齿类动物模型，这些模型极大地推动了当前对肝脏再生机制的理解。然而，目前尚无适用于胆管驱动型肝再生的啮齿类动物模型。我们近期报道了一种斑马鱼肝损伤模型，在该模型中，当肝细胞严重丢失时，胆管上皮细胞可大量转化为肝细胞。在此模型中，肝细胞通过药理遗传学手段被特异性消融。本文详细介绍了消融肝细胞以及分析胆管上皮细胞驱动肝再生过程的方法。该肝细胞特异性消融模型可进一步用于揭示胆管驱动型肝再生的分子与细胞机制。此外，这些方法还可应用于化合物筛选，以鉴定能够增强或抑制肝脏再生的小分子化合物。

从3.5至5天龄（dpf）进行36小时（A36h，A代表消融）Mtz处理显著减小了肝脏体积（图1B）。在甲硝唑洗脱后，视为肝再生（R）的开始，出现强烈 fabp10aCFP-NTR 和 fabp10adsRed 表达在 30 小时内重新出现（图1B）。通过检测胆管上皮细胞（BECs）膜上Alcam的表达来评估肝内胆管网络22，最初塌陷，但在洗脱后54小时（R54h）重新建立图1C这些数据表明，在我们的肝损伤模型中，肝脏再生与功能恢复迅速发生。
图2显示再生的肝细胞来源于胆管上皮细胞（BEC）。Tg(Tp1:H2B-mCherry)s939 转基因品系在含有12个RBP-Jĸ结合位点的元件调控下表达核定位的红色荧光蛋白23。该Notch响应元件似乎仅在肝脏的BEC中驱动基因表达24；然而，它也...

为了帮助评估斑马鱼胆管驱动的肝脏再生背后的分子机制，我们建立了一种肝损伤模型，该模型中表达硝基还原酶的肝细胞在甲硝唑处理后被遗传性消融。在本方案中，我们描述了如何熟练地操作、监测和分析肝细胞消融及胆管驱动的肝脏再生过程。

肝脏具有强大的再生能力。肝实质细胞（肝细胞）可通过两种方式之一进行再生：肝细胞自身增殖或……

本实验的总体目标是诱导斑马鱼肝细胞消融，以分析胆管驱动的肝脏再生过程。首先，将肝细胞中表达硝基还原酶的转基因幼鱼暴露于甲硝唑（metronidazole，MTZ）中，以实现肝细胞消融。第二步，根据肝脏相对大小评估肝细胞消融程度。在最后一步经MTZ处理后，收集胆管消融后肝脏微小的幼鱼，随后分别通过落射荧光显微镜和共聚焦显微镜测量肝脏再生过程中的肝脏大小以及肝标志物的表达水平。该技术相较于现有方法（如啮齿类动物卵圆细胞激活模型）的主要优势在于，再生肝细胞主要来源于胆管上皮细胞。该方法有助于回答肝脏再生领域中的关键科学问题，例如胆管细胞或肝前体细胞如何参与肝脏再生。通常，初次接触该技术的研究人员可能会遇到困难，因为幼鱼肝脏在退变过程中的大小存在较大变异性。为了进行定时交配，将成年雄性和雌性半合子或纯合子鱼在隔板两侧过夜配对。次日早晨需要交配时，移除隔板，并使用精细的塑料滤网收集胚胎；将滤网倒置，用洗瓶以细小的蛋水水流冲洗滤网表面。随后将最多100个胚胎转移至含有25毫升蛋水的100毫米培养皿中，并将培养皿置于28°C环境中以抑制色素形成。在受精后80小时，将PTU加入培养物中，持续不超过10小时。个性化处理后，用三卡因麻醉幼虫，并使用落射荧光显微镜收集CFP阳性幼虫，仅保留肝脏大小相似的个体。然后用添加了PTU的新鲜卵水替换三卡卵水，并将CFP阳性的斑马鱼幼鱼放回28°C的培养箱中。若需先用MTZ处理斑马鱼幼鱼，首先将适当数量的幼鱼分成两组，分别置于两个不同的培养容器中。将实验组幼鱼置于 freshly prepared MTZ 溶液中，对照组则置于卵水中。加入DMSO。用铝箔覆盖实验组，以防止MTZ发生光失活，并在消融期结束时将两组斑马鱼幼鱼均在28摄氏度下孵育。从培养板中移除MTZ溶液，用25毫升卵水对经MTZ处理的幼鱼清洗两到三次，每次清洗后轻轻旋转并弃去卵水。最后一次洗涤后，使用先前浓度一半的三卡因固定幼鱼，以避免MTZ处理的幼鱼出现心脏水肿和死亡。然后在落射荧光显微镜下使用CFP滤光片，根据MTZ处理幼鱼的相对肝脏大小评估肝细胞消融水平。若斑马鱼肝脏较大，且占比为幼鱼总数的0%至5%，则视为未消融个体。肝脏中等大小的个体代表有10%至20%的幼鱼肝脏被部分消融，而肝脏非常小的个体代表有80%至90%的幼鱼肝脏被完全消融。在对所有动物进行分类后，剔除肝脏未消融或部分消融的幼鱼，仅保留肝脏极小、表明肝细胞严重消融的斑马鱼用于肝脏分析。在再生零小时时间点，将幼鱼转移至1.5毫升微量离心管中。MTZ 洗脱并提供 CFP 后，立即将卵水替换为 3% 多聚甲醛 MPEM 缓冲液，在 4 摄氏度的旋转器上进行过夜固定。次日早晨，将固定液替换为 1 毫升 P-B-S-D-T，继续旋转孵育幼鱼 5 分钟。随后，在解剖显微镜下将所有固定的幼鱼转移至含有新鲜 P-B-S-D-T 的 100 毫米培养皿中，并使用镊子在所有幼鱼完成剪切后手动去除卵黄和胸鳍。将最多20只动物转移至1.5毫升离心管中，并用1毫升封闭液替换PBSDT。室温下在旋转仪上孵育2小时后，弃去封闭液，加入100 µL一抗混合液，于4°C过夜孵育。次日，在摇床上轻轻振荡，移除一抗溶液，用PBSDT对斑马鱼进行5次洗涤，每次10分钟。最后一次洗涤后，加入100微升二抗，在室温下轻轻摇动孵育2小时。最后，用P-B-S-D-T缓冲液将幼虫洗涤五次，方法如前所述。将幼虫侧向置于显微镜载玻片上，并加入一滴封片介质。然后小心地用盖玻片覆盖每条斑马鱼，并用指甲油密封盖玻片。在受精后3.5至5天期间，使用MTZ处理36小时可显著减小肝脏体积。在洗去MTZ后30小时内，CFP和红色荧光表达明显恢复，这一点通过胆管上皮细胞膜上LCAM的表达得以证实。肝内胆管网络最初发生塌陷，但在洗脱后54小时重新建立，表明肝脏迅速再生并恢复。在这些图像中，显示了表达仅在肝胆管上皮细胞中特异性表达的核红色荧光蛋白的转基因再生肝细胞，再生肝脏中大多数H2B-mCherry阳性细胞在再生0小时即表达HNF4α；在再生48小时，经MTZ处理的CFP阳性肝细胞仍保留其H2B-mCherry表达，表明在严重肝细胞丢失后，胆管上皮细胞转化为肝细胞。在进行该操作时，重要的是要记住，在 MTT 处理后，应选择完全消融的样本，以用于后续裂解后肝再生的研究。该技术为肝脏再生领域的研究人员探索肝前体细胞驱动的肝脏再生机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用这种肝细胞特异性的操作模型开展胆汁驱动的肝退变研究。

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科研

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发育生物学

肝细胞特异性消融在斑马鱼研究胆驱动肝再生

本文介绍了一种在转基因斑马鱼幼鱼中利用甲硝唑诱导肝细胞死亡的靶向性肝脏消融方法。示例实验方案详细描述了在斑马鱼中建立、操作和评估靶向性肝脏消融的过程。...

靶向肝脏消融：利用甲硝唑在转基因斑马鱼幼虫中诱导肝细胞死亡

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。...

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

本方案描述了对经2%乙醇处理24小时的斑马鱼幼鱼肝脏进行的组织学分析。这种急性乙醇处理会导致肝细胞脂肪变性和肝血管系统的肿胀。...

斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

核糖体亲和纯化技术（TRAP）能够快速高效地分离特定细胞类型的翻译中mRNA。在此，我们展示了一种方法，该方法结合了在肝细胞再生小鼠模型中进行的水动力尾静脉注射与TRAP技术，以检测再生肝细胞的基因表达谱。...

小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

本文展示了一种定量分析幼年斑马鱼肝脏大小的方法，可用于评估基因和药物干预对肝脏生长与发育的影响。...

利用明场显微镜定量斑马鱼幼鱼肝脏大小

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成年斑马鱼的部分肝切除术

本文介绍了如何构建与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的肝细胞癌（HCC）斑马鱼模型，以研究胆固醇过量对肝脏微环境及免疫细胞格局的影响。...

斑马鱼非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌早期进展过程中肝脏微环境分析

在此，我们介绍一种通过注射庆大霉素诱导急性肾损伤来研究成年肾脏再生的可靠方法。我们证明了损伤程度依赖于庆大霉素剂量和环境温度 原位 杂交标记 lhx1a+ 形成新的肾单位。...

通过庆大霉素诱导损伤实现成年斑马鱼的肾脏再生

本文概述了利用TetON系统在成年斑马鱼尾鳍再生过程中实现组织特异性基因表达的工作流程。...

利用TetON系统研究斑马鱼再生的分子机制

本方案展示了如何在不损伤周围组织的情况下，稳定地切除涡虫的眼睛（视杯）。使用胰岛素针头和注射器，可选择性地切除单侧或双侧眼睛，以促进对调控眼睛再生的机制、视觉再生的进化以及光诱导行为的神经基础等领域的研究。...

用于研究涡虫眼睛再生的手术消融实验

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斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

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